肝細胞肝癌組織精氨酸酶2和誘導型一氧化氮合酶的表達及與腫瘤血管形成的相關(guān)性

肖 鋒， 顧春燕*， 邵建國， 錢 錚， 陳麗燕， 孫 艷

1. 南通市第三人民醫(yī)院病理科，南通 226006 2. 南通市第三人民醫(yī)院消化內(nèi)科，南通 226006

·短篇論著·

肝細胞肝癌組織精氨酸酶2和誘導型一氧化氮合酶的表達及與腫瘤血管形成的相關(guān)性

肖 鋒1， 顧春燕1*， 邵建國2， 錢 錚1， 陳麗燕1， 孫 艷1

1. 南通市第三人民醫(yī)院病理科，南通 226006 2. 南通市第三人民醫(yī)院消化內(nèi)科，南通 226006

目的探討精氨酸酶2(arginase-2, Arg-2)和誘導型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase, iNOS)在肝細胞肝癌(hepatocellular carcinoma, HCC)中的表達及其與腫瘤血管形成的相關(guān)性。方法采用免疫組化方法檢測158例HCC患者手術(shù)切除標本中Arg-2、iNOS的表達，抗CD34單克隆抗體顯示血管內(nèi)皮細胞。采用Image-Pro plus 6.2.1圖像分析軟件測定腫瘤微血管密度(microvessel density, MVD)。結(jié)果158例HCC中，Arg-2、iNOS的陽性表達率分別為73.4%(116/158)、83.5%(132/158)。Arg-2和iNOS在HCC組織中的表達正相關(guān)(r=0.474，P=0.000)。116例Arg-2陽性HCC組織的MVD為(283.92±130.69)/0.702 mm2，42例Arg-2陰性HCC組織的MVD為(129.25±51.00)/0.702 mm2，差異有統(tǒng)計學意義(P=0.000)；132例iNOS陽性組織的MVD為(267±131.49)/0.702 mm2，26例iNOS陰性HCC組織的MVD為(116±41.85)/0.702 mm2，差異有統(tǒng)計學意義(P=0.000)。結(jié)論Arg-2與iNOS在HCC組織中的表達正相關(guān)，且與MVD相關(guān)，提示Arg-2與iNOS可能參與調(diào)節(jié)HCC中微血管的形成。

精氨酸酶2；誘導型一氧化氮合酶；肝細胞肝癌；微血管密度

精氨酸酶2(arginase-2, Arg-2)與誘導型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase,iNOS)均以精氨酸作為底物，高表達Arg-2能競爭性水解更多精氨酸，間接導致iNOS催化合成一氧化氮(nitric oxide, NO)減少[1]。NO能調(diào)節(jié)腫瘤血管生成，而腫瘤血管形成是腫瘤生長、轉(zhuǎn)移的基礎(chǔ)。Arg-2及iNOS蛋白的異常表達在多種惡性腫瘤中均有報道。本課題組前期研究[2-3]發(fā)現(xiàn)，Arg-2、iNOS在HCC組織中表達明顯升高。但HCC中Arg-2與iNOS異常表達的相關(guān)性尚未明確；雖然iNOS活性的增高與腫瘤血管形成關(guān)系密切[4]，但Arg-2是否與HCC腫瘤血管形成相關(guān)還未明確。因此，本研究探討了Arg-2、iNOS在HCC中表達的相關(guān)性，以及兩者與HCC形成腫瘤新生血管之間的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料 篩選我院2005年1月至2011年12月經(jīng)手術(shù)切除的158例HCC患者。其中，男性133例，女性25例；年齡19～81歲，平均年齡(52.9±10.2)歲。158例患者有詳細的臨床資料，包括血清甲胎蛋白(AFP)水平、乙肝表面抗原(HBsAg)檢測結(jié)果和病理檢查結(jié)果。所有患者術(shù)前均未接受相關(guān)治療，均經(jīng)術(shù)后病理檢查證實為HCC。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會審核批準，患者知情同意并簽署知情同意書。

1.2 主要試劑 兔抗人單克隆Arg-2抗體購自Santa Cruz公司，小鼠抗人單克隆iNOS抗體購自Abcam公司，CD34兔抗人單克隆抗體購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，二抗工作液及免疫組化顯色試劑盒購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.3 免疫組織化學檢測及結(jié)果判定 所有標本經(jīng)4%中性甲醛固定，常規(guī)組織脫水、透明及浸蠟處理，以4 μm厚連續(xù)切片，具體步驟參照試劑盒說明書進行。免疫組化染色結(jié)果由兩位高年資病理科醫(yī)師在雙盲條件下進行評定，實驗均設陽性和陰性對照。染色結(jié)果以陽性細胞染色強度和陽性細胞所占百分比表示。在顯微鏡低倍鏡(×40)下觀察免疫組化染色情況；然后在高倍鏡(×400)下觀察，每例標本挑選5個視野，每高倍視野計數(shù)200個瘤細胞。按陽性細胞所占的百分比分為5個等級：小于5%為0分，5%～25%為1分，25%～50%為2分，50%～75%為3分，>75%為4分；按陽性染色強度分為4個等級：無著色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。將兩組評分先相乘再相加后取平均值，綜合評分分為：0～1分，陰性(-)；2～4分，弱陽性(+)；5～8分，中度陽性()；9～12分，強陽性()4個等級。

1.4 微血管密度(microvessel density, MVD)測定 參考Bernardo等[5]報道的方法，在顯微鏡低倍鏡(×100)下觀察腫瘤結(jié)節(jié)內(nèi)CD34免疫染色情況，選定CD34免疫染色最強的區(qū)域(熱點區(qū))；根據(jù)腫瘤結(jié)節(jié)大小，選取2～5個視野，用Olympus BX-51顯微鏡(安裝顯微鏡攝像頭MD30)在200倍放大視野下采集大小為0.702 mm2的圖像。采用Image-Pro plus 6.2.1軟件分析MVD，以“免疫染色陽性區(qū)域計數(shù)/圖像面積”作為MVD值，每例取平均值。

2 結(jié) 果

2.1 HCC組織中Arg-2和iNOS的表達情況及相關(guān)性 免疫組化染色顯示： Arg-2陽性染色定位于HCC細胞的胞質(zhì)，呈不均勻的顆粒狀，部分病例高表達(圖1A)，部分低表達(圖1B)；iNOS陽性染色亦定位于HCC細胞的胞質(zhì)，呈均勻的片狀分布，部分病例高表達(圖1C)，部分低表達(圖1D)。Spearman秩相關(guān)分析(表1)顯示：Arg-2與iNOS表達正相關(guān)(r=0.474，P=0.000)。

2.2 HCC組織中Arg-2和iNOS的表達與MVD的相關(guān)性 免疫組化染色結(jié)果顯示：微血管位于HCC癌細胞巢之間，呈纖細的分支狀結(jié)構(gòu)，部分病例MVD高(圖1E)，部分病例MVD低(圖1F)。結(jié)果(表2)顯示：Arg-2與iNOS表達陰性組MVD均明顯低于陽性組，差異有統(tǒng)計學意義(P=0.000)。

3 討 論

腫瘤血管形成是腫瘤生長、轉(zhuǎn)移的基礎(chǔ)。HCC血供豐富，故探討HCC中微血管形成機制對進一步研究HCC生長、侵襲以及抗血管生成靶向治療等方面的意義重大。

NO由iNOS催化底物精氨酸降解生成，在腫瘤血管形成中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用；這種調(diào)節(jié)作用與腫瘤組織局部產(chǎn)生NO的濃度大小以及腫瘤細胞自身對NO的敏感性有關(guān)[6]。在HCC等實體腫瘤中，腫瘤細胞、血管內(nèi)皮細胞均能產(chǎn)生內(nèi)源性NO，NO通過擴張腫瘤組織中的血管和促進腫瘤血管形成，進而保證腫瘤血供，維持腫瘤生長[7]。

圖1 免疫組織化學染色結(jié)果

A, B：Arg-2在HCC組織中的表達，高表達(A)、低表達(B)；C, D：iNOS在HCC組織中的表達，高表達(C)、低表達(D)；E, F：CD34在HCC組織中的表達，顯示微血管密度，密度高(E)、密度低(F).Original magnification: ×200

表1 HCC組織中Arg-2與iNOS蛋白表達相關(guān)性

表2 HCC組織中Arg-2、iNOS的表達與MVD的相關(guān)性

*P=0.000與同指標(-)相比

Arg是一種雙核含錳的金屬酶，其催化L-精氨酸水解成L-鳥氨酸和尿素，在生物體的新陳代謝中起重要作用。目前認為Arg存在兩種形式的同工酶：Arg-1型和Arg-2型。兩者大約有60%的氨基酸序列一致，主要區(qū)別在于各自的表達部位、染色體定位以及免疫反應性不同[8]。Arg-1也稱為“肝型Arg”，在肝臟中有較高的生物學活性，能水解L-精氨酸，生成尿素和L-鳥氨酸，即尿素循環(huán)。Arg-1除參與尿素循環(huán)外，還參與催化合成精胺和亞精胺等多種細胞生長必需的代謝分子，影響細胞代謝水平和生長狀態(tài)。Arg-2也稱為“肝外Arg”，廣泛分布于其他組織，如在腎臟、腦、小腸、前列腺、乳腺以及巨噬細胞中表達，不參與尿素循環(huán)，主要調(diào)控細胞內(nèi)精氨酸的濃度，從而調(diào)控生物體內(nèi)NO、脯氨酸、多胺等物質(zhì)的合成[9-10]。

目前，Arg-1已常規(guī)應用于肝癌的臨床診斷及鑒別診斷中[11-12]。而有關(guān)Arg-2與肝癌的研究目前國內(nèi)外相對較少。本研究小組前期的研究[2]發(fā)現(xiàn)，Arg-2在正常肝組織及癌旁肝組織中均不表達，在HCC組織中表達明顯升高，且與HCC組織學分級相關(guān)。

Arg-2與iNOS共用底物精氨酸。作為重要的代謝酶，Arg-2及iNOS蛋白在人類多種惡性腫瘤中均可被檢測到。本研究發(fā)現(xiàn)，Arg-2的表達與iNOS的表達正相關(guān)，表明兩者可能在HCC生物學進程中發(fā)揮協(xié)同作用，且在HCC中協(xié)同性低表達或高表達。在低表達模式下，底物精氨酸水解減少，精氨酸在HCC組織中蓄積，NO生成減少。高濃度的精氨酸可為腫瘤細胞增殖提供營養(yǎng)，促進腫瘤生長，而低濃度NO可調(diào)節(jié)腫瘤血管生成。在高表達模式下，Arg-2和iNOS競爭性作用于底物精氨酸，高表達的Arg-2同時消耗了底物精氨酸，使iNOS催化產(chǎn)生的NO減少，NO濃度降低[1]。由于高濃度NO不僅能對腫瘤細胞產(chǎn)生細胞毒作用，導致細胞凋亡，而且能阻斷腫瘤新生血管的形成，抑制腫瘤細胞的生長[6]，故Arg-2對于iNOS的這種競爭性抑制作用可能對HCC腫瘤細胞起到保護作用。iNOS與腫瘤微血管形成的相關(guān)性已有文獻[4]報道。本研究結(jié)果顯示：Arg-2表達陰性組MVD明顯低于陽性組(P=0.000)，表明Arg-2可能參與調(diào)節(jié)HCC微血管形成等過程。結(jié)果顯示Arg-2可能通過間接調(diào)節(jié)NO濃度影響微血管形成，有待進一步研究。

綜上所述，本研究明確了Arg-2與iNOS在HCC組織中表達的相關(guān)性，且Arg-2表達與MVD相關(guān)。與Arg-1影響肝細胞代謝和生長不同，Arg-2可能參與調(diào)節(jié)HCC中微血管的形成。腫瘤發(fā)生及進展是一個精確調(diào)控的過程，Arg-2與iNOS在HCC中表達對于微血管形成可能起到調(diào)控作用，具體機制仍有待進一步研究。

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Expressions of arginase-2 and inducible nitric oxide synthase in hepatocellular carcinoma and the relations to angiogenesis

XIAO Feng1, GU Chun-yan1*, SHAO Jian-guo2, QIAN Zheng1, CHEN Li-yan1, SUN Yan1

1. Department of Pathology, The Third People’ s Hospital of Nantong, Nantong 226006, Jiangsu, China 2. Department of Gastroenterology, The Third People’ s Hospital of Nantong, Nantong 226006, Jiangsu, China

Objective： To analyze the expressions of arginase-2 (Arg-2) and inducible nitric oxide synthase (iNOS) protein in hepatocellular carcinoma (HCC) and the relations to angiogenesis.MethodsThe expressions of Arg-2 and iNOS in tumor specimens from 158 postoperative patients with HCC were detected by using immunohistochemistry. The endothelial cells were immunostained with anti-CD34 antibody. The microvessel density (MVD) was quantified by Image-Pro plus 6.2.1 image analysis software.ResultsIn 158 HCC patients, the positive rates of Arg-2 and iNOS were 73.4% (116/158) and 83.5% (132/116), respectively. The expressions of Arg-2 and iNOS in HCC were positively correlated (r=0.474,P=0.000). The MVD was (283.92±130.69)/0.702 mm2in 116 HCC specimens with positive expression of Arg-2, and (129.25±51.00)/0.702 mm2in 42 HCC specimens with negative expression of Arg-2, and the difference was statistically significant (P=0.000). The MVD was (267±131.49)/0.702 mm2in 132 HCC specimens with positive expression of iNOS, and (116±41.85)/0.702 mm2in 26 HCC specimens with negative expression of iNOS, and the difference was statistically significant(P=0.000).ConclusionsThe expressions of Arg-2 and iNOS are positively correlated in HCC tissues, which are both related to MVD. These results suggest that Arg-2 and iNOS may be involved in regulating microvascular angiogenesis in HCC.

arginase-2; inducible nitric oxide synthase; hepatocellular carcinoma; microvascular density

2017-06-14接受日期2017-10-18

南通市前沿與關(guān)鍵技術(shù)創(chuàng)新項目(MS22015087)，南通市衛(wèi)計委青年科研基金(WQ2015034，WQ2016016). Supported by Nantong Frontier and Key Technology Innovation Project (MS22015087) and Youth Research Foundation of Nantong Health and Family Planning Commission (WQ2015034, WQ2016016).

肖 鋒，碩士，主治醫(yī)師. E-mail：xfeng_1981@163.com

*通信作者(Corresponding author). Tel: 0513-89093913, E-mail: guchunyan143@aliyun.com

10.12025/j.issn.1008-6358.2017.20170512

R 735.7

A

[本文編輯] 姬靜芳