鈉鈣交換器1對肝細胞肝癌增殖與侵襲的影響

田 慧， 楊畢偉， 趙志英， 黃佩新， 唐文清， 方婷婷， 夏景林,*

1. 復旦大學附屬中山醫(yī)院老年病科，上海 200032 2. 復旦大學附屬中山醫(yī)院肝腫瘤內(nèi)科，上海 200032 3. 復旦大學附屬中山醫(yī)院肝癌研究所，上海 200032

·論著·

鈉鈣交換器1對肝細胞肝癌增殖與侵襲的影響

田 慧1， 楊畢偉2， 趙志英2， 黃佩新2， 唐文清2， 方婷婷3， 夏景林2,3*

1. 復旦大學附屬中山醫(yī)院老年病科，上海 200032 2. 復旦大學附屬中山醫(yī)院肝腫瘤內(nèi)科，上海 200032 3. 復旦大學附屬中山醫(yī)院肝癌研究所，上海 200032

目的探討鈉鈣交換器1(NCX1)在肝細胞肝癌(簡稱肝癌)侵襲和增殖中的作用及分子機制，為肝癌的臨床診治提供新思路。方法采用熒光定量PCR(qRT-PCR)、Western印跡法檢測不同肝癌細胞系中NCX1的表達情況。構(gòu)建NCX1干擾慢病毒載體和過表達慢病毒載體，并轉(zhuǎn)染肝癌細胞。采用細胞遷移、侵襲實驗觀察NCX1對肝癌細胞遷移、侵襲的影響；采用細胞增殖實驗觀察NCX1對肝癌細胞增殖的影響；ELISA、Western印跡法檢測NCX1相關蛋白的表達。結(jié)果高轉(zhuǎn)移潛能肝癌細胞系(MHCC97H、HCCLM3)NCX1表達高于低轉(zhuǎn)移潛能肝癌細胞系(HepG2、Huh7、SMMC-7721)，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。轉(zhuǎn)染NCX1后，肝癌細胞侵襲及增殖能力明顯增加(P<0.05)；細胞因子(TGF-β1、IL-6、TNF-α)分泌明顯增多(P<0.05)；肝癌上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)相關蛋白表達明顯升高(P<0.05)。結(jié)論NCX1體外可能通過升高肝癌細胞EMT相關蛋白表達促進肝癌生長、侵襲及轉(zhuǎn)移，是潛在的肝癌診治靶標。

鈉鈣交換器1；肝細胞肝癌；侵襲；增殖；上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化

肝細胞肝癌(簡稱肝癌)是國人最常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤之一，具有高復發(fā)率和死亡率，嚴重威脅國人健康，是目前臨床醫(yī)學研究的熱點[1-2]。鈣離子廣泛參與調(diào)節(jié)細胞的生物學過程，如信號轉(zhuǎn)導、神經(jīng)遞質(zhì)釋放、肌肉收縮、轉(zhuǎn)錄等[3]。鈉鈣交換器1(Na+/Ca2+-exchanger 1， NCX1)可高效地雙向跨膜移動鈣離子，發(fā)揮調(diào)節(jié)細胞鈣離子濃度的作用[4]，參與鈣離子依賴的一系列細胞生理、生化過程，與乳腺癌、胰腺癌及肝癌的發(fā)生發(fā)展具有潛在的相關性[5-8]，但相關機制并不明確。因此，本研究觀察了NCX1在不同肝癌細胞系的表達差異及其對肝癌細胞侵襲和增殖能力的影響，并初步探討NCX1表達促進肝癌細胞侵襲及轉(zhuǎn)移的可能機制。

1 材料與方法

1.1 主要材料及試劑 人肝癌細胞系SMMC-7721、Huh7、HepG2、MHCC97H、HCCLM3均由復旦大學肝癌研究所提供。40例肝癌及相應癌旁冰凍組織來自復旦大學附屬中山醫(yī)院肝外科根治性手術切除標本。NCX1抗體購自美國Abcam公司，E-cadherin、N-cadherin、Vimentin、TGF-β1、Snail、β-actin抗體均購自美國CTS公司。DMEM高糖培養(yǎng)液、MEM高糖培養(yǎng)液和胎牛血清(FBS)購自美國Hyclone公司。人肝癌細胞系SMMC-7721、Huh7、HepG2、MHCC97H和HCCLM3均在復旦大學肝癌研究所細胞房進行培養(yǎng)。SMMC-7721、Huh7、HepG2、MHCC97H和HCCLM3細胞均用含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基在37℃、5%CO2條件下常規(guī)培養(yǎng)。

1.2 Western印跡檢測NCX1蛋白的表達 提取細胞總蛋白，進行SDS-PAGE電泳后，蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜上，一抗孵育4℃過夜，TBST洗膜，5%脫脂牛奶室溫封閉，TBST洗膜，相應二抗室溫孵育2 h，TBST洗膜后，加入ECL發(fā)光液曝光顯影。實驗重復3次。

1.3 熒光定量qRT-PCR檢測NCX1 mRNA的表達 采用TRIzol試劑提取細胞RNA，并使用Prime ScriptTMRT Master Mix進行RNA反轉(zhuǎn)錄。SYBR Green熒光定量PCR進行PCR實驗。PCR引物序列，NCX1：5′-CGT TCG GAA ATG TTG TTG TG-3′(F)，5′-ATT GCC AAA TGG GAG AAC AG-3′(R)；GAPDH： 5′-TGA CTT CAA CAG CGA CAC CCA-3′(F)，5′-CAC CCT GTT GCT GTA GCC AAA-3′(R)。mRNA表達水平通過采用ΔΔCt方法計算，以GAPDH作為內(nèi)參。實驗重復3次。

1.4 NCX1干擾/過表達慢病毒載體的構(gòu)建及轉(zhuǎn)染 針對NCX1基因的siRNA片段序列為5′-TTC GTC TGC AAT GGT GAT T-3′[8]。根據(jù)siRNA序列，由上海吉凱基因化學技術有限公司構(gòu)建pGC-SIL-GFP-shRNA-NCX1慢病毒載體，對高表達NCX1的肝癌細胞HCCLM3進行慢病毒轉(zhuǎn)染。同時由上海吉凱基因化學技術有限公司設計并構(gòu)建NCX1穩(wěn)定過表達慢病毒載體：pGC-FU-GFP-NCX1，轉(zhuǎn)染相對低表達NCX1的肝癌細胞SMMC-7721。根據(jù)細胞感染復數(shù)(MOI)值，在無血清DMEM培養(yǎng)基中加入適量慢病毒，培養(yǎng)24 h后更換為含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基；病毒感染3 d后觀察慢病毒上報告基因GFP的表達情況，熒光率大于80%后，收集細胞提取總RNA，qRT-PCR法檢測基因表達。提取細胞總蛋白，Western印跡檢測蛋白表達。實驗重復3次。

1.5 CCK-8細胞增殖實驗 細胞常規(guī)培養(yǎng)至對數(shù)生長期，胰酶消化，制成細胞懸液，細胞計數(shù)，以細胞密度3 000/100 μL接種至96孔板中，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。分別在0、24、48、72 h后換液，每孔加入含10% CCK-8試劑的新鮮完全培養(yǎng)液100 μL；置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育2 h；酶標儀測定每孔450 nm光密度(D)值。實驗重復3次。

1.6 Transwell實驗觀察細胞遷移及侵襲能力 采用8.0 μm孔徑的聚碳酸酯膜24孔Transwell小室進行細胞遷移和侵襲實驗。在細胞遷移實驗中，將1×105細胞懸浮于100 μL含有1%FBS的DMEM培養(yǎng)液中，加入上室，在下室加入600 μL含10%FBS的DMEM培養(yǎng)液；置于培養(yǎng)箱中孵育24 h后，除去膜上表面的細胞，將下表面的遷移細胞在4%多聚甲醛中固定，在室溫下用0.1%結(jié)晶紫染色15 min，PBS洗滌并晾干小室；置于倒置顯微鏡下，觀察染色細胞，選取6個視野計數(shù)染色細胞，取平均值。細胞侵襲實驗除了接種細胞前小室的聚碳酸酯膜需包被Matrigel膠外，其他步驟類似細胞遷移實驗。實驗重復3次。

1.7 ELISA實驗測定細胞上清細胞因子的表達 于細胞生長對數(shù)期提取細胞上清液，2 680×g離心10 min，吸取上清液。采用雙抗體夾心ELISA法檢測TGF-β1、IL-6、TNF-α表達水平，步驟參照說明書進行(ELISA試劑盒購自美國Abcam公司)。實驗重復3次。

1.8 NCX1對肝癌細胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)相關蛋白表達的影響 提取HCCLM3-shNCX1、HCCLM3-MOCK、SMMC-7721-NCX1和SMMC-7721-MOCK 細胞總蛋白，通過Western印跡檢測EMT相關蛋白E-cadherin、N-cadherin、Vimentin、TGF-β1、Snail的表達。實驗重復3次。

2 結(jié) 果

2.1 不同肝癌細胞系NCX1的表達 結(jié)果(圖1)表明：NCX1 mRNA及蛋白在人肝癌細胞系SMMC-7721、Huh7、HepG2、MHCC97H和HCCLM3細胞中均有表達。高轉(zhuǎn)移潛能肝癌細胞系MHCC97H、HCCLM3中NCX1 mRNA及蛋白表達高于非轉(zhuǎn)移性肝癌細胞系SMMC-7721、Huh7、HepG2。

圖1 不同肝癌細胞系NCX1 mRNA(A)及蛋白(B)的表達

2.2 肝癌及癌旁正常組織NCX1 mRNA的表達 qRT-PCR檢測結(jié)果(圖2)表明：肝癌及癌旁正常組織中均可檢測到NCX1 mRNA的表達；與癌旁組織相比，肝癌組織NCX1 mRNA表達水平更高(P<0.05)。

圖2 qRT-PCR檢測肝癌及對應的癌旁組織中NCX1 mRNA表達

2.3 肝癌細胞慢病毒轉(zhuǎn)染低/過表達NCX1的表達 qRT-PCR、Western印跡結(jié)果(圖3)表明：NCX1低及過表達均在80%以上(P<0.01)，成功建立HCCLM3-shNCX1穩(wěn)定細胞株和SMMC-7721-NCX1穩(wěn)定細胞株。

圖3 慢病毒轉(zhuǎn)染肝癌細胞后干擾/過表達NCX1基因及蛋白的表達

2.4 NCX1促進肝癌細胞的增殖、侵襲及遷移 結(jié)果(圖4)表明：與HCCLM3-MOCK組相比，HCCLM3-shNCX1組細胞增殖能力明顯減弱(P<0.05)；與SMMC-7721-MOCK組相比，SMMC-7721-NCX1組細胞增殖能力明顯增強(P<0.05)。下調(diào)NCX1表達后，肝癌細胞HCCLM3的侵襲能力和遷移能力明顯下降(P<0.05)；上調(diào)NCX1表達后，肝癌細胞SMMC-7721的侵襲能力和遷移能力明顯增強(P<0.05)。

圖4 NCX1促進肝癌細胞的增殖、侵襲及遷移

2.5 NCX1促進肝癌細胞分泌細胞因子 ELISA實驗結(jié)果(圖5)顯示：HCCLM3-shNCX1細胞上清液中TGF-β1、IL-6、TNF-α含量低于HCCLM3-MOCK細胞上清液，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；SMMC-7721-NCX1細胞上清液中上述細胞因子含量高于SMMC-7721-MOCK細胞上清液，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

圖5 NCX1促進肝癌細胞分泌細胞因子的表達

2.6 NCX1對肝癌細胞EMT相關蛋白表達的影響 結(jié)果(圖6)顯示：HCCLM3-shNCX1細胞中E-cadherin表達高于HCCLM3-MOCK，而N-cadherin、Vimentin、TGF-β1、Snail的表達低于HCCLM3-MOCK，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。SMMC-7721-NCX1細胞E-cadherin的表達低于SMMC-7721-MOCK，而N-cadherin、Vimentin、TGF-β1、Snail的表達高于SMMC-7721-MOCK，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

圖6 NCX1對肝癌細胞EMT相關蛋白表達的影響

3 討 論

HCC患者預后不良的主要原因是延誤診斷、高轉(zhuǎn)移率和高復發(fā)率[9]。因此，治療晚期肝癌的目的是克服肝癌對治療的抵抗性并防止疾病復發(fā)。NCX1對調(diào)節(jié)細胞鈣離子濃度重要而獨特，參與了許多鈣離子依賴的細胞生理、生化過程。目前NCX1與腫瘤的關系日益受到重視。有研究[5]顯示，抑制NCX1活性可促進前列腺癌細胞死亡，從而達到抑制前列腺癌進展的作用。另有研究[6]顯示，NCX1在TGF-β1誘導乳腺癌細胞EMT過程中起到至關重要的作用。Tang等[7]發(fā)現(xiàn)，NCX1/Ca2+/β-catenin信號通路參與胰腺癌的發(fā)生發(fā)展過程。Xu等[8]研究發(fā)現(xiàn)，NCX1參與了IL-6介導的肝癌細胞增殖、侵襲及遷移的促進作用。NCX1還與惡性膠質(zhì)瘤、陰莖癌等惡性腫瘤密切相關[10-11]。

EMT是一個復雜的分子和細胞過程，上皮細胞失去其分化特性并獲得包括運動性、侵入性、逃避免疫細胞和抵抗細胞凋亡等間充質(zhì)細胞的功能[12]。EMT可能是災難性的，因為EMT賦予分化的固著的上皮細胞遷移和侵襲性，從而啟動腫瘤轉(zhuǎn)移[13-14]。已有研究[15-17]顯示，肝癌TGF-β1、IL-6、TNF-α等細胞因子與肝癌EMT相關，并促進肝癌的進展，并且E-cadherin、N-cadherin、Vimentin、TGF-β1和Snail等EMT相關蛋白與肝癌的發(fā)生發(fā)展密切相關。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，NCX1促進肝癌細胞分泌細胞因子TGF-β1、IL-6、TNF-α，并且促進肝癌細胞N-cadherin、Vimentin、TGF-β1和Snail的表達，抑制E-cadherin的表達。結(jié)果提示，NCX1可能是肝癌發(fā)生EMT的誘導因子，在肝癌中EMT的發(fā)生起到重要作用，從而促進肝癌的發(fā)生發(fā)展。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)NCX1可能通過促進肝癌細胞的EMT進程，從而增強肝癌細胞增殖、侵襲和遷移能力，其可能成為肝癌早期診斷和治療的靶標。

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The role and mechanisms of NCX1 on proliferation and invasion of hepatocellular carcinoma

TIAN Hui1, YANG Bi-wei2, ZHAO Zhi-ying2, HUANG Pei-xin2, TANG Wen-qing2, FANG Ting-ting3, XIA Jing-lin2,3*

1. Department of Gerontology, Zhongshan Hospital, Fudan University, Shanghai 200032, China 2. Department of Liver Neoplasms, Zhongshan Hospital, Fudan University, Shanghai 200032, China 3. Liver Cancer Institute, Zhongshan Hospital, Fudan University, Shanghai 200032, China

Objective： To investigate the role and molecular mechanism of Na+/Ca2+exchanger 1 (NCX1) in the invasion and proliferation of hepatocellular carcinoma (HCC), and to provide new therapeutic targets for the clinical diagnosis and treatment of hepatocellular carcinoma.MethodsQuantitative real-time PCR (qRT-PCR) and Western blotting were used to detect NCX1 mRNA and protein expression in different HCC cell lines. Lentiviral vectors pGC-SIL-GFP-shRNA-NCX1 and pGC-FU-GFP-NCX1 were constructed and transfected into hepatoma cells. Cell migration and invasion experiments were used to observe the effect of NCX1 on the migration and invasion of HCC cells; cell proliferation assay was used to observe the effect of NCX1 on the proliferation of hepatoma cells; Western blotting and ELISA were used to detect the expressions of NCX1-related proteins.ResultsThe expression of NCX1 in high metastatic potential HCC cell lines (MHCC97H, HCCLM3) was higher than that of low metastatic potential HCC cell lines (HepG2, Huh7, SMMC-7721), and the difference was statistically significant (P<0.05). After transfection of NCX1, the invasion and proliferation ability of HCC cells increased significantly (P<0.05); the secretion of cytokines (TGF-β1, IL-6 and TNF- α) increased significantly (P<0.05); the expressions of epithelial-mesenchymal transition (EMT) related proteins in HCC cells were significantly increased (P<0.05).ConclusionsNCX1 can promote the growth, invasion and metastasis of hepatocellular carcinoma by increasing the expressions of EMT-related proteins in HCC cells, and it is a potential target for the diagnosis and treatment of liver cancer.

Na+/Ca2+exchanger 1; hepatocellular carcinoma; invasion; proliferation; epithelial-mesenchymal transition

2017-04-08接受日期2017-07-29

國家自然科學基金面上項目(81572395).Supported by National Natural Science Foundation of China(81572395).

田 慧，博士，住院醫(yī)師. E-mail: tianhui_2013@126.com

*通信作者(Corresponding author). Tel: 021-64041990, E-mail: xia.jinglin@zs-hospital.sh.cn

10.12025/j.issn.1008-6358.2017.20170291

R 735.7

A

[本文編輯] 廖曉瑜，賈澤軍