槐定堿抑制人膠質瘤U87MG細胞株增殖及其作用機制研究

王文鑫 陳少偉 廖圣芳 余錦剛 陳漢民

(1解放軍第180醫(yī)院神經外科，福建 泉州 362000; 2解放軍總醫(yī)院神經外科，北京 100853)

槐定堿抑制人膠質瘤U87MG細胞株增殖及其作用機制研究

王文鑫1, 2陳少偉1廖圣芳1余錦剛1陳漢民1*

(1解放軍第180醫(yī)院神經外科，福建 泉州 362000;2解放軍總醫(yī)院神經外科，北京 100853)

目的探討槐定堿抑制人膠質瘤U87惡性膠質瘤(U87MG)細胞株增殖作用及其相關機制。方法將各個濃度的槐定堿加入到人膠質瘤U87MG細胞株中，應用四唑氮鹽比色法測定槐定堿對腫瘤細胞生長的抑制作用，流式細胞儀測定槐定堿對U87MG細胞凋亡和細胞周期的變化，生化檢驗測定腫瘤細胞內活性氧簇(ROS)和谷胱甘肽(GSH)含量，實時熒光定量聚合酶鏈式反應和蛋白免疫印跡法分別檢測腫瘤相關基因mRNA表達和蛋白表達的變化，熒光素酶報告基因法檢測腫瘤細胞中泛素-蛋白酶體、叉頭盒蛋白 M1(FoxM1)、核轉錄因子kappa B(NF-kb)、激活子蛋白-1(AP-1)的活性的變化。結果槐定堿能夠顯著抑制細胞增殖，阻滯細胞周期在G2/M期；誘導細胞凋亡，引起ROS產生和GSH含量減少；促使p27、周期蛋白依賴性激酶2、Survivin、Livin、B淋巴細胞瘤-2、E2啟動子結合細胞因子1等基因表達下調，同時上調半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3/8、p53、線粒體來源的第2個半胱氨酸蛋白酶激活劑、c-Jun氨基末端激酶和p38-絲裂原活化蛋白激酶等基因的表達；顯著抑制泛素-蛋白酶體活性和FoxM1、NF-kb、AP-1的轉錄活性。結論槐定堿可能通過誘導細胞凋亡和ROS積聚，激活線粒體信號通路來發(fā)揮抗腫瘤活性?；倍▔A能夠作為一種新的藥物來治療膠質瘤。

膠質瘤; U87惡性膠質瘤; 細胞凋亡; 槐定堿

槐定堿是一個從豆科槐屬中的苦豆子提起出來的單分子構造的生物堿。使用基于細胞的小分子篩查方法，發(fā)現(xiàn)槐定堿能夠選擇性地殺死腫瘤細胞而不會傷害正常細胞，這歸因于槐定堿增加細胞內活性氧簇(reactive oxygen species, ROS)水平和提高細胞凋亡的作用[1-2]。進一步研究顯示槐定堿通過抑制泛素-蛋白酶體來抑制腫瘤細胞[3]。因此，槐定堿是一種潛在的具有較高實際應用價值的天然抗腫瘤藥物。但目前關于槐定堿作用于腦膠質瘤的研究很少。因此本研究主要研究槐定堿對人類膠質瘤U87惡性膠質瘤(U87 malignant glioma, U87MG)細胞的抑制作用，并且在氧化應激和泛素-蛋白酶體的抑制作用方面進行深入的研究。

材料與方法

一、主要試劑和儀器

人膠質瘤U87MG細胞株(北京中尚博奧生物技術有限公司)；槐定堿(Sigma公司)；細胞培養(yǎng)基(Sigma公司)；四唑氮鹽[3-(4,5-dimethylthiazol-zyl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-tetrazoliuzolium, inner salt, MTS]試劑盒、細胞周期和凋亡檢測試劑盒、應該蛋白酶體底物、ROS檢測試劑盒、單克隆檢測抗體、增強化學發(fā)光免疫印跡底物試劑盒(Abcam公司)；流式細胞儀(BD公司)；酶標儀(Bio-Rad公司)。

二、細胞培養(yǎng)

U87MG細胞株培養(yǎng)于10 cm培養(yǎng)皿中，放在包含5% CO2和飽和濕度的37 ℃保溫箱中。培養(yǎng)基為90% F-12K和10%胎牛血清(fetal bovine serum, FBS)。0.25%的胰蛋白酶-乙二胺四乙酸用來消化和傳代。在所有實驗中使用對數生長期的細胞。

三、MTS比色法檢測槐定堿對腫瘤細胞的抑制作用

對數生長期細胞以3×104～4×104個/mL、100 μL/孔種植在96孔微孔板里，培養(yǎng)過夜使細胞粘附。然后將各個濃度的槐定堿(0、0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、5.0、10.0 mg/mL)加入到相應的孔內持續(xù)培養(yǎng)24 h。當移除培養(yǎng)基后，根據試劑盒說明書加入MTS試劑。最后，使用酶標儀在490 nm波長下測量光密度(optical density, OD)值，用來計算藥物對細胞的抑制率。抑制率=(1-實驗組的OD值/對照組的OD值)×100%。對應的抑制曲線用槐定堿的對數濃度作為橫坐標、抑制率作為縱坐標來繪制。相當于50%抑制率所對應的濃度為半抑制濃度(half maximal inhibitory concentration, IC50)值。

四、流式細胞儀檢測細胞凋亡和細胞周期

對數生長期的腫瘤細胞接種在6孔板持續(xù)培養(yǎng)24 h。磷酸緩沖液(phosphate buffered solution, PBS)或1 mg/mL、2 mg/mL的槐定堿加入到實驗孔連續(xù)培養(yǎng)24 h。獲得胰蛋白酶消化和碘化丙啶/膜聯(lián)蛋白V-異硫氰酸熒光素染色后的細胞。用流式細胞儀檢測凋亡細胞。

五、生化檢驗測定ROS和GSH含量

U87MG種在6孔板，培養(yǎng)過夜使細胞粘附。然后加入0.5 mg/mL、1 mg/mL的槐定堿和作為對照的PBS，連續(xù)培養(yǎng)24 h。用熒光探針2', 7'-二氯熒光黃雙乙酸鹽檢測ROS。此外，為了檢測谷胱甘肽(glutathione, GSH)，用蛋白免疫印跡法(Western Blot)的細胞裂解緩沖液來裂解細胞。所有特殊的實驗遵照試劑盒說明書。

六、RT-PCR檢測腫瘤相關基因mRNA表達的改變

U87MG種在6孔板，培養(yǎng)過夜使細胞粘附。然后加入0.5 mg/mL、1 mg/mL的槐定堿和作為對照的PBS，連續(xù)培養(yǎng)24 h。獲得細胞，提取總的mRNA。用實時熒光定量聚合酶鏈式反應(real time polymerase chain reaction, RT-PCR)法檢測mRNA的表達。用β-actin作為內部參考。

七、Western Blot檢測腫瘤相關的基因蛋白表達的變化

U87MG種在6孔板，培養(yǎng)過夜使細胞粘附。然后加入0.5 mg/mL、1 mg/mL的槐定堿和作為對照的PBS，連續(xù)培養(yǎng)24 h。獲得細胞，提取蛋白。運用BCA分析法測定溶解產物中的蛋白含量。取等量蛋白用12%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳法來分離并轉移到聚偏二氟乙烯膜上，用相應的單克隆抗體[p27、周期蛋白依賴性激酶2(cyclin-dependent kinases2, CDK2)、Survivin、Livin、B淋巴細胞瘤-2(B-cell lymphoma-2, Bcl-2)、E2啟動子結合細胞因子1(E2-promoter binding factor, E2F1)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3/8(cysteinyl aspartate-specific protease-3/8, caspase-3/8)、p53、線粒體來源的第2個半胱氨酸蛋白酶激活劑(second mitochondria derived activator of caspase, Smac)、c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase, c-JNK)和p38-絲裂原活化蛋白激酶(p38-mitogen-activated protein kinase, p38-MAPK)]在室溫下孵化4 h，檢測目標蛋白含量。用β-肌動蛋白(β-actin)作為內部參考。

八、檢測腫瘤細胞中泛素-蛋白酶體、叉頭盒蛋白、核轉錄因子、激活子蛋白-1的活性

對數生長期的腫瘤細胞種在96孔板持續(xù)培養(yǎng)24 h。泛素-G76V-黃色熒光蛋白(ubiquitin-G76V-yellow fluorescent protein, Ub-G76V-YFP)質粒(加入基因)用來檢測細胞內泛素-蛋白酶體活性，叉頭盒蛋白M1(forkhead box M1, FoxM1)、核轉錄因子kappa B(nuclear transcription factor kappa B, NF-κb)、激活子蛋白-1(activator protein 1, AP-1)的熒光素酶質粒用來檢測它們的轉錄活性。每個孔加入5 ng的質粒后，用轉染劑(Life Science)來輔助轉染24 h。洗掉未轉染的質粒，更換新鮮的培養(yǎng)基。接著PBS、0.5 mg/mL和1 mg/mL的槐定堿加入到各自的實驗孔持續(xù)培養(yǎng)24 h。最后用熒光酶標儀檢測每個孔內的黃色熒光蛋白(yellow fluorescent protein, YFP)的熒光強度。

九、統(tǒng)計分析

結 果

一、槐定堿顯著抑制U87MG細胞的生長

槐定堿作用于體外U87MG細胞24 h后，用MTS比色法來評估其抑制作用。實驗結果顯示，槐定堿具有明顯的抑制效果。24 h的平均IC50是5.3 mg/mL(圖1)。

圖1 各個濃度的槐定堿(0、0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、5.0、10.0 mg/mL)對U87MG細胞增殖的抑制作用

Fig 1 The inhibitory effect of sophoridine at different concentrations (0, 0.1, 0.2, 0.5, 1.0, 2.0, 5.0 and 10.0 mg/mL) on U87MG cell proliferation

二、槐定堿顯著增強細胞凋亡和阻滯U87MG細胞在G2/M期

實驗結果顯示， 1 mg/mL和2 mg/mL的槐定堿都能明顯誘導腫瘤細胞凋亡(P<0.01)，1 mg/mL的槐定堿主要引起早期的細胞凋亡，而2 mg/mL的槐定堿更多地誘導晚期細胞凋亡(見圖2A和圖2B)。在0.5 mg/mL和1 mg/mL的槐定堿的作用下，細胞周期顯著改變(P<0.05)，細胞周期被阻滯在G2/M期(圖2C、2D)。

三、槐定堿誘導U87MG細胞里ROS產生，同時引起GSH含量的減少

由于槐定堿一個主要的抗腫瘤作用的機制是誘導細胞產生ROS[2,4]，因此本研究評估了槐定堿是否能夠增加細胞內ROS水平。結果顯示，相比PBS，0.5 mg/mL、1 mg/mL的槐定堿顯著增加U87MG細胞內ROS水平(P<0.05)，且1 mg/mL的槐定堿增加更明顯；進一步的研究顯示，0.5 mg/mL、1 mg/mL的槐定堿使能夠清除ROS的GSH的濃度下降(P<0.05)，1 mg/mL的槐定堿下降更明顯，這進一步放大了ROS的作用。

四、槐定堿調節(jié)U87MG細胞內的腫瘤相關基因表達

為了進一步研究槐定堿誘導細胞凋亡和細胞周期阻滯的機制，我們檢測了相關基因的變化。結果顯示，槐定堿在蛋白水平和mRNA水平顯著下調了p27、CDK2、Survivin、 Livin、Bcl-2和E2F1等基因的表達，同時上調了caspase-3/8、p53、Smac、c-JNK和p38-MAPK等基因的表達(圖3A、B)。研究也發(fā)現(xiàn)了槐定堿下調了FoxM1、NF-κb和AP-1的轉錄水平，這些是關鍵的腫瘤相關的信號通路的轉錄因子(圖3C)。

五、槐定堿抑制U87MG細胞內泛素-蛋白酶體活性

因為Ub-G76V-YFP在正常環(huán)境下被細胞內泛素-蛋白酶體持續(xù)分解，沒有或者只有很微弱的YFP蛋白的熒光能夠被檢測到。但如果泛素-蛋白酶體被抑制，導致細胞內Ub-G76V-YFP積聚，細胞內的YFP熒光將得到增強。實驗結果顯示槐定堿治療組熒光強度比對照組顯著提高，暗示著槐定堿明顯抑制腫瘤細胞內泛素-蛋白酶體(圖4)。

圖2 槐定堿誘導U87MG細胞凋亡和細胞周期阻滯

Fig 2 Sophoridine induced cell-cycle arrest and apoptosis in U87MG cells

A: 1 mg/mL and 2 mg/mL sophoridine exposure in U87MG cells assessed by Annexin V-fluorescein isothiocyanate and propidium iodide (PI) double staining and fluorescence-activated cell sorter analysis; B: The percentage of apoptotic cells in U87MG cells; C: Cells were treated with 0.5 mg/mL and 1 mg/mL sophoridine for 24 h. PI staining was used to analyze the cell cycle distribution; D: Cell cycle distribution of U87MG cells.

aP<0.01,vscontrol group.

圖3 槐定堿調節(jié)U87MG細胞內腫瘤相關基因表達

Fig 3 Sophoridine regulated tumor-related gene expression in U87MG cells

A: Immunoblotting assay was used to measure the expression of tumor-related gene in protein level; B: Real-time PCR assay was used to measure the expression of tumor-related gene in mRNA level; C: Report gene assay for the transcriptional activity of FoxM1, NF-κb and AP-1.

aP<0.01,vscontrol group;bP<0.05,vscontrol group.

圖4 槐定堿抑制U87MG細胞內泛素-蛋白酶體活性

Fig 4 Sophoridine inhibited ubiquitin-proteasome activity in U87MG cells

aP<0.01, control group;bP<0.05,vscontrol group.

討 論

槐定堿是從中草藥中獲得的天然產物，具有廣泛的藥理作用，近年來發(fā)現(xiàn)具有抗腫瘤作用，能誘導體內和體外各種腫瘤細胞凋亡及壞死[5-7]。在本實驗中，我們研究槐定堿對人膠質瘤U87MG細胞是否具有抑制作用及其作用機制。

我們用MTS比色法檢測槐定堿是否能夠抑制U87MG細胞增殖，測量到IC50為5.3 mg/mL，這和文獻報道的槐定堿對其它腫瘤的抑制強度相似[8-9]。在隨后的實驗中為了闡明槐定堿介導的抑制腫瘤生長的模式，我們檢測腫瘤細胞的凋亡和細胞周期分布。結果顯示較高濃度(1、2 mg/mL)的槐定堿顯著增強細胞凋亡，而較低濃度(0.5、1 mg/mL)的槐定堿阻滯腫瘤細胞周期在G2/M期。用Western Blot來進一步研究槐定堿介導的腫瘤抑制的分子機制。我們發(fā)現(xiàn)，在線粒體相關的凋亡通路中的抗凋亡蛋白，如Survivin、Livin、Bcl-2和E2F1，明顯下調，而caspase-3/8、p53、Smac則明顯上調。這提示線粒體通路在槐定堿介導的細胞凋亡中起到重要的作用。此外，Western Blot檢測也提示了腫瘤細胞內的p27和CDK-2在槐定堿治療后顯著下降。在腫瘤細胞進入到有絲分裂后，p27和CDK-2是關鍵的調節(jié)蛋白，這提示槐定堿通過下調p27和CDK-2，阻滯腫瘤細胞在G2/M期。這些結果與槐定堿治療前列腺腫瘤的機制一致[10]。

目前認為槐定堿一個主要的抗腫瘤的作用機制是誘導腫瘤細胞產生能夠殺死腫瘤細胞核誘導腫瘤細胞凋亡的ROS。在本研究中，我們也發(fā)現(xiàn)在治療后的U87MG細胞中，ROS水平明顯增加，清除ROS的GSH水平明顯下降，這進一步放大ROS在腫瘤細胞中的作用。而且，槐定堿也能夠下調Bcl-2和survivin的表達來促進腫瘤細胞凋亡[4]。在一些關鍵信號通路中關于關鍵蛋白和重要轉錄因子的研究中，我們發(fā)現(xiàn)槐定堿上調c-JNK和p38-MAPK信號通路的活性，這兩個通路活性的提高能夠抑制細胞周期，從而抑制腫瘤細胞生長[11]。實際上，JNK和p38信號通路能夠發(fā)揮更廣泛的作用。一些報道顯示，槐定堿能夠通過激活腦膠質瘤細胞里的JNK和p38上調細胞內活性自由基，下調FoxM1、NF-κb和AP-1的轉錄活性，從而殺死腫瘤細胞。

泛素-蛋白酶體在控制多種細胞內蛋白的含量、活性和位置中起到關鍵的作用[12]。在大多數腫瘤細胞中能夠觀察到，泛素-蛋白酶體被不正常地激活，導致一些腫瘤抑制基因如p53的快速降解和失活。因此靶向的泛素-蛋白酶體是一個潛在的抗腫瘤治療[13]。一種已經研發(fā)出來的這種蛋白酶體的抑制劑硼替佐米，已經成功地應用于淋巴瘤和骨髓瘤的治療中。目前已經發(fā)現(xiàn)天然產物包括槐定堿，能夠在腫瘤細胞中抑制泛素-蛋白酶體[14]，這就提供了一個闡明槐定堿抗腫瘤作用機制的新觀點。同樣地，本研究也顯示槐定堿顯著抑制膠質瘤細胞U87MG中的泛素-蛋白酶體活性。我們的結果也提示泛素-蛋白酶體的抑制伴隨著ROS的升高。因此，泛素-蛋白酶體活性的抑制是槐定堿誘導的腫瘤細胞中的ROS升高原因的的更深的分子機制水平。

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SophoridineinhibitsproliferationofhumangliomaU87MGcelllineanditsmechanism

WANGWenxin1, 2,CHENShaowei1,LIAOShengfang1,YUJingang1,CHENHanmin1

1DepartmentofNeurosurgery,The180thHospitalofPLA,Quanzhou362000;2DepartmentofNeurosurgery,GeneralHospitalofPLA,Beijing100853, China

ObjectiveThe effect and mechanism of sophoridine on proliferation inhibition in human U87 malignant glioma (U87MG) cell line were investigated.MethodsSophoridine at different concentrations were added into human neuroglioma U87 line cells. 3-(4,5-dimethylthiazol-zyl)-5-(3- carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-tetrazoliuzolium, inner salt assay was employed to detect the inhibitory effect of sophoridine in tumor cells, flow cytometry to detect apoptosis and cell cycle, and biochemical assay to determinate intracellular reactive oxygen species (ROS) and glutathione (GSH) contents, real time-polymerase chain reaction to detect the changes in tumor-related gene mRNA expression, Western Blot to detect the changes in tumor-related gene protein expression, and luciferase report gene assay to detect the activity of ubiquitin-proteasome, forkhead box M1 (FoxM1), nuclear transcription factor kappa B (NF-κb) and activator protein 1 (AP-1) in tumor cells.ResultsSophoridine significantly inhibited the cell proliferation, G2/M phase arrest, induced cell apoptosis and caused ROS generation and GSH content reduction. Sophoridine also triggered significantly the down-regulating of the expression of p27, cyclin-dependent kinases2, Survivin, Livin, B-cell lymphoma-2, E2-promoter binding factor and the transcriptional activity of FoxM1, NF-κb and AP-1, meanwhile, up-regulating of the expression of cysteinyl aspartate-specific protease-3/8, p53, second mitochondria derived activator of caspase, c-Jun N-terminal kinase and p38-mitogen-activated protein kinase. Sophoridine significantly inhibited the activity of ubiquitin-proteasome in tumor cells.ConclusionSophoridine shows obvious anti-cancer activity on glioma cells by inducing cell apoptosis, ROS accumulation, and activating mitochondrial signal pathways. Sophoridine can be used as a new drug for the treatment of glioma.

Glioma; U87MG; Cell apoptosis; Sophoridine

1671-2897(2017)16-207-05

王文鑫，主治醫(yī)師，博士，E-mail: wangwx_2012@163.com

*通訊作者： 陳漢民，主任醫(yī)師，E-mail: qz180chm@sina.com

R 742.1

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2016-09-01；

2016-12-20)