小鼠皮層神經(jīng)元機械損傷后miR-124的動態(tài)變化及意義

蘇鑫洪 葉玉勤 楊永祥 賀曉生

(第四軍醫(yī)大學西京醫(yī)院神經(jīng)外科，陜西 西安 710032)

小鼠皮層神經(jīng)元機械損傷后miR-124的動態(tài)變化及意義

蘇鑫洪 葉玉勤 楊永祥 賀曉生*

(第四軍醫(yī)大學西京醫(yī)院神經(jīng)外科，陜西 西安 710032)

目的觀察體外培養(yǎng)小鼠皮層神經(jīng)元機械損傷后微小核糖核酸-124 (miR-124)的表達變化，初步探討miR-124對小鼠創(chuàng)傷性腦損傷后神經(jīng)軸突再生與修復可能的影響。方法孕15～18 d C57BL/6種孕鼠胚胎腦皮質(zhì)層神經(jīng)元體外培養(yǎng)7 d，以10 μL移液器塑料滴頭在培養(yǎng)皿內(nèi)劃割，造成機械性損傷，傷后不同時間點(1 h, 6 h, 12 h, 24 h, 72 h, 144 h)分別采用實時定量聚合酶鏈法(RT-PCR)檢測miR-124和蛋白質(zhì)印記法(Western Blot)檢測神經(jīng)纖毛蛋白(Nrp-1)、微管相關蛋白(Tau)、生長相關蛋白43(Gap-43)的表達水平。然后用miR-124模擬物和抑制劑分別對體外培養(yǎng)的皮層神經(jīng)元進行干預，觀察miR-124表達量的改變對實驗的影響。結果神經(jīng)元機械損傷后miR-124和Nrp-1、Tau、Gap-43的表達均顯著升高(P<0.05)，且存在一定的正相關性。用miR-124模擬物和抑制劑分別顯著升高和降低miR-124的表達后，Nrp-1、Tau、Gap-43表達顯著下降，其中抑制劑組下降較模擬物組明顯(P<0.05)。結論創(chuàng)傷區(qū)miR-124的適度高表達可能與軸突再生有密切聯(lián)系，這為本課題組今后嘗試梯度調(diào)控miR-124以調(diào)節(jié)神經(jīng)軸突再生與修復提供了實驗依據(jù)。

機械損傷; 微小核糖核酸-124; 軸突再生修復

創(chuàng)傷性腦損傷(traumatic brain injury, TBI)后大量神經(jīng)元細胞變性壞死會導致嚴重的神經(jīng)功能缺失[1]，促進損傷的神經(jīng)元再生和軸突致靶，恢復受損神經(jīng)功能是神經(jīng)科學研究的熱點問題。近年來，隨著一類非編碼小RNA的發(fā)現(xiàn)和研究，為促進中樞神經(jīng)再生修復提供了新思路。微小核糖核酸(microRNA, miRNA)是一些5'端帶磷酸基團、3'端帶羥基，長度在20～25個核苷酸的單鏈核糖核酸分子。它本身不編碼蛋白質(zhì)表達，但可通過轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)靶蛋白的表達。其中，微小核糖核酸124(microRNA-124, miR-124)是神經(jīng)系統(tǒng)特異性的microRNA，占哺乳動物大腦皮質(zhì)總microRNA的25%～48%[2]。它可通過5'端的種子序列和3'端非編碼區(qū)發(fā)生完全或不完全的配對結合而發(fā)揮影響蛋白質(zhì)的功能和合成的作用，從而達到對各生理功能的調(diào)節(jié)和控制[3]。但TBI后腦內(nèi)的miR-124時空變化特征及其對神經(jīng)軸突再生與修復有何影響，至今尚無定論。并且，由于動物個體差異和干擾因素較多，在體模型也有造模不穩(wěn)定的缺陷，體外模型則具有很好的重復性、實驗條件可控性強等顯著優(yōu)點。為此，本研究利用小鼠體外皮層神經(jīng)元機械損傷模型，通過實時定量聚合酶鏈反應(real-time polymerase chain reaction, RT-PCR)和蛋白印記(Western Blot)等方法，檢測損傷后不同時間點miR-124和神經(jīng)纖毛蛋白(neuropilin-1, Nrp-1)、微管相關蛋白(microtubule-associated protein tau, Tau)、生長相關蛋白43(growth associated protein-43, Gap-43)的表達及變化特征，以期探討TBI后miR-124表達量的變化與軸突再生的關系，初步研究miR-124對軸突再生與修復的調(diào)控作用。

材料與方法

一、材料

兔抗小鼠Nrp-1單克隆抗體，兔抗小鼠Gap-43單克隆抗體和兔抗小鼠Tau單克隆抗體購自英國Abcam公司，抗β-actin兔多克隆抗體和辣根過氧化物酶標記山羊抗兔二抗購自中國萬類生物科技，二喹啉甲酸蛋白定量試劑盒(BCA Protein Assay Kit)購自中國碧云天生物技術研究所，Trizol和miR-124模擬物、miR-124抑制劑、miR-124陰性對照購自上海生工生物工程有限公司，microRNA定量組合試劑盒購自大連寶生物工程有限公司，胎牛血清和杜爾貝科改良伊戈爾培養(yǎng)基(Dulbecco's modified Eagle's medium, DMEM)購自美國GIBCO公司，脂質(zhì)體RNA轉(zhuǎn)染劑購自美國Invitrogen公司，15～18 d C57BL/6種孕鼠(由第四軍醫(yī)大學實驗動物中心提供)。

二、小鼠腦皮層神經(jīng)元原代培養(yǎng)

脫頸法處死孕鼠, 體表用75%乙醇消毒。無菌狀態(tài)下快速取出胎鼠置于冰盒上，解剖顯微鏡下剝離胎鼠大腦皮層，置于平衡鹽溶液中，仔細剝?nèi)ツX膜及血管組織，棄去液體后，用平衡鹽溶液再漂洗l次，用眼科剪將腦皮質(zhì)組織塊剪碎，然后用巴斯德管吹打成勻漿液。1000 r/min離心5 min，棄上清。加入胰酶消化液，于37 ℃，50 mL/L CO2孵箱中消化20 min。通過40 μm細胞濾膜去除未消化組織。1000 r/min離心5 min，棄上清。加入含200 mL/L胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液, 室溫下終止消化10 min，DMEM培養(yǎng)液漂洗l次，用吸管在含200 mL/L胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中將消化后的組織塊吹打成細胞懸液，顯微鏡下計數(shù)，以5×105個細胞/孔將細胞懸液接種于6孔培養(yǎng)板。置于37 ℃ 、50 mL/L CO2孵箱，培養(yǎng)5～7 d，每隔2～3 d半量換液1次。

三、機械損傷模型建立

在6孔細胞培養(yǎng)皿內(nèi)以10 μL移液器塑料滴頭于培養(yǎng)皿內(nèi)劃割培養(yǎng)的神經(jīng)元，橫豎各9道，造成神經(jīng)元機械損傷。

四、皮層神經(jīng)元轉(zhuǎn)染

在體外培養(yǎng)7 d后，皮層神經(jīng)元細胞可用于轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染根據(jù)脂質(zhì)體RNA轉(zhuǎn)染試劑盒的說明書進行。根據(jù)預實驗，miR-124模擬物和轉(zhuǎn)染劑的比例為5 ∶3。miR-124模擬物(2.5 μL)和轉(zhuǎn)染劑(1.5 μL)融入基礎培養(yǎng)基(neurobasal-A)中使轉(zhuǎn)染液總體積為500 μL，室溫下孵育20 min。將轉(zhuǎn)染液分別加入相應的分組神經(jīng)元的培養(yǎng)皿中，轉(zhuǎn)染6 h。轉(zhuǎn)染6 h后，將轉(zhuǎn)染液更換為neurobasal-A，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后備用。miR-124抑制劑和陰性對照以相同方法進行處理，備用。

五、實驗分組

在體外培養(yǎng)7 d后，細胞被隨機分為5組：對照組、機械損傷組、機械損傷+ miR-124抑制劑組(inh-124)、機械損傷+miR-124模擬物組(mimic-124)和機械損傷+miR-124陰性對照組(NC-124)。其中，TBI組分為六個亞組，分別為：1 h、6 h、 12 h、24 h、72 h和144 h (n=3)。根據(jù)上述實驗分組在實驗后的觀察結果，選取創(chuàng)傷后24 h這一時間點進行inh-124、mimic-124和NC-124組的觀測。

六、實時定量聚合酶鏈反應法(RT-PCR)檢測各組miR-124表達量變化

按Trizol說明書提取皮層神經(jīng)元組織中的總RNA。按SYBR Green Master Mix Kit說明書操作，實時定量PCR儀擴增。以U6為內(nèi)參照，用2-△△ct方法計算實驗組與對照組miR-124的表達差異。miR-124及U6引物由生工生物工程(上海) 股份有限公司合成，miR-124及U6引物序列為：miR-124上游：5'- TA AGGCACGCGGTGAATG-3'，下游:5'-GTGCAGGGTC CGAGGT-3'，U6上游：5'-TGGCCCCTGCGCAAGGATG-3'，下游：5'- AACGCTTCACGAATTTGCGT-3'。PCR反應條件為：95 ℃預變性5 min；95 ℃變性20 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，40個循環(huán)；最后72 ℃延伸7 min。

七、Western Blot檢測Nrp-1、Tau、Gap-43表達量的變化

取相應皮層神經(jīng)元組織，加入動物細胞蛋白裂解液1 mL，冰上充分勻漿；12 000 r/min，離心20 min，收集上清液；BCA法蛋白定量；聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白；結束后將蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上；麗春紅染膜后按蛋白分子量裁剪硝酸纖維素膜；20 mL含5%脫脂奶粉的洗膜緩沖液(tris buffered saline tween, TBST)室溫封閉1 h；Nrp-1(1 ∶4000)、Tau(1 ∶10 000)、Gap-43(1 ∶15 000)與β-actin (1 ∶3000)抗體4 ℃ 孵育過夜；TBST洗10 min×3次后再與辣根過氧化物酶標記的二抗(1 ∶15 000)室溫孵育1 h；TBST洗10 min×3次后用增強型化學發(fā)光試劑顯色，暗室曝光、顯影和定影。用Image J圖像分析系統(tǒng)測定條帶的灰度值，選擇β-actin作為內(nèi)參照，以相應蛋白條帶灰度值/β-actin條帶灰度值的結果表示各蛋白表達水平。

八、統(tǒng)計學方法

結 果

一、機械損傷后miR-124 表達水平變化

實驗組損傷后各時間點的miR-124表達均高于對照組(P<0.05)，創(chuàng)傷后1 h、6 h、12 h、24 h、72 h和144 h其相對表達水平分別為對照組的(1.53±0.22) 倍、(2.57±0.31) 倍、(4.19±0.29) 倍、(3.88±0.18) 倍、(2.98±0.17) 倍、(1.87±0.39) 倍，且于損傷后12 h表達量最高，之后呈下降趨勢，到144 h其表達水平仍高于對照組(P<0.05)，如圖1所示。

二、機械損傷后Nrp-1、Tau、Gap-43表達水平變化

實驗組Nrp-1表達量于1 h開始上升，24 h達高峰后逐漸下降，總體表達水平均高于對照組(P<0.05)。實驗組Tau在損傷后表達量持續(xù)上升，到72 h時表達量最高，之后下降，總體表達水平均高于對照組(P<0.05)。實驗組Gap-43在創(chuàng)傷后6 h表達才開始升高，在6 h、12 h、24 h時高表達(P<0.05)，之后表達下降，在144 h時表達量與對照組無顯著差異(P>0.05)，如圖2所示。

圖1 實時PCR法檢測在不同時間點miR-124的相對表達量與正常對照組比較

Fig 1 The relative expression of miR-124 at different time points comparing to the sham group detected by RT-PCR

aP<0.05,vssham group.

圖2 Western Blot法檢測在不同時間點Nrp-1、Tau、Gap-43的相對表達量與正常對照組比較

Fig 2 The relative expressions of Nrp-1, Tau and Gap-43 at different time points comparing to the sham group detected by Western Blot

A: Western Blot for Nrp-1，Tau，Gap-43; B: Statistical representation for the expression of Nrp-1; C: Statistical representation for the expression of Tau; D: Statistical representation for the expression of Gap-43.

aP<0.05,vssham group;bP>0.05,vssham group.

三、轉(zhuǎn)染后miR-124的表達對Nrp-1、Tau、Gap-43的影響

我們選取創(chuàng)傷后24 h這一時間點進行對比，因為在上述實驗中，此時的miR-124、Nrp-1、Tau和Gap-43的相對表達量改變均較顯著。轉(zhuǎn)染miR-124 mimic和inhibitor后， miR-124的相對表達量與對照組有顯著差異，分別為6.88±0.78和0.35±0.06(P<0.05)。而miR-124 negative control組與對照組無顯著差異(P>0.05)，如圖3所示。在相同時間點，Nrp-1、Tau和Gap-43的相對表達量均顯著降低，且miR-124 inhibitor組降低較miR-124 mimic顯著(P<0.05)，如圖4所示。

圖3 RT-PCR法檢測機械損傷后24 h時各組miR-124的相對表達量

Fig 3 The relative expressions of miR-124 of all groups at 24 h after mechanical injury detected by RT-PCR

aP<0.05,vssham group;bP>0.05,vssham group.

圖4 Western Blot法檢測創(chuàng)傷后24 h時各組的Nrp-1、Tau、Gap-43的表達量變化

Fig 4 The relative expressions of Nrp-1, Tau and Gap-43 of all groups at 24 h after mechanical injury detected by Western Blot

A: Western Blot for Nrp-1, Tau and Gap-43 of all groups at 24 h after mechanical injury; B: Statistical representation for the expression of Nrp-1; C: Statistical representation for the expression of Tau; D: Statistical representation for the expression of Gap-43.

aP<0.05,vssham group;bP>0.05,vssham group;cP<0.05,vsinh-124 group.

討 論

TBI致死率和致殘率極高，是神經(jīng)外科最常見的嚴重疾患，其診斷、治療和預后判斷都是難點。雖然在中樞神經(jīng)損傷后，由于多重附加因素針對再生的阻礙作用和環(huán)境對于固有再生能力的對抗作用，導致軸突再生困難，但目前研究[4]已肯定小鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)具有一定的可塑性。在生理和病理刺激情況下，“休眠”狀態(tài)的神經(jīng)干細胞激活，進入增殖分化階段，并遷入特定區(qū)域，替代并修復受損的神經(jīng)元，在一定程度改善神經(jīng)功能缺損[5]。然而只有再生軸突的定向生長及其與靶組織的正確連接才是神經(jīng)功能修復的關鍵。目前我們認為，只有促進更多的神經(jīng)干細胞分化為神經(jīng)細胞，神經(jīng)細胞產(chǎn)生足夠多的軸突，才更有利于研究如何對其進行正確引導而致靶。

近年來，microRNA對神經(jīng)元的再生和軸突修復的機制研究是熱點。Cheng等[6]發(fā)現(xiàn)敲除內(nèi)源性miR-124可以使室管膜下區(qū)(subventricular zone, SVZ)的神經(jīng)干細胞一直處于分裂前體狀態(tài)，而過表達miR-124則導致SVZ神經(jīng)干細胞和間充質(zhì)干細胞向神經(jīng)元分化[7-8]。此項研究雖然成功通過上調(diào)miR-124促進了神經(jīng)元的分化，但在軸突的功能恢復上未見報道。另有研究表明[9]，在神經(jīng)發(fā)育過程中，如果miR-124基因缺失，會使小鼠大腦體積變小、軸突生長缺陷、甚至神經(jīng)細胞死亡等重大發(fā)育表型變化。本研究選擇了三種蛋白通過Western Blot法檢測其相對表達量的變化：Nrp-1(Neuropilion-1)是軸突生長受體蛋白，可以決定軸突的命運，研究證實[10-11]，Sema3A(Semaphorin的家族成員)是一種抑制性軸突導向因子。在中樞損傷部位及周圍組織中，Sema3A和Nrp-1過表達，會導致軸突生長錐坍塌和軸突過早停止生長，阻礙著新的軸突網(wǎng)絡建立。Tau蛋白是含量最高的微管相關蛋白，它集中表達于神經(jīng)元軸突。正常腦中Tau蛋白的細胞功能是與微管蛋白結合促進其聚合形成微管；與形成的微管結合，維持微管穩(wěn)定性，降低微管蛋白分子的解離，并誘導微管成束[12]，可以作為神經(jīng)元軸突生長的標記蛋白。GAP-43是一種軸突膜蛋白，為神經(jīng)特異性的蛋白質(zhì)，參與神經(jīng)細胞分化和突觸發(fā)育形成[13]。它能調(diào)解軸突延伸，改變細胞形態(tài)，作為細胞內(nèi)信號，可大大增強與G蛋白偶聯(lián)的受體轉(zhuǎn)運作用。

本研究在C57BL/6小鼠皮層神經(jīng)元體外培養(yǎng)機械損傷模型[14]的基礎上，觀察到傷后1 h，miR-124表達開始增多，12 h即達最高峰，24 h、72 h、144 h逐漸減少，但仍高于對照組。通過Western Blot法檢測我們觀察到在創(chuàng)傷后Nrp-1、Tau和Gap-43的表達較對照組均顯著升高(P<0.05)，miR-124的變化與之呈正相關。證明了在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，神經(jīng)元損傷后的軸突再生和修復可能與miR-124存在密切的關系。我們選取miR-124和Nrp-1、Tau、Gap-43均顯著表達的創(chuàng)傷后24 h作為觀察的時間點，將實驗組分為mimic-124 mimic、inh-124和NC-124三個亞組，通過轉(zhuǎn)染技術對此時間點的miR-124表達進行干預。通過上述實驗結果可以推測，過表達或抑制miR-124表達，都不利于軸突的再生修復。其中，相比于過表達miR-124，在抑制miR-124表達后，軸突的修復受到的阻礙更明顯。所以，只有適量的miR-124高表達，才更有利于損傷后的軸突修復。而這個濃度梯度目前還不清楚，有待研究的進一步深入探討。基于Nrp-1和Tau在軸突的再生修復過程中的重要作用和GAP-43在神經(jīng)再生[15]和軸突修復中扮演著十分重要的角色，結合本研究我們可以初步推測：在神經(jīng)元機械損傷后的病理狀態(tài)下，大量miR-124被表達并可能參與神經(jīng)元分化[6,16]和軸突的再生與修復。適度的miR-124高表達對軸突的生長尤為重要。

綜上所述，本實驗在體外神經(jīng)元損傷模型中證實了適當?shù)膍iR-124高表達可能與軸突再生有密切聯(lián)系。但是，就目前小鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)自發(fā)進行的軸突修復，能否正確的發(fā)出生長錐并與靶細胞產(chǎn)生有功能的連接，還有待實驗驗證。正確引導軸突生長和致靶才是恢復機體功能的關鍵，這是今后研究的一個目標?？傊?，miR-124的這種時間和空間特異性表達，為我們深入研究TBI后神經(jīng)元軸突再生的機制提供了新思路。

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DynamicchangeandsignificanceofmiR-124invitroaftermechanicaldamageofcorticalneuronsinmice

SUXinhong,YEYuqin,YANGYongxiang,HEXiaosheng

DepartmentofNeurosurgery,XijingHospital,FourthMilitaryMedicalUniversity,Xi'an710032, China

ObjectiveThe changes of microRNA-124 (miR-124) in vitro after mechanical damage of cortical neurons, and the influence of miR-124 on axon regeneration and repair after traumatic brain injury in mice were explored.MethodsPrimary cortical neurons were obtained from fetal C57BL/6 mice and cultivated for 7 d. Petri dishes were manually scratched with a 10 μL plastic stylet needle following a 9×9 square grim. Cells were collected at 1 h, 6 h, 12 h, 24 h, 72 h and 144 h after injury for experiments. The real-time polymerase chain reaction (RT-PCR) and Western Blot were used to test the relative expressions of miR-124 and Neuropilin-1 (Nrp-1), microtubule-associated protein tau (Tau), growth associated protein 43 (Gap-43), respectively. Then miR-124 mimic and inhibitor were used to intervene the cortex neuron in vitro to observe how the change of miR-124 expression quantity affected the experiment.ResultsMiR-124, Nrp-1, Tau and Gap-43 were significantly increased after mechanical damage of cortical neurons (P<0.05) and there was a positive correlation between them. The miR-124 mimic and inhibitor were significantly increased and decreased the expression of miR-124 respectively and then caused a significant reduction in the expressions of Nrp-1, Tau, Gap-43 and the decrease in inhibitor group was more significant than that of mimic group (P<0.05).ConclusionModerate high expression of miR-124 may be closely related to the axon regeneration. The result provides the experimental basis for regulating the expression of miR-124 gradually to regulate neural axon regeneration and restoration.

Mechanical damage; MiR-124; Axon regeneration and repair

1671-2897(2017)16-229-05

國家自然科學基金資助項目(81471264)

蘇鑫洪，碩士研究生，E-mail: xhsu1987@sina.com

*通訊作者： 賀曉生，教授、主任醫(yī)師，博士生導師，E-mail: hexiaos@fmmu.edu.cn

R 651

A

2016-09-18；

2017-01-07)