G群輪狀病毒鴿群分離株的全基因分析

王楷宬，王素春，莊青葉，邱 源，侯廣宇

（中國動物衛(wèi)生與流行病學中心，山東青島 266032）

G群輪狀病毒鴿群分離株的全基因分析

王楷宬，王素春，莊青葉，邱 源，侯廣宇

（中國動物衛(wèi)生與流行病學中心，山東青島 266032）

為分析鴿輪狀病毒中國分離株的特性，采用高通量測序方法，測定從山東省青島市某活禽交易市場采集的肉鴿糞便樣品中分離的輪狀病毒基因組，并對其進行特性分析與比較基因組研究。結果顯示，G群輪狀病毒鴿群分離株全基因包含11個節(jié)段，總長度為17 803 bp，具有與其他輪狀病毒相似的結構和基因順序。與24株輪狀病毒代表性毒株的VP6氨基酸序列進化分析結果，以及其他5個結構蛋白氨基酸序列遺傳進化分析結果均證實，該病毒屬G群輪狀病毒。該毒株與2011年從香港鴿群中分離的G群輪狀病毒同源性最高，但衣殼糖蛋白VP7的氨基酸序列同源性僅為71.7%，抗原性存在較大差異。

鴿；輪狀病毒；基因組；高通量測序

輪狀病毒（Rotavirus）是動物腹瀉病的重要病原之一，1969年首先在腹瀉的犢牛糞便中被發(fā)現，此后在人、綿羊、豬、馬、犬、貓、兔、鼠、猴和禽中均有發(fā)現，因病毒粒子的電鏡觀察形態(tài)與車輪相似而得名。該病毒顆粒直徑為70 nm，由3層構成。完整的病毒顆粒表面光滑，稱光滑型顆粒。外殼自然脫落或經化學處理脫落后，變成直徑50 nm的粗糙型顆粒。粗糙型顆粒進一步降解后，輻條脫落而留下約37 nm的病毒核心結構。核心結構呈六角形[1]。輪狀病毒基因組為分節(jié)段的雙鏈RNA，含11個片段，分別編碼病毒蛋白VP1-4、VP6、VP7和非結構蛋白NSP1-5。根據中和試驗，該病毒分為A、B、C、D、E、F、G和H群。

禽腹瀉是嚴重影響禽存活率與生產力的一種常見疾病，對養(yǎng)禽業(yè)危害較嚴重。研究證實禽類因腹瀉而死亡的數量占總死亡數的50%～70%以上。輪狀病毒、腺病毒、皰疹病毒、細小病毒、類細小病毒和副粘病毒，以及大腸桿菌等均可引起禽類腹瀉。其中，禽輪狀病毒是引起禽類病毒性腹瀉的最重要病原之一，臨床上引起禽類拉稀、消瘦、生長發(fā)育受阻等[2]。至今輪狀病毒A群[3]、D群[4]、G群[5]和F群[6]均能感染禽類。1981年Vindevogel[3]從鴿子糞便中檢測到A群輪狀病毒。之后又有研究者從鴿子中分離到輪狀病毒，并對其特性進行研究[7-9]。2013年Tung等[10]從鴿群中首次檢測到G群輪狀病毒，并解析其基因組。2017年Pauly等[11]從尼日利亞的鴿群中分離到D群輪狀病毒。

我國對禽群輪狀病毒的研究主要針對雞群的感染狀況和病原特性。馬洪超等[12]于1989年首次在我國雞群中分離到A群輪狀病毒。之后，有研究人員對雞輪狀病毒的特性等進行研究[13]。但是我國對其他禽類感染的輪狀病毒研究極少，也未見鴿群中檢測到輪狀病毒的報道。為了解我國感染鴿群的輪狀病毒特性，本研究采用高通量測序方法，對首次在我國肉鴿中分離的一株輪狀病毒進行測序，分析該病毒的基因組特性。

1 材料和方法

1.1 材料和儀器

Ion PGM Template OT2 400 Kit、Ion PGM Sequencing 400 Kit V2、E-Gel SizeSelect 2%Agarose、Ion 316 Chip Kit V2、Dynabeads MyOne Streptavidin C1 Beads、Qubit核酸濃度測定儀及配套試劑均購自Life technologies公司；超凈工作臺（美國Forma Scientific）；移液器（Eppendorf）；孵化器（德州誠信孵化設備有限公司）；高速臺式離心機（德國Heraeus Biofuge primoR）；PCR擴增儀（Perkin Elmeter Gen Amp PCR System 9600）。高性能計算平臺為Dell T630塔式服務器，具有2顆Intel（R）Xeon（R）CPU E5-2620 v3 @2.40GHz，內存264 G，存儲23 T，操作系統版本CentOS Linux release 7.1.1503（Core）。

1.2 核酸提取

2014年秋季自山東省青島市某活禽交易市場采集的肉鴿糞便樣品中檢測到鴿輪狀病毒（pigeon/China/10/2014）[14]；將該份樣品充分混勻后，經高速離心和過濾，去除大分子物質和細菌，使用QIAamp Viral RNA Mini Kit（Qiagen，德國）提取病毒核酸。

1.3 高通量測序（NGS）文庫構建

對提取的病毒核酸，采用中國動物衛(wèi)生與流行病學中心報道的方法[14]進行NGS文庫構建。具體 方 法：8 μL 病 毒 RNA 中 加 入 1 μL 100 μmol/L的引物A15N6和2 μL無核酸酶的水進行混合，72 ℃ 5 min；然后將RNA引物混合物放在冰上孵育至少3 min；在混合物中加入4 μL 5×first-strand buffer、1 μL dNTP（100 μmol/L）、2 μL DTT（0.1 mol/L）、1 μL RNaseOUT ? Recombinant Ribonuclease Inhibitor（40 U/μL） 和 1 μL SuperScript? III Reverse Transcriptase（200 U/μL）（Invitrogen，USA），25 ℃反應 15 min，42 ℃反應 30 min，70 ℃ 15 min，終止反應；反應產物中再加入1 μL RNase H（TaKaRa，Japan），37 ℃ 反應20 min；采用DynaMag?-2 Magnet 和Agencourt? AMPure? XP Reagent（Beckman Coulter，USA）純化合成第一鏈cDNA；在純化的第一鏈cDNA中加入引物B15N6，70 ℃ 5 min；再加入 1 μL Klenow fragment（5 U）（NEB，USA）、5 μL 10×NEBuffer 2、2 μL dNTP（100 μmol/L） 和1 μL DTT（0.1 mol/L），37 ℃反應 30 min；最后采用 1×Phusion High-Fidelity Buffer，10 μmol/L 引 物A30 和B30（表1），0.5 U Phusion High-Fidelity DNA Polymerase（NEB，USA），進行PCR擴增。將PCR產物采用E-Gel? SizeSelect? Agarose Gel進行電泳；將篩選和回收的約450 bp擴增產物作為NGS文庫。

表1 引物與引物序列

1.4 NGS測序

將NGS文庫稀釋為26p mol/L，應用Ion PGM Template OT2 400 Kit對DNA文庫進行測序前的樣品處理。處理后的樣品加樣至Ion 316 芯片，置于PGM測序儀進行測序。

1.5 測序數據分析

NGS測序數據經質控后，采用CLC genomics workbench 8.5.1（Qiagen，Germany）， 將 測 序得到的reads參考GenBank中已發(fā)表的鴿輪狀病毒Pigeon/HK18全基因序列[10]（GenBank登錄號：NC_019712）進行mapping 拼接，并分析拼接完成的基因組中的ORF，注釋后的序列提交GenBank。

1.6 基因組特性分析

已報道的文獻[15]和病毒分類委員會第九次分類報告中均以VP6氨基酸的相似性來確定輪狀病毒的分群，若相似性大于60%則判為同一個群。本文采用MEGA 6.0[16]將Pigeon/China/10/2014的VP6氨基酸序列分別與GenBank中輪狀病毒科的代表毒株（表2）的VP6氨基酸序列進行比對和分析，分析該毒株的分類地位。代表毒株中包含雞、火雞、鴿子、人、鼠、牛、羊、豬、兔、馬、犬、貓、獼猴和駱馬等動物的輪狀病毒分離株。同時，將所有禽類感染的已報道全基因的毒株與部分群的人源毒株的基因進行下載（參與VP6分析的毒株只有部分報道了全基因），應用MEGA 6.0[16]分別與Pigeon/China/10/2014其余5個結構蛋白（VP1-4和VP7）的氨基酸序列進行比對和分析。將此毒株的所有節(jié)段氨基酸序列與已報到的所有3株鴿源輪狀病毒進行同源性分析。

表2 基因比較分析所使用的輪狀病毒毒株

2 結果與分析

2.1 基因組解析

芯片上樣率為73%；測序文庫得到質量較高的序列數據測序數據。CLC genomics workbench 8.5.1拼接得到鴿輪狀病毒所有的11個節(jié)段，總長度為17 803 bp；GenBank登錄號分別為MF768259～MF768269。Pigeon/China/10/2014 基 因組各基因節(jié)段詳細信息見表3。

表3 Pigeon/China/10/2014基因組各基因節(jié)段的詳細信息

2.2 基因組比較分析

VP6氨基酸序列分析顯示，該毒株屬于G群輪狀病毒（圖1），且各結構蛋白氨基酸遺傳進化關系（圖2、圖3、圖4、圖5、圖6）基本一致，均與2011年自香港分離的鴿源輪狀病毒同源性最高。本研究分離的Pigeon/China/10/2014屬G群輪狀病毒，與Pigeon/HK18同源性最高，各基因氨基酸同源性為71.7%～99.0%；而與鴿群分離的A群輪狀病毒PO-13同源性較低，11個基因氨基酸序列同源性均低于25%（表3）。

3 討論與結論

輪狀病毒可感染多種宿主。感染禽類宿主的報道主要集中于雞，其次是火雞和鴿。文中對所有已報道全基因的禽源輪狀病毒進行基因進化分析，綜合已發(fā)表的文獻[11]發(fā)現，雞可感染A、D、F、G群輪狀病毒，鴨、鵝、火雞和鵪鶉可感染A群輪狀病毒，鴿子能感染A、D和G群輪狀病毒。本研究之前共有12株鴿源輪狀病毒被報道，分別為日本分離的A群輪狀病毒、香港分離的G群輪狀病毒、尼日利亞分離的9株A群和1株D群輪狀病毒（未公布基因序列）。我國未見其他從鴿群中分離到輪狀病毒的報道。

圖1 輪狀病毒VP6氨基酸序列進化分析

圖2 輪狀病毒VP1氨基酸序列進化分析

圖3 輪狀病毒VP2氨基酸序列進化分析

圖4 輪狀病毒VP3氨基酸序列進化分析

圖5 輪狀病毒VP4氨基酸序列進化分析

圖6 輪狀病毒VP7氨基酸序列進化分析

本研究采用高通量測序方法對一株鴿群分離的輪狀病毒全基因進行測序和分析，通過VP6的氨基酸序列進化樹和同源性分析，確定該病毒為G群輪狀病毒。對此毒株其余結構蛋白進行分析，也證實該病毒應屬G群。輪狀病毒基因組分為11個節(jié)段，其中結構蛋白VP1具有依賴RNA的RNA聚合酶作用，VP2構成病毒的核心衣殼，VP3作為病毒RNA的加帽酶發(fā)揮作用。另外非結構蛋白主要參與病毒的復制（NSP2-NSP3）與形態(tài)發(fā)生（NSP4-NSP5），與宿主蛋白相互作用，共同影響發(fā)病機理及免疫反應（NSP1）。VP7和VP4是病毒主要的交叉中和抗原，自然感染時能夠刺激機體產生中和抗體，并且在 RV 的感染過程中，VP7和VP4能夠相互作用，在病毒進入宿主細胞過程中發(fā)揮重要作用[17]。

從該病毒與輪狀病毒屬其他毒株的遺傳進化關系來看，本研究測序的毒株與2011年香港分離的鴿源輪狀病毒最近，除VP7基因外，其余10個基因的氨基酸序列同源性均達到90%以上。VP7基因編碼輪狀病毒的衣殼糖蛋白。該蛋白存在于輪狀病毒表面，是病毒中和抗體的主要結合位點。這說明此次分離的病毒雖與2011年香港分離的鴿源輪狀病毒同屬G群，但其抗原性存在較大差異。香港分離的G群輪狀病毒來源于野鴿，而青島市分離的此株G群輪狀病毒分離自活禽市場售賣的肉鴿。VP7的差異是否與宿主不同有關，還有待進一步研究部。

綜上所述，本文報道了世界上第2株分離自鴿子的G群輪狀病毒全基因，同時對禽源的各群輪狀病毒進行進化分析。研究結果有利于了解我國鴿輪狀病毒特性，進一步明確其與其他輪狀病毒的進化關系。

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Genome Analysis of the Pigeon Rotavirus Group G Isolated in China

Wang Kaicheng，Wang Suchun，Zhuang Qingye，Qiu Yuan，Hou Guangyu

（China Animal Health and Epidemiology Center，Qingdao，Shandong 266032，China）

To analyze the characterization of the pigeon rotavirus isolated in China，the genome of the pigeon rotavirus isolated from a meat pigeon in a living poultry market of Qingdao City，Shandong Province was sequenced by highthroughput sequencing. The genome of the isolate was analyzed and compared with other rotaviruses. The results showed that 11 genes were included in the genome with a total length of 17 803 bp，of which the genomic organization，structure and gene order were similar to other rotavirus. It was showed that the isolate was rotavirus group G through evolution analysis of VP6 amino acid sequence of 24 rotavirus representative strains and analysis of genetic evolution of other 5 structural protein amino acid sequences. The identity of the isolate and the group G rotavirus from Hongkong's pigeon in 2011 was the highest，while the identity of the capsid glycoprotein VP7 amino acid sequence between the two viruses was only 71.7%. The antigenicity of the two viruses was different.

pigeon；Rotavirus；genome；high-throughput sequencing

國家重點研發(fā)計劃項目（2017YFC1200500）；中國動物衛(wèi)生與流行病學中心創(chuàng)新基金（2015IF-0004FF）

S851.3

A

1005-944X（2018）01-0085-06

10.3969/j.issn.1005-944X.2018.01.024

朱迪國）