精神分裂癥患者的UHPLC-Q-TOF MS尿液代謝組學(xué)研究

鄭慧斐 王文強(qiáng) 賴國(guó)銀 劉發(fā)榮 章家新 徐志忠 何玨

精神分裂癥患者的UHPLC-Q-TOF MS尿液代謝組學(xué)研究

鄭慧斐1王文強(qiáng)1賴國(guó)銀2劉發(fā)榮1章家新1徐志忠1何玨1

目的 利用超高效液相色譜-四級(jí)桿-飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜（UHPLC-Q-TOF MS）對(duì)精神分裂癥患者和健康對(duì)照人群的尿液進(jìn)行代謝組學(xué)研究，尋找精神分裂癥患者尿液中的差異代謝物，為精神分裂癥患者代謝綜合征的早期篩查提供科學(xué)依據(jù)。方法 尿液樣品經(jīng)稀釋過濾后進(jìn)樣分析，利用主成分分析方法分析所采集的數(shù)據(jù)。結(jié)果 根據(jù)譜庫共篩選了7個(gè)表征標(biāo)記物，并進(jìn)行了結(jié)構(gòu)鑒定。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，精神分裂癥患者較對(duì)照組尿液代謝表型有顯著差異，主成分分析得分散點(diǎn)圖中對(duì)照組與精神分裂癥患者組分類良好。結(jié)論 精神分裂癥患者糖、脂、氨基酸等代謝通路均發(fā)生紊亂，可能在代謝綜合征發(fā)生發(fā)展中有重要作用。

精神分裂癥；代謝組學(xué)；超高效液相色譜；飛行時(shí)間質(zhì)譜

代謝綜合征（Metabolic Syndrome，MS），與心血管病緊密相關(guān)，是一種涉及多種代謝異常的疾病，主要表現(xiàn)為患者體重增加（腹型肥胖）、胰島素抵抗、糖代謝調(diào)節(jié)異常、高血壓和脂代謝異常，MS患者心腦血管疾病的患病風(fēng)險(xiǎn)顯著高于普通人群。作為我國(guó)重點(diǎn)防治重性精神疾病之一的精神分裂癥，其患者合并MS的風(fēng)險(xiǎn)顯著高于普通人群，按照美國(guó)國(guó)家膽固醇教育計(jì)劃成人治療組第三次指南（NCEP-ATP III）的標(biāo)準(zhǔn)，精神分裂癥患者M(jìn)S患病率是普通人群的4倍多，合并MS已成為精神分裂癥預(yù)后不良的重要原因[1-2]。代謝組學(xué)是利用對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組的代謝組（metabolome，某一生物的所有代謝物組分）進(jìn)行比較，以尋找代謝譜差異的研究方法。超高效液相色譜-四級(jí)桿-飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜（UHPLC-Q-TOF MS）是一種先進(jìn)的分離分析技術(shù)，具有高分辨率、高靈敏度，和高精確性等優(yōu)點(diǎn)，尤其對(duì)于非靶標(biāo)代謝組學(xué)分析，是目前公認(rèn)最好的復(fù)雜樣品分析技術(shù)之一[3]。同時(shí)，基于LC-Q-TOF MS采集的數(shù)據(jù)，可結(jié)合統(tǒng)計(jì)分析軟件MPP進(jìn)行主成分分析和患者模型的建立。

本研究利用超高效液相色譜-四級(jí)桿-飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜（UHPLC-Q-TOF MS）檢測(cè)精神分裂癥患者（經(jīng)廈門市仙岳醫(yī)院副高級(jí)以上的精神科醫(yī)生根據(jù)ICD-10精神分裂癥診斷標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行診斷）尿液中代謝物成分的變化，通過主成分分析篩查潛在的生物學(xué)標(biāo)記物，研究精神分裂癥患者合并MS的發(fā)生發(fā)展機(jī)制，為MS的早期篩查及早期臨床診治提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 儀器與試劑

Agilent 6540 UHD高分辨飛行時(shí)間質(zhì)譜儀（美國(guó)Agilent公司），配備Mass Hunter Data Acquisition實(shí)時(shí)采集工作站和鞘流雙電噴霧離子源（dual Jet Stream ESI）；Agilent 1290系列超高效液相色譜儀（美國(guó)Agilent公司），配備自動(dòng)進(jìn)樣裝置、在線脫氣系統(tǒng)、柱溫箱、四元泵；Mass profiler professional；5804 R型高速離心機(jī)（德國(guó)Eppendorf公司）。乙酸銨（分析純）；乙腈，甲酸（HPLC級(jí)，德國(guó)Merk試劑公司）。實(shí)驗(yàn)用超純水使用MILLI-Q系統(tǒng)獲得。

1.2 樣本來源

精神分裂癥患者組尿樣30例和健康對(duì)照組尿樣30例來源于福建省廈門市仙岳醫(yī)院（采集于2016年11月—2017年5月）。研究通過廈門市仙岳醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有患者均簽署過知情同意書?；颊呓?jīng)廈門市仙岳醫(yī)院副高級(jí)以上的精神科醫(yī)生根據(jù)ICD-10精神分裂癥診斷標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行診斷確診為精神分裂癥?；颊呓M和健康對(duì)照組人群都在清晨留取中段尿，尿樣標(biāo)本經(jīng)過尿常規(guī)檢測(cè)，排除了血尿、菌尿和膽紅素尿等異常尿樣。尿樣采集后以3 000 r/min離心10 min，以去除尿液雜質(zhì)，吸取上清樣本存入-80℃冰箱備用。

1.3 樣品處理

尿液上清樣本用四倍稀釋法，從-80℃冰箱取出標(biāo)本后0℃下溶解，離心（12 000 r/min，4℃，5 min），取100 μl上清液，加超純水稀釋至400 μl，經(jīng)過渦旋處理，用0.45 μm濾膜過濾樣品，所得待測(cè)樣品供UHPLC-Q-TOF MS分析。為了檢驗(yàn)系統(tǒng)的穩(wěn)定性，避免系統(tǒng)誤差，每分析5個(gè)實(shí)驗(yàn)樣本后，用質(zhì)控樣本（quality control）分析一次，QC樣本是分別隨機(jī)從10個(gè)精神分裂癥患者和10個(gè)健康對(duì)照的尿液樣本中取等量樣本混合后所得。

1.4 UHPLC-Q-TOF MS代謝組學(xué)分析條件

1.4.1 色譜條件 色譜柱：Agilent Zorbax SB-C18（100 mm×2.1 mm，3.5μm）；流動(dòng)相A：超純水（含0.1%甲酸+5 mmol/L乙酸銨）；流動(dòng)相B：乙腈。梯度洗脫：0～5 min，30%B；5～8 min，30%～80%B；8～12 min，80%～85% B；12～15 min，85% ～ 95%B；15～ 20 min，95%B；20～ 21 min，95% ～ 100%B；21～ 22 min，100% ～ 10%B；22～ 25 min，10%B。流速0.4 ml/min；柱溫35℃；進(jìn)樣量2 μl。

1.4.2 質(zhì)譜條件 應(yīng)用鞘流雙電噴霧離子源在正離子掃描方式下采集數(shù)據(jù)，參比離子m/z為121.050 9和922.009 8，離子掃描范圍m/z 100～1 100。毛細(xì)管電壓3 500 V，碎裂電壓110 V，霧化氣壓力241 kpa，干燥氣為高純N2，干燥氣溫度300℃，干燥氣流速11 L/min，鞘氣溫度300 ℃，鞘氣流速9 L/min。二級(jí)質(zhì)譜參數(shù)中碰撞能量設(shè)定為10～40 eV。樣品測(cè)試前，需用調(diào)諧液進(jìn)行質(zhì)量軸校準(zhǔn)。

1.5 數(shù)據(jù)處理

液相-質(zhì)譜聯(lián)用數(shù)據(jù)由Mass Hunter Acquisition（Agilent公司）采集，采集數(shù)據(jù)導(dǎo)入Mass Hunter定性分析軟件，將結(jié)果轉(zhuǎn)化成CEF格式文件，其中包含化合物的保留時(shí)間和質(zhì)荷比信息。將CEF文件導(dǎo)入Mass Profiler Professional （MPP，Agilent Technologies，USA）軟件，進(jìn)行濾噪、歸一化后，多變量數(shù)據(jù)進(jìn)行主成分分析（Principal component analysis，PCA），將多維的數(shù)據(jù)壓縮成四維主成分（PCs）來描述數(shù)據(jù)內(nèi)部的特征。分析PCA載荷圖（Loading plot），發(fā)現(xiàn)可作為生物標(biāo)記物的化合物，予以鑒定。然后根據(jù)偏最小二乘判別分析（Partial least square discriminant analysis，PLSDA）法建立相關(guān)的預(yù)測(cè)模型。

2 結(jié)果

2.1 質(zhì)控（QC）樣本UHPLC-Q-TOF MS總離子流圖

尿液樣本進(jìn)行檢測(cè)分析時(shí)每分析5個(gè)實(shí)驗(yàn)樣本，用QC樣本分析一次，通過對(duì)所有QC樣本UHPLC-Q-TOF MS總離子流圖進(jìn)行疊加，可見QC樣本的重現(xiàn)性良好，檢測(cè)系統(tǒng)穩(wěn)定。

2.2 精神分裂癥患者和正常人尿液UHPLC-Q-TOF MS總離子流圖

患者組及對(duì)照組尿液樣品經(jīng)UHPLC-Q-TOF MS在正離子模式下進(jìn)行檢測(cè)分析。圖1中曲線1為精神分裂癥患者組尿液混合液（隨機(jī)選取10個(gè)患者尿液標(biāo)本各吸等量），曲線2為健康對(duì)照組尿液混合液（隨機(jī)選取10個(gè)健康對(duì)照尿液標(biāo)本各吸等量）進(jìn)樣的總離子流圖（Total ion current，TIC），在正離子模式下，二組色譜峰存在明顯的差別，推測(cè)兩組的尿液代謝成分中存在濃度差異物質(zhì)（關(guān)于圖1的詳細(xì)解讀，見www.chsmzz.com）。

圖1 尿液混合液UHPLC-Q-TOF MS總離子流圖

圖2 樣本的PCA得分圖

2.3 數(shù)據(jù)分析

2.3.1 特征化合物的篩選 在Mass Hunter 軟件的分子特征識(shí)別模式下，共提取到653個(gè)化合物，通過Filter by Flag排除僅在一個(gè)樣本中出現(xiàn)的化合物，而不存在于其他樣本中，這些化合物沒有普遍性，不適用于統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。剩下的328個(gè)化合物以出現(xiàn)頻率（frequency）為70%，變異系數(shù)（coefficient of variation，CV）小于30.0%，豐度（abundance）信號(hào)強(qiáng)度值為10 000.0～18 925 010.0進(jìn)行過濾篩選，共得到167個(gè)化合物。

2.3.2 主成分分析（PCA） 以篩選后的167個(gè)化合物為基礎(chǔ)，采用主成分分析考察精神分裂癥患者和健康人群尿液代謝物變化，圖2顯示樣本的PCA得分圖，共得到4個(gè)主成分，PC1、PC2、PC3、和PC4的貢獻(xiàn)率分別為45.06%、7.95%、6.6%和4.73%，累計(jì)貢獻(xiàn)率為64.34%。PCA圖中每一個(gè)點(diǎn)表示一個(gè)對(duì)應(yīng)樣本，經(jīng)過對(duì)圖中的精神分裂癥患者組尿液樣本、健康對(duì)照組尿液樣本，質(zhì)控樣本進(jìn)行分析可知，患者組基本聚在一起，與對(duì)照組之間的分離明顯。每個(gè)樣本所處位置由自身的代謝決定，相同病理生理狀態(tài)下的樣本通常具有相似代謝物，所以在得分圖上也處于相似位置，彼此間距離越遠(yuǎn)，表明其病理生理狀態(tài)相差越大（關(guān)于圖2的詳細(xì)解讀，見www.chsmzz.com）。

2.3.3 偏最小二乘判別分析（PLS-DA） 前面的非監(jiān)督PCA統(tǒng)計(jì)中，可觀察到兩組有明顯分離趨勢(shì)。使用有監(jiān)督式方法PLSDA進(jìn)行建模分析，以進(jìn)一步尋找差異物質(zhì)，分析顯示精神分裂癥患者組和健康對(duì)照組的樣本可完全區(qū)分，所建立的模型穩(wěn)定，預(yù)測(cè)率也很高，代表模型預(yù)測(cè)率Q2＝0.96，具有較好的預(yù)測(cè)能力。

2.3.4 潛在標(biāo)志物鑒定 表1是根據(jù)精確分子量、串聯(lián)質(zhì)譜結(jié)果以及與數(shù)據(jù)庫比對(duì)，進(jìn)行的生物標(biāo)記物鑒定，譜庫篩選了7個(gè)表征標(biāo)記物，從而提示精神分裂癥患者的糖、脂、氨基酸等代謝通路均發(fā)生了紊亂，可能在MS的發(fā)生發(fā)展中有重要的作用[4]。

3 討論

尿液中葡萄糖、丙氨酸含量顯著異常，提示腎小管對(duì)低分子量化合物重吸收的異常，是腎臟損傷的重要標(biāo)志[5-6]。馬尿酸及馬尿酸前體物質(zhì)由腸道菌群代謝產(chǎn)生，腸道環(huán)境的改變導(dǎo)致兩組馬尿酸差異[7]。吡咯啉羧酸（Pyrroline hydroxycarboxylic acid）在羥脯氨酸氧化酶作用下，可氧化生成谷氨酸和吡咯啉烷羥基羧酸[8]。因此，吡咯啉羧酸的異常提示精神分裂癥組脯氨酸代謝通路異常。而脯氨酸由谷氨酸合成，是蛋白膠原的主要成分，而膠原作為動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的主要成分，在冠心病的不穩(wěn)定性和發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用。二氫神經(jīng)鞘氨醇是神經(jīng)酰胺的重要合成前體，而神經(jīng)酰胺參與血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，可能通過內(nèi)皮細(xì)胞損傷影響機(jī)體的血壓狀態(tài)[9]。因此，二氫神經(jīng)鞘氨醇的異常提示精神分裂癥組患者的血壓異常可能與二氫神經(jīng)鞘氨醇的磷脂代謝相關(guān)，與MS的發(fā)病緊密相關(guān)。

代謝組學(xué)可通過質(zhì)譜、核磁共振等技術(shù)，對(duì)代謝物質(zhì)的代謝途徑以及這些物質(zhì)產(chǎn)生代謝變化的規(guī)律采集數(shù)據(jù)，讓數(shù)據(jù)表達(dá)成代謝指紋圖譜，再利用化學(xué)計(jì)量學(xué)方法對(duì)信息深入提取與挖掘。代謝組學(xué)的研究對(duì)象為生物體液，例如血液、尿液、唾液、膽汁等。人類代謝組學(xué)研究通過檢測(cè)人體內(nèi)代謝物成分的變化來顯示人體在疾病或藥物的作用下代謝網(wǎng)絡(luò)之變化規(guī)律[10]。本文即為應(yīng)用UPLC-Q-TOF MS技術(shù)的代謝組學(xué)方法，并結(jié)合多元統(tǒng)計(jì)分析精神分裂癥患者和健康對(duì)照組的尿液代謝譜圖變化情況的研究。結(jié)果表明，精神分裂癥患者的尿液代謝譜與正常對(duì)照組有顯著差異。通過譜庫篩選，對(duì)可能的代謝差異物進(jìn)行鑒定，發(fā)現(xiàn)了多種標(biāo)記物。從代謝物組學(xué)的角度分析精神分裂癥患者合并MS的發(fā)生和發(fā)展機(jī)制，為MS早期篩查及早期臨床診治提供依據(jù)。同時(shí)，本研究為小樣本量的初步研究，后續(xù)研究需增加樣本例數(shù)，評(píng)估精神分裂癥患者的疾病分期和臨床癥狀，探討精神分裂癥患者代謝差異物與所服用的精神科藥物相關(guān)性，并且從精神分裂癥患者首診開始跟蹤代謝物的差異和變化，以更好地為臨床治療提供支持和依據(jù)。

表1 基于UHPLC-Q-TOF MS的尿液代謝差異物

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Study on Urine Metabonomics of Schizophrenia Patients by UHPLC-Q-TOF MS

ZHENG Huifei1 WANG Wenqiang1 LAI Guoyin2 LIU Farong1 ZHANG Jiaxin1 XU Zhizhong1 HE Jue1 1 Laboratory of Mental Health, Xiamen Xianyue Hospital, Xiamen Fujian 361012, China; 2 Laboratory of Food Chemistry, Technical Center of Xiamen Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau, Xiamen Fujian 361026, China

Objective An ultra-performance liquid chromatography quadrupole time of flight mass spectrometric (UHPLC-Q-TOF MS)method is developed for the study on metabolic variations of urine from schizophrenia patients and healthy volunteers.And the study will provide a scienti fi c basic for early screening of schizophrenia comorbied with metabolic syndrome. Methods The urine samples would analyze after they were diluted and fi ltered, then principal component analysis method was used on the collected data.Results A total of 7 characterization markers were selected and the structural identi fi cation was carried out.PLS-DA was used for group differentiation and potential biomarkers selection. As shown in the scores plot, the distinct clustering among schizophrenia patients and healthy volunteers was observed. Conclusion It is suggested that the metabolic pathways such as carbohydrate,lipid and amino acid in schizophrenia can be disturbed, and show the metabolic disturbance in schizophrenia patients may play an important role in the development of metabolic syndrome.

schizophrenia; metabolome; UPLC; TOF MS

R965

A

1674-9316（2017）27-0155-04

10.3969/j.issn.1674-9316.2017.27.082

福建省衛(wèi)生計(jì)生委青年科研課題項(xiàng)目（2014-2-77）

1福建省廈門市仙岳醫(yī)院精神衛(wèi)生研究室，福建 廈門361012；2廈門出入境檢驗(yàn)檢疫局技術(shù)中心食品理化實(shí)驗(yàn)室，福建 廈門 361026

王文強(qiáng)