不同類型敷料的抑菌效果研究

楊少通，賀盼盼，羅 敏，熊 楓，殷義霞

（武漢理工大學(xué)：1生物系，2材料復(fù)合新技術(shù)國家重點實驗室，湖北武漢430070）

不同類型敷料的抑菌效果研究

楊少通1，賀盼盼1，羅 敏1，熊 楓2，殷義霞2

（武漢理工大學(xué)：1生物系，2材料復(fù)合新技術(shù)國家重點實驗室，湖北武漢430070）

0 引言

在臨床上，很多傷口感染問題都出現(xiàn)在傷口創(chuàng)面修復(fù)的過程中，敷料在傷口修復(fù)過程中起著重要作用．隨著各種敷料理論的發(fā)展，醫(yī)療上對敷料的要求越來越高．傷口愈合涵蓋了從最初的損傷、治療感染、體液丟失、組織再生、傷口閉合到最后的瘢痕形成和重塑的各個方面［1］．傳統(tǒng)的敷料，如紗布、棉條等纖維性敷料雖然具有保護傷口的作用，但是吸濕止血效果并不好，傷口愈合慢，易形成痂皮并造成傷口感染，更換時可能會粘連新生成的肉芽組織，給患者帶來疼痛［2］．隨著傷口濕性愈合理論的提出［3－4］，許多新型敷料不斷被研制出來．新型的醫(yī)用敷料主要包括海藻酸鹽類敷料、聚氨酯類敷料、水凝膠類敷料、薄膜類敷料等．雖然敷料種類繁多，但是這些新型的敷料都能為傷口提供一個濕性的環(huán)境，可以有效促進傷口愈合．目前臨床上對于敷料的要求除了保護傷口，吸濕透氣等基本的功能外，還應(yīng)具有吸收傷口滲出液，促進傷口周圍壞死組織和纖維蛋白的溶解，阻止微生物的侵入，降低患者疼痛，易揭除，經(jīng)濟實惠等功能［5］．含銀敷料是在醫(yī)用脫脂紗布或醫(yī)用非織造布附著上納米銀，從而提高敷料的抑菌效果．納米銀具有廣譜的抗菌性和高安全性［6］，但是銀必須以溶液形式存在才能發(fā)揮它的生物活性，主要是利用納米銀晶體中的Ag＋／Ag0化合物來發(fā)揮作用．納米銀對細(xì)菌的抑制作用主要通過以下幾個方式：①納米銀通過干擾呼吸鏈中的細(xì)胞色素來阻斷微生物的呼吸鏈；②納米銀提高細(xì)菌細(xì)胞壁的通透性，導(dǎo)致胞內(nèi)的營養(yǎng)物質(zhì)外流，從而使細(xì)菌死亡；③納米銀可以與微生物細(xì)胞中的DNA或RNA結(jié)合，破壞細(xì)菌、真菌等各種微生物正常的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、翻譯等功能，從而對大部分微生物具有殺傷作用［7－9］．由于敷料能夠提供一個濕性的環(huán)境，所以結(jié)合在敷料上的納米銀可以有效地釋放出來，并發(fā)揮其優(yōu)秀的抗菌作用．研究［10－11］表明，納米銀敷料殺菌效果良好，皮下反應(yīng)良好，對完整皮膚無刺激性和致敏性．但是在納米銀接觸血液后可能會帶來各種影響，納米顆?？梢源┰饺梭w屏障進入血液循環(huán)系統(tǒng)，通過血液循環(huán)分布到生物體全身其它的臟器和組織，甚至進入細(xì)胞，從而導(dǎo)致納米銀積累，然后造成細(xì)胞毒性［12－14］．利用水刺非織造布法制造的醫(yī)療用品具有較高的均勻性和透濕性，它的特點是手感柔軟、蓬松、高吸濕性、透氣性好、不產(chǎn)生纖維屑，并具有一定的強度，能達到較高的醫(yī)學(xué)要求［15－17］．

本實驗采用了目前市面上較常用的康維德公司與瑞典墨尼克的敷料，以及廈門百美特公司提供的含5%CMC的磷酸鎬鈉銀藻酸鹽纖維以及改性后的水刺含銀藻酸鹽敷料作為研究對象．主要通過不同敷料的抑菌率比較，輔以血液相容性實驗來探討出一個較為優(yōu)秀的敷料．

1 材料和方法

1．1 主要材料與試劑 銀離子藻酸鹽敷料（瑞典墨尼克產(chǎn)品：美極爽銀Melgisorb）；親水性纖維含銀敷料（康維德產(chǎn)品：愛康膚 AQUACEL）；銀離子藻酸鹽敷料（康樂保產(chǎn)品：拜爾坦G-CP）；藻酸鹽粘膠混紡紗布（廈門百美特產(chǎn)品：水刺藻酸鹽敷料）；磷酸鎬鈉銀藻酸鹽粘膠混紡紗布（廈門百美特產(chǎn)品：水刺含銀藻酸鹽敷料）；純銀藻酸鹽纖維含5%CMC的磷酸鎬鈉銀藻酸鹽纖維（廈門百美特產(chǎn)品），金黃色葡萄球菌ATCC 6538、大腸桿菌 ATCC 8739、白色念珠菌ATCC 10231、日本大耳兔（湖北省疾病防治與控制中心）、PBS緩沖液、生理鹽水、營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、沙氏瓊脂培養(yǎng)基，Luria-Bertani培養(yǎng)基．

儀器：Sanyo MC0175二氧化碳培養(yǎng)箱，Olympus CK 40倒置顯微鏡，Multiskan GO酶聯(lián)免疫檢測儀（Thermo Fisher公司），SW-CJ-2FD超凈工作臺，LDZX-50KB立式壓力蒸汽滅菌鍋，HH2恒溫水浴鍋，恒溫?fù)u床．

1．2 材料的制備 由于所用材料密度不同，所以采用相同的重量．每種材料取0．2 g，在紫外線照射下消毒滅菌，每一面照射1 h．并在保證材料質(zhì)量一致的同時盡量保持表面積一致．

1．3 浸提液的制備 稱取所測材料0．2 g于50 mL離心管中，按照1 g∶25 mL比例加入5 mL PBS，噴灑酒精后于37℃培養(yǎng)箱內(nèi)溶脹6 h．溶脹過后，倒去原PBS，按照0．1 g∶10 mL的比例加入20mL PBS在離心管內(nèi)，封口放在震蕩搖床內(nèi)搖24 h，進行浸提．將浸提過的溶液放到無菌操作臺內(nèi)，重新取5個50 mL離心管，在操作臺內(nèi)將濾膜打開，放在干凈離心管管口；用注射器將浸提液抽取出來，拔去針頭，插到濾膜內(nèi)進行過濾，將過濾過的浸提液封口放在冰箱內(nèi)保存，做好標(biāo)記．

1．4 敷料的血液相容性檢測 首先將抗凝劑水浴，抽取新鮮兔血5 mL，水浴加入抗凝劑1．25 mL（血 ∶抗凝劑＝4∶1），取加入了ACD的新鮮兔血1 mL于15 mL離心管內(nèi)，加入2 mL PBS緩沖液稀釋，3500 r／min離心10 min，棄上清得到紅細(xì)胞；在紅細(xì)胞中加入4 mL PBS緩沖液溶解，3500 r／min離心10 min，棄上清液；再次在紅細(xì)胞中加入4 mL PBS緩沖液稀釋，3500 r／min離心10 min，棄去上清液．然后在紅細(xì)胞中加入10 mL PBS溶液稀釋，取稀釋后的紅細(xì)胞0．2 mL＋雙蒸水 0．8 mL（陽性對照組）；稀釋后的紅細(xì)胞 0．2 mL＋PBS溶液0．8 mL（陰性對照組）；稀釋后的紅細(xì)胞0．2 mL加入五種敷料浸提液 0．8 mL（實驗組）；混勻，37℃培養(yǎng)箱內(nèi)下靜置2 h，最后，混懸液以3500 r／min的速度離心4 min，取上清液100 μL移至96孔板，在酶標(biāo)儀下測得其光譜，找其最大峰值處所對應(yīng)的波長，再在其波長下測各孔吸光度．按下式計算紅細(xì)胞溶血率：紅細(xì)胞溶血率＝［（實驗組OD值－陰性對照組OD值）／（陽性對照組 OD值－陰性對照組 OD值）］×100%．

1．5 分光光度計比濁法檢測抑菌效果 本實驗采取分光光度計比濁法對目標(biāo)材料進行抑菌效果的檢測［18－20］．首先，將金黃色葡萄球菌與大腸桿菌置于營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基于二氧化碳培養(yǎng)箱、37℃培養(yǎng)24 h，白色念珠菌置于沙氏瓊脂培養(yǎng)基于二氧化碳培養(yǎng)箱、37℃培養(yǎng)24 h．取培養(yǎng)24 h后的細(xì)菌，用移液槍挑取．移至錐形瓶的LB液體培養(yǎng)基中，在37℃，170 r·min-1的條件下進行搖床振蕩培養(yǎng)．待其到達對數(shù)生長期時添加敷料，各取0．2 g敷料添加至50 mL LB液體培養(yǎng)基中，并設(shè)置空白對照，繼續(xù)進行搖床振蕩培養(yǎng)．敷料抑菌效果檢測：分別于加入敷料6 h、12 h、24 h、48 h，測量OD540，與對照組進行比較分析．繪制加入敷料后的細(xì)菌生長曲線，比較抑菌效果．取6 h、24 h后的菌液，按下式計算抑菌率：抑菌率＝（對照組OD值－實驗組OD值）／（實驗組OD值）×100%．

1．6 統(tǒng)計學(xué)處理 采用 SPSS19．0統(tǒng)計學(xué)軟件進行數(shù)據(jù)分析，卡方檢驗、組間t檢驗分析數(shù)據(jù)結(jié)果，P＜0．05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義．

2 結(jié)果

2．1 敷料的血液相容性 材料的溶血率反映材料和血液接觸后紅細(xì)胞被破壞的程度，溶血率值越小，反映紅細(xì)胞被破壞的程度越?。凑諊覙?biāo)準(zhǔn)規(guī)定合格的生物材料被應(yīng)用到臨床，其溶血率值必須＜5%，圖1中上清液的顏色深淺代表紅細(xì)胞被破壞程度的高低，由圖1可初步判斷各敷料浸提液對紅細(xì)胞的破壞程度較低．不同材料的溶血率如表1所示，各敷料浸提液組溶血率值均＜5%，無溶血現(xiàn)象，和陰性對照組（PBS）無明顯差異．實驗組溶血程度小于陰性對照組，說明材料本身對紅細(xì)胞的破壞作用很小，幾乎為零，試驗過程稍有誤差就會出現(xiàn)負(fù)值的情況．實驗說明水刺含銀藻酸鹽的溶血率較低，表現(xiàn)出良好的血液相容性，是一種良好的敷料，利于傷口愈合．

圖1 血液相容性

表1 各材料溶血率

2．2 敷料的抑菌性能

2．2．1 不同敷料的抑菌性能曲線 由圖2～4的結(jié)果可以看出，通過與空白對照組進行對比，添加了敷料的實驗組中均有明顯的抑菌效果．在添加敷料6 h后，美極爽銀與愛康膚兩種敷料對細(xì)菌的抑制作用見效最快；在24 h后，有些曲線呈上升趨勢，表明該材料的抑菌物質(zhì)的抑菌效果減弱或消失，細(xì)菌恢復(fù)生長，抑制細(xì)菌生長的時間短．雖然美極爽銀抑菌響應(yīng)較快，但是抑制細(xì)菌生長的時間短；愛康膚與含銀水刺藻酸鹽敷料抑菌作用較為持久，能夠減少更換敷料的次數(shù)，減輕患者的痛苦．

圖2 金黃色葡萄球菌生長曲線

圖3 不同材料對大腸桿菌生長的影響

2．2．2 不同敷料24 h抑菌率 通過抑菌率對比，可以更加直觀地比較幾種敷料的抑菌效果．根據(jù)添加的敷料和液體培養(yǎng)基的比例不同，抑菌率也會隨之改變，敷料所占的比例越大，抑菌效果也會越好，但是會影響細(xì)菌的生長空間，所以本研究采取等效性實驗，盡量讓細(xì)菌在一個較自然的環(huán)境下生長，這種情況下抑菌率可能偏低，因此本研究只對各敷料的抑菌率進行橫向?qū)Ρ龋鲗嶒灲M中的敷料都具有抗菌效果，其中愛康膚親水性纖維含銀敷料對3種菌的抑菌效果最好，其次是廈門百美特（水刺含銀藻酸鹽敷料）和美極爽銀；最后是含5%CMC的磷酸鎬鈉銀藻酸鹽纖維．愛康膚與美極爽銀對大腸桿菌抑制作用比較明顯，廈門百美特（水刺含銀藻酸鹽敷料）對3種菌的抑制效果相近，說明其具有較良好的廣譜抗菌性（表2）．

表2 不同材料作用細(xì)菌24 h后抑菌率結(jié)果

3 結(jié)論

隨著醫(yī)療技術(shù)的發(fā)展，人們越來越重視傷口的護理，對敷料的抗菌性能要求也越來越高．海藻酸纖維能在傷口表面原位形成凝膠，創(chuàng)造利于傷口愈合的濕性密閉環(huán)境．而納米銀具有廣譜的抗菌性能，可以有效抑制細(xì)菌的生長，給傷口創(chuàng)造一個無菌的環(huán)境．在海藻酸纖維的內(nèi)部添加均勻分散的納米銀顆粒，可以結(jié)合兩者的優(yōu)點，在保證其優(yōu)異的抗菌性能的同時促進傷口愈合．通過醫(yī)用水刺非織造紗布技術(shù)將納米銀載入海藻酸纖維當(dāng)中，可以使敷料具有良好的透氣性、吸濕性，迅速吸收傷口分泌物，不起毛，不掉屑，以剔除，可以防止傷口的二次感染，得到更加安全的載銀海藻酸纖維．

本研究表明，廈門百美特生產(chǎn)的水刺含銀藻酸鹽敷料具有較低的溶血性，對人體血液影響較小，并具有較好的抑菌效果．廈門百美特公司將含有5%CMC的磷酸鎬鈉銀藻酸鹽纖維改良成磷酸鎬鈉銀藻酸鹽粘膠混紡紗布后，抑菌效果有明顯的的提升，并優(yōu)于市場上銷售的康樂保產(chǎn)品：銀離子藻酸鹽敷料．含銀的藻酸鹽敷料是現(xiàn)在醫(yī)用敷料研究的熱點，雖然納米銀在具有良好的抑菌效果，但是含銀藻酸鹽在使用過程中可能伴隨著納米顆粒的脫落和銀離子的釋放，并在體內(nèi)遷移，于不同臟器引起蓄積，從而對人體造成損傷，具有潛在的毒性風(fēng)險．因此，還需要在納米銀對人體的毒性作用方面做一個具體的評估．

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Study on antibacterial effect of different types of dressings

YANG Shao-Tong1， HE Pan-Pan1， LUO Min1， XIONG Feng2，YIN Yi-Xia21Department of Biology，2State Key Laboratory of Advanced Technology for Materials Synthesis and Processing，Wuhan University of Technology， Wuhan 430070， China

AIM：To find out a kind of dressing with blood compatibility and antibacterial effect．METHODS：Different types of dressings were selected as research objects，and the biosecurity of dressings were studied by blood compatibility experiment，then the antibacterial effect of the medical dressings were detected by spectrophotometer turbidimetricexperiment．RESULTS：The hemolysis rate of the spunlaced silver alginate dressing was less than 5%，indicating that the material had no hemolysis and had good blood compatibility．Compared with other dressings， the spunlaced silver alginate dressing had a better antibacterial effect which can inhibit the growth of bacteria effectively．CONCLUSION：The spunlaced silver alginate dressing as a new kind of medical dressing，can prevent wound infection and promote wound healing，which is a new kind of dressing with good medical value and application prospect．

spunlaced silver alginate dressings； hemocompatibility；antibacterial effect

目的：尋找一種具有良好血液相容性和良好抑菌效果的敷料．方法：以不同類型的敷料作為研究對象，通過血液相容性實驗對敷料的生物安全性作初步探究．通過分光光度計比濁法對目標(biāo)材料進行抑菌效果的檢測．結(jié)果：新型水刺含銀藻酸鹽敷料的溶血率低于5%，表明該材料無溶血現(xiàn)象，具有良好的血液相容性．通過與其它敷料的抑菌效果比較，新型水刺含銀藻酸鹽敷料有較好的抑菌效果，可以有效抑制細(xì)菌的生長．結(jié)論：新型水刺含銀藻酸鹽敷料作為一種醫(yī)用敷料，具有能夠防止傷口感染，促進傷口愈合的作用，是一種具有較高醫(yī)用價值和良好應(yīng)用前景的新型敷料．

水刺含銀敷料；血液相容性；抑菌性能

R318

A

2095-6894（2017）12-30-04

2017－03－14；接受日期：2017－03－30

國家自然科學(xué)基金青年項目（51403168）；中國留學(xué)基金委資助（201606955009）；武漢理工大學(xué)校企科研項目（20161h0072）；全國大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)計劃（20161049720016）

楊少通．E-mail：tongshao95＠ 163．com

殷義霞．副研究員．研究方向：生物材料．E-mail：yinyixia＠ whut．edu．cn