基因編輯技術(shù)的研究進(jìn)展

邵任

摘 要：傳統(tǒng)以同源重組為技術(shù)基礎(chǔ)的基因打靶技術(shù)的效率很低，基因編輯技術(shù)能對(duì)基因組進(jìn)行定點(diǎn)的精確改造， ZFN、TALENs、CRISPR/Cas 9三項(xiàng)基因編輯技術(shù)的發(fā)展，使得基因編輯的使用成本降低，應(yīng)用范圍更廣。

關(guān)鍵詞：基因編輯；ZFN；TALEN；CRISPR/Cas 9

中圖分類(lèi)號(hào)：Q819 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1671-2064（2017）22-0217-03

現(xiàn)在基因編輯技術(shù)主要是通過(guò)能特異性識(shí)別DNA序列的核酸酶對(duì)DNA進(jìn)行切割，產(chǎn)生DSB（double-strand break），接著通過(guò)非同源末端鏈接機(jī)制（non-homologous end joining，NHEJ）或者同源重組修復(fù)機(jī)制（homology-directed repair，HDR）來(lái)修復(fù)斷裂的DNA位點(diǎn)。如圖1所示，當(dāng)存在外源的同源DNA時(shí)，HDR會(huì)導(dǎo)致單個(gè)或者多個(gè)轉(zhuǎn)基因的引入來(lái)矯正或者替換已經(jīng)存在的基因，不存在外源同源序列時(shí)，基因組的修復(fù)過(guò)程仍然會(huì)產(chǎn)生突變。當(dāng)不存在外源的同源基因時(shí)，NHEJ介導(dǎo)的修復(fù)在目的基因處會(huì)產(chǎn)生小的插入或者缺失突變，當(dāng)有外源模板存在時(shí)，外源DNA能借此插入到斷裂序列中最長(zhǎng)可達(dá)14Kb。

1 ZFN技術(shù)

1983年在非洲爪蟾中第一次發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄因子TFⅢA。鋅指結(jié)構(gòu)是一個(gè)必須依賴(lài)Zn+存在的四面體結(jié)構(gòu)，該四面體是由多個(gè)Cys或者是His與鋅離子鰲合組成。1993年Desjarlaris和Berg等得到能夠識(shí)別特定DNA位點(diǎn)的鋅指蛋白。1996年Kin和Cha等的研究表明，將鋅指蛋白與內(nèi)切酶Fox Ⅰ中的無(wú)特異性DNA清楚結(jié)構(gòu)域連接，可以組合成鋅指嵌合核酸酶。其后通過(guò)無(wú)數(shù)科學(xué)家對(duì)ZFN的特異性DNA切割功能進(jìn)行優(yōu)化和效率提升，使得ZFN在基因編輯中占有重要作用。鋅指蛋白鋅指核糖核酸酶（ZFN）包含兩個(gè)結(jié)構(gòu)單元，一個(gè)是具有特異性識(shí)別DNA序列的DNA識(shí)別域，另一個(gè)是非特異性識(shí)別的核酸內(nèi)切酶的DNA切割域。DNA識(shí)別域是有一系列鋅指蛋白motif組成，一個(gè)ZFN包含的鋅指蛋白motif的個(gè)數(shù)一般是3～6個(gè)，其中每個(gè)鋅指蛋白特異性地識(shí)別并且結(jié)合一個(gè)三聯(lián)體堿基。每個(gè)鋅指蛋白motif由30左右個(gè)氨基酸組成，其中保守的氨基酸殘基是和鋅離子結(jié)合的氨基酸殘基，它們是4Cys-或者是2Cys2His-。如圖2所示。

每個(gè)鋅指蛋白motif是由一個(gè)α螺旋和兩個(gè)反向的β折疊結(jié)構(gòu)組成，根據(jù)每個(gè)鋅指蛋白motif中α螺旋的第1、3、6位氨基酸殘基的不同特異性地識(shí)別DNA中三個(gè)連續(xù)的堿基。所以一個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)單元（通常包含3～6個(gè)鋅指蛋白）能夠特異性得識(shí)別18～36bp的雙鏈DNA序列。而具有核酸內(nèi)切酶功能的DNA切割域來(lái)源于ⅡS型核酸內(nèi)切酶Fox Ⅰ，ⅡS型核酸內(nèi)切酶具有識(shí)別和切割核酸的功能，但是每項(xiàng)功能由不同的結(jié)構(gòu)域來(lái)執(zhí)行，利用該酶的這一特點(diǎn)進(jìn)行人工改造，保留非特異性的內(nèi)切酶的功能，將它與人工合成的DNA特異性識(shí)別結(jié)構(gòu)域如鋅指結(jié)構(gòu)域相連，就產(chǎn)生了具有針對(duì)特定的DNA序列進(jìn)行識(shí)別并切割的人工核酸酶ZFN。

ZFN的基因編輯效率相對(duì)于傳統(tǒng)的同源同組效率來(lái)講有所提高，但也只停留在30%左右。而且由于上下文依賴(lài)（即ZFN的各個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)單位單位并不是完全獨(dú)立的而是存在相互影響）脫靶效應(yīng)很?chē)?yán)重，對(duì)細(xì)胞而言會(huì)產(chǎn)生很大的毒性。加之掌握Z(yǔ)FN關(guān)鍵技術(shù)只有少數(shù)公司，所以新的一代基因編輯技術(shù)應(yīng)運(yùn)而生。

2 TALEN技術(shù)

Transcription activator-like effectors（TALE）TALEs是自然界本來(lái)存在的，1989年第一次發(fā)現(xiàn)是在一種植物致病菌黃單胞桿菌屬Xanthomonas中。2007年，發(fā)現(xiàn)TALE能特異性結(jié)合DNA序列。2009年，TALE氨基酸序列與核算靶序列的對(duì)應(yīng)關(guān)系被破譯。TALE包含的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域由一系列的33到35個(gè)氨基酸組成的重復(fù)的結(jié)構(gòu)組成，每個(gè)結(jié)構(gòu)可以識(shí)別一個(gè)bp的核酸。TALE能特異性識(shí)別DNA能力是有兩個(gè)高度可變的氨基酸殘基決定的，這兩個(gè)氨基酸被稱(chēng)為RVDs（the repeat-variable diresidues），TALE的DNA結(jié)合域的氨基酸序列與其結(jié)合的DNA序列之間有著相對(duì)恒定的對(duì)應(yīng)關(guān)系。

如圖3所示，TALE蛋白的第12、13位氨基酸殘基的不同的排列組合對(duì)應(yīng)識(shí)別不同的核苷酸，NN識(shí)別G或者A，HD識(shí)別C，NG識(shí)別T，NI識(shí)別A。和鋅指蛋白一樣，TALE蛋白可以被連接起來(lái)識(shí)別連續(xù)的DNA序列。然而，與鋅指蛋白不一樣的是，在構(gòu)建長(zhǎng)的TALAs模塊排列時(shí)，TALE在理論上具備定位到基因組上的單一位點(diǎn)，無(wú)需對(duì)模塊之間的連接進(jìn)行改造。而且TALE能對(duì)DNA上的單位點(diǎn)進(jìn)行識(shí)別，與鋅指蛋白識(shí)別DNA上的三聯(lián)體堿基相比，在設(shè)計(jì)DNA識(shí)別區(qū)域是有更大的靈活性。將一系列的TALE蛋白進(jìn)行組裝在一起，在與FolⅠ核酸內(nèi)切酶進(jìn)行連接就可以形成具有特異性識(shí)別剪切DNA片段的TALEN（Transcription Activation Like Effector Nuclease）。FolⅠ核酸內(nèi)切酶只有在形成二聚體時(shí)才會(huì)具有活性。如圖3所示，兩個(gè)TALEN分別位于正反義鏈上靶標(biāo)位點(diǎn)，F(xiàn)olⅠ形成二聚體，在spacer處切割DNA。

TALENs技術(shù)相對(duì)于ZFN提高了基因編輯的效率，且成功率高，設(shè)計(jì)周期短。但與此同時(shí)另外一種更加方便簡(jiǎn)單的基因編輯技術(shù)也正在迅速發(fā)展。

3 CRISPR技術(shù)

1987年日本學(xué)者在大腸桿菌中發(fā)現(xiàn)了一些重復(fù)序列，這些重復(fù)序列被一些序列類(lèi)似但不同的片段隔開(kāi)，但當(dāng)時(shí)并不清楚這些序列的意義。到2007年，研究才發(fā)現(xiàn)CRISPR/Cas與細(xì)菌的獲得性免疫有關(guān)，而且這種獲得性免疫在細(xì)菌和古細(xì)菌很常見(jiàn)。隨后發(fā)現(xiàn)CRISPR/Cas系統(tǒng)的組成包含必要的三個(gè)部分—trancrRNA，CrRNA和Cas9核酸酶。接下來(lái)Jiang等的研究展示了，CRISPR/Cas 9系統(tǒng)發(fā)揮作用的具體過(guò)程。

CRISPR/Cas 9系統(tǒng)：CPISPR是多個(gè)成簇的，規(guī)律間隔的短回文重復(fù)序列，在細(xì)菌和古細(xì)菌中提供獲得性免疫。CRISPR依賴(lài)于crRNA和tracrRNA來(lái)進(jìn)行序列特異性的插入外源基因來(lái)進(jìn)行基因沉默。CRISPR/Cas有三種系統(tǒng)存在，在第Ⅱ種系統(tǒng)中，Cas9作為一種有RNA指導(dǎo)的DNA內(nèi)切酶來(lái)切除DNA。

如圖4所示，CRISPR/Cas 9系統(tǒng)工作的原理是，外源的病毒或者質(zhì)粒侵入細(xì)菌中被宿主體內(nèi)的核酸酶消化成短的DNA片段，部分消化之后的片段被整合到宿主的基因組中，形成了CRISPR基因座中的spacer，spacer之間被序列保守的repeat間隔，附近的cas genes為CRISPR相關(guān)基因，CRISPR-Cas表達(dá)期，CRISPR陣列轉(zhuǎn)錄出crRNA前體以及tracrRNA前體以及cas genes轉(zhuǎn)錄翻譯產(chǎn)生Cas蛋白。crRNA前體以及tracrRNA前體以部分堿基互補(bǔ)配對(duì)的方式形成部分雙鏈RNA而結(jié)合在一起，其莖環(huán)結(jié)構(gòu)被識(shí)別后與Cas9蛋白結(jié)合，在RNA酶的作用下，crRNA前體以及tracrRNA前體被切割形成成熟的crRNA和tracrRNA，成熟的crRNA和tracrRNA作為guide RNA與Cas9蛋白作為復(fù)合物識(shí)別切割外源基因，該復(fù)合物尋找PAM位點(diǎn)并識(shí)別，Cas9啟動(dòng)其解旋功能，同時(shí)guide RNA與目的基因片段互補(bǔ)，Cas9啟動(dòng)切割功能，由Cas9蛋白的N端RuvC核酸酶結(jié)構(gòu)域以及肽鏈中間的HNH核酸酶結(jié)構(gòu)域共同識(shí)別雙鏈DNA并切割。識(shí)別在識(shí)別外源基因的過(guò)程中PAM（proto spacer adjacent motif）序列發(fā)揮重要作用，cas9識(shí)別的特異性PAM序列為5端的NGG，PAM序列作為細(xì)菌識(shí)別外源基因的異己標(biāo)志，是大部分噬菌體基因中帶有的序列，通過(guò)分子生物學(xué)手段了解到，絕大多數(shù)人類(lèi)基因的附近都有GG序列，因此Cas9能識(shí)別人類(lèi)的大多數(shù)基因。CRISPR/Cas 9操縱子雖然也有與gRNA配對(duì)的序列，但配對(duì)序列附近缺乏PAM序列因此能逃脫被CRISPR/Cas 9切割。

根據(jù)CRISPR/Cas 9系統(tǒng)的作用機(jī)制，可以將CRISPR/Cas 9系統(tǒng)的基本元件導(dǎo)入到真核細(xì)胞中，完成對(duì)真核細(xì)胞中特定基因的雙鏈DNA的切割，激活細(xì)胞內(nèi)的DNA修復(fù)機(jī)制，造成非3的倍數(shù)的堿基的缺失即可敲掉該基因。CRISPR/Cas 9系統(tǒng)的基本元件包括gRNA、Cas9蛋白。人為設(shè)計(jì)出sgRNA（single guide RNA）替代crRNA-trancrRNA復(fù)合體的gRNA， sgRNA是將crRNA、trancrRNA的DNA連接在一起轉(zhuǎn)錄出來(lái)，轉(zhuǎn)錄出來(lái)的sgRNA能發(fā)生自身堿基配對(duì)形成與crRNA-trancrRNA復(fù)合體結(jié)構(gòu)相同的部分RNA雙鏈以及莖環(huán)結(jié)構(gòu)。sgRNA能結(jié)合Cas9蛋白并能結(jié)合特定的DNA序列。研究表明，人工設(shè)計(jì)的sgRNA位于PAM位點(diǎn)上游13的堿基以?xún)?nèi)不能發(fā)生突變，否則切割位點(diǎn)無(wú)法識(shí)別。Cas9蛋白上的HNH和RuvC兩個(gè)內(nèi)切酶同源的結(jié)構(gòu)域，中，HNH結(jié)構(gòu)域特異性切割與CrRNA互補(bǔ)的核酸序列，RuvC結(jié)構(gòu)域則是切割非互補(bǔ)序列，在應(yīng)用過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生脫靶效應(yīng)。通過(guò)突變RuvC結(jié)構(gòu)域形成只有HNH活性的切割酶，其脫靶率大大降低且切割的效率增加。

目前已經(jīng)能成功地應(yīng)用CRISPR/Cas 9系統(tǒng)對(duì)斑馬魚(yú)、老鼠、線(xiàn)蟲(chóng)、水稻、擬南芥、果蠅、體外培養(yǎng)的人體細(xì)胞等進(jìn)行定點(diǎn)的基因敲除。其敲除方法為，構(gòu)建可以轉(zhuǎn)錄出gRNA的質(zhì)粒以及可以表達(dá)Cas9蛋白的質(zhì)粒，通過(guò)一系列的方法比如轉(zhuǎn)染，注射等導(dǎo)入到細(xì)胞體內(nèi)，對(duì)目的基因進(jìn)行DNA雙鏈切割，切割之后體內(nèi)的修復(fù)機(jī)制被啟動(dòng)，根據(jù)修復(fù)的機(jī)制不同以及是否提供DNA供體來(lái)對(duì)基因進(jìn)行定點(diǎn)的編輯以及敲除。此外有研究針對(duì)Cas9蛋白的兩個(gè)結(jié)構(gòu)域HNH和RuvC進(jìn)行相關(guān)的點(diǎn)突變，得到dCas9，這種失活的突變體能夠結(jié)合sgRNA從而識(shí)別靶基因，但失去了內(nèi)切酶的功能，不能對(duì)雙鏈DNA進(jìn)行酶切。dCas9可應(yīng)用在基因表達(dá)調(diào)控上，例如設(shè)計(jì)能特異識(shí)別編碼區(qū)上游的sgRNA，引導(dǎo)dCas9蛋白結(jié)合到目的DNA序列上，由于蛋白的空間位阻效應(yīng)，相關(guān)轉(zhuǎn)錄調(diào)控蛋白無(wú)法結(jié)合，從而敲低特定的基因。

4 基因編輯的應(yīng)用前景

基因編輯作為一項(xiàng)迅猛發(fā)展的技術(shù)，在各個(gè)領(lǐng)域都有廣闊的應(yīng)用前景。在基因功能研究、基因治療上都有很好的應(yīng)用?；蚯贸菍?shí)驗(yàn)室研究基因功能的一個(gè)常規(guī)手段，ZFN已經(jīng)能在大鼠、果蠅、斑馬魚(yú)等模式生物中已經(jīng)成功地實(shí)現(xiàn)了內(nèi)源基因的定點(diǎn)突變而且或者了穩(wěn)定遺傳的突變體。TALENs技術(shù)已經(jīng)能在斑馬魚(yú)、大鼠、水稻、斑馬魚(yú)等模式生物中進(jìn)行了定點(diǎn)突變、置換、刪除等操作。已經(jīng)有研究成功運(yùn)用TALENs技術(shù)定點(diǎn)突變水稻感病基因，提高了水稻的抗病能力以及運(yùn)用TALENs于酵母以及哺乳動(dòng)物細(xì)胞中。Hockemeyer等用TALENs技術(shù)把轉(zhuǎn)基因盒成功插入iPSC的靶位點(diǎn)上。CRISPR/Cas 9技術(shù)已經(jīng)成功得對(duì)線(xiàn)蟲(chóng)、果蠅、斑馬魚(yú)進(jìn)行了遺傳學(xué)改造，獲取了表型改變明顯的突變體，表明了CRISPR/Cas 9技術(shù)在動(dòng)物基因改造的巨大潛能。在基因治療方面，運(yùn)用ZFN技術(shù)在成肌細(xì)胞中對(duì)基因進(jìn)行移碼突變研究杜氏肌營(yíng)養(yǎng)不良癥，在小鼠肝臟細(xì)胞中通過(guò)敲除基因?qū)σ倚透窝走M(jìn)行研究，在iPSC細(xì)胞中對(duì)基因進(jìn)行替換研究帕金森癥等等；運(yùn)用TALEN技術(shù)，在iPSC中進(jìn)行Lys342Glu的點(diǎn)突變來(lái)研究代謝性肝病等；運(yùn)用CRISPR/Cas 9技術(shù)在CD4+T中對(duì)HIV的LTR區(qū)域進(jìn)行破壞來(lái)研究艾滋病等表明基因編輯技術(shù)在基因治療方面有遠(yuǎn)大的前景。

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