生物法在石油降解中的應(yīng)用

周生爍

摘 要：在石油污染日益嚴(yán)重的今天，針對(duì)高效降解石油方法的研究處于前言，其中生物法降解石油因其環(huán)境污染小、投入成本低以及降解效率高是目前石油降解的首選方法。本人對(duì)生物法降解石油做一些介紹，并介紹了目前仍處于實(shí)驗(yàn)室研究階段的基因工程石油降解菌。

關(guān)鍵詞：石油降解；生物法；基因工程

中圖分類號(hào)：Q939.9 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1671-2064（2017）22-0009-02

石油作為重要化石能源，是工業(yè)發(fā)展必要的能源物質(zhì)。但自上個(gè)世紀(jì)以來(lái)，石油運(yùn)輸過(guò)程中泄露、石油加工生產(chǎn)工程中產(chǎn)生的廢棄物等進(jìn)入環(huán)境，對(duì)水體、土壤造成了嚴(yán)重的危害，進(jìn)而對(duì)人類本身的健康造成不良影響。

石油作為重點(diǎn)監(jiān)控的污染物來(lái)源之一，其本身就具有致突變、致癌、致畸的毒性，而且其所含污染物的種類繁多，不同的成分對(duì)環(huán)境的污染程度不同，且降解和清除的方法不一樣。石油作為污染物的主要表現(xiàn)在如下方面：

（1）污染水體。例如海上泄露的原油，其成分種中的芳香烴會(huì)在水面形成一層油膜，阻止水體與空氣中氧氣的交換，導(dǎo)致水中生物的死亡，從而破壞了水中的生態(tài)環(huán)境。污染地下水會(huì)直接對(duì)居民的健康造成威脅。

（2）污染土壤。石油中的某些成分嵌入突然會(huì)造成土壤的黏連性、滲水性的變差以及阻礙空氣的流通性，不利于土壤上植被的存活，以及土壤中微生物的生存，對(duì)生態(tài)系統(tǒng)造成破壞。

（3）石油中的芳香類物質(zhì)能對(duì)人類和動(dòng)物的機(jī)體產(chǎn)生較大的毒性。進(jìn)入人體或動(dòng)物體中的多環(huán)芳香烴會(huì)造成腎臟和肝臟等的損傷，而且還具有“三致”毒性。高分子烴和低分子烴會(huì)形成一層油膜覆蓋在植物的表面，隔絕植物與空氣中的氣體交換以及水分蒸發(fā)，而且石油中的低碳化合物能夠直接進(jìn)入植物機(jī)體破壞其內(nèi)部組織結(jié)構(gòu)，從而影響植物的代謝和機(jī)能。

1 石油降解原理

1.1 石油降解方法

目前降解時(shí)候的方法包括生物法、物理法以及化學(xué)法。其中物理以及化學(xué)法降解石油能夠起到一定的作用，但只能作為處理石油污染的輔助手段來(lái)使用，原因有：物理、化學(xué)法處理成本耗費(fèi)太高、很容易造成二次污染。與此同時(shí)，生物法處理石油污染，不會(huì)存在二次污染的問(wèn)題，相對(duì)于化學(xué)法和物理法，生物法對(duì)環(huán)境友好，效率高而且投入成本低，是目前一種重要且被給予厚望的石油污染處理方法。

石油一般由鏈狀烷烴、環(huán)狀烷烴、芳香烴、樹(shù)脂以及瀝青質(zhì)組成。其中短鏈的鏈狀烷烴可以通過(guò)會(huì)發(fā)作用進(jìn)入到大氣，剩下的成分中，長(zhǎng)的鏈狀烷烴以及環(huán)狀烷烴容易被降解，其次是分子量較低的芳香烴，多環(huán)芳烴被降解的難度很大，而樹(shù)脂和瀝青質(zhì)則是極難被降解。

1.2 生物法降解石油的原理

生物法降解石油的原理是，微生物能利用石油成分中的烴類作為自身的能源物質(zhì)，通過(guò)體內(nèi)一系列酶促反應(yīng)介導(dǎo)的氧化、還原以及合成、分解等過(guò)程將石油中的碳?xì)浠衔镛D(zhuǎn)化成為二氧化碳、水等無(wú)機(jī)物。不同石油成分被降解的原理不一樣，烷烴的降解方式包括雙末端氧化、單末端氧化以及亞末端氧化三種。其中雙末端氧化和單末端氧化是主要的降解方式，單末端氧化是指在微生物的單末端氧化酶的作用下將烷烴鏈的一個(gè)末端氧化成為醇，并進(jìn)一步氧化成醛類物質(zhì)，再進(jìn)一步氧化成脂肪酸，最后形成的脂肪酸能通過(guò)三羧酸循環(huán)被當(dāng)做能源物質(zhì)利用。雙末端氧化主要針對(duì)的是帶分支的烷烴，在非專一羧基酶的作用下將雙鏈的末端同時(shí)氧化成二羧基酸，再在兩端進(jìn)行β-氧化之后，進(jìn)入到三羧酸循環(huán)中。

芳香烴的降解機(jī)制有很多種，在細(xì)菌和真菌中降解的機(jī)制不一樣，而在不同的細(xì)菌中降解的機(jī)制也不一樣，相對(duì)于烷烴的降解，芳香烴的降解難度更大，在各種不同的降解機(jī)制中都需要分子氧的加入以及加氧酶的參與。在細(xì)菌中，在加氧酶的催化作用下，分子氧加入到芳香烴中，生成的物質(zhì)在相關(guān)酶的作用下裂解生成鄰苯二酚。

2 降解石油的微生物

在自然界中能夠降解石油污染的微生物種類繁多，而對(duì)于生物法治理石油污染的主要微生物研究對(duì)象是細(xì)菌。

治理石油污染的細(xì)菌一般是在從污染的區(qū)域篩選出來(lái)的自然界中本來(lái)就存在的細(xì)菌或者是經(jīng)過(guò)人工改造的工程菌。環(huán)境中的諸多因素都會(huì)影響細(xì)菌降解石油的能力，其中包括溫度、濕度、含氧量、酸堿度、鹽度以及壓力等等。這些因素不僅影響細(xì)菌的數(shù)量還會(huì)對(duì)細(xì)菌體內(nèi)的代謝途徑造成影響從而影響細(xì)菌對(duì)石油中各成分中的利用情況。

細(xì)菌降解石油的能力源于體內(nèi)一系列的代謝酶，而有些編碼石油降解相關(guān)的代謝酶存在在細(xì)菌的質(zhì)粒上。質(zhì)粒是細(xì)菌體內(nèi)獨(dú)立于染色體存在的大多數(shù)是環(huán)狀的少數(shù)是現(xiàn)狀的DNA分子，能自主復(fù)制穩(wěn)定遺傳給下一代，是基因工程中常用的載體。有研究表明將帶有降解不同石油組分的代謝酶基因的質(zhì)粒導(dǎo)入到一種細(xì)菌株里面，通過(guò)選擇培養(yǎng)，這些天然質(zhì)粒在細(xì)胞株穩(wěn)定存在且表達(dá)相關(guān)的代謝酶，從而選育中良好的石油降解的新菌株。

3 基因工程菌

目前投入石油降解領(lǐng)域使用的細(xì)菌大部分是從相關(guān)環(huán)境中篩選得到的。為了解決單一菌種無(wú)法有效降解石油中不同成分的問(wèn)題，實(shí)際中一般使用混合菌種，但這些菌種因?yàn)橛懈髯缘膶?duì)營(yíng)養(yǎng)的需求，在使用過(guò)程中菌種之間會(huì)發(fā)生競(jìng)爭(zhēng)、抑制，導(dǎo)致了不同菌種的組成比例較之前的配比發(fā)生變化。為了解決這些問(wèn)題，構(gòu)建高效的基因工程菌很有必要。

目前基因工程菌已經(jīng)在人工實(shí)驗(yàn)條件下表現(xiàn)出良好的石油降解能力。已有研究表明，美國(guó)的研究者將帶有CAM、NAH、OCT、XAL的4種石油降解質(zhì)粒導(dǎo)入到宿主細(xì)胞內(nèi)，形成了一種“多質(zhì)粒超級(jí)菌”該細(xì)菌能大大地縮短石油在海面上被降解的時(shí)間。

目前在實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建降解石油的基因工程菌有大致相同的流程：

（1）從油田或者是石油污染的區(qū)域分離出多種可降解石油的菌種，再?gòu)钠渲泻Y選出降解效果最好的菌株。

（2）分析鑒定該菌株的系統(tǒng)發(fā)育地位使用的方法包括形態(tài)學(xué)觀察、生理生化測(cè)試、抗性的測(cè)試以及16SrRNA基因序列同源性分析等。同時(shí)對(duì)其生長(zhǎng)特性、環(huán)境影響因素以及對(duì)石油的中各組分的降解效果進(jìn)行研究。例如研究表明該菌株對(duì)芳香烴的降解能力較弱。

（3）取已知的芳香烴降解菌株經(jīng)行其降解能力的測(cè)試以及加氧酶活的檢測(cè)。通過(guò)一些的實(shí)驗(yàn)手段，包括酶學(xué)研究、PCR擴(kuò)增、質(zhì)粒的敲除等等確定降解芳香烴的相關(guān)酶，針對(duì)該酶的基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增并測(cè)序。在大腸桿菌中表達(dá)該酶，對(duì)其進(jìn)行進(jìn)一步的定位以及含量的研究。

（4）將編碼相關(guān)降解酶的基因重組到自殺質(zhì)粒上形成重組質(zhì)粒，自殺質(zhì)粒帶有某段自殺基因能在非指定底物或者是非指定環(huán)境中不能生存生長(zhǎng)。并將重組質(zhì)粒通過(guò)DNA轉(zhuǎn)移技術(shù)導(dǎo)入之前篩選出來(lái)的細(xì)菌中，形成基因工程菌。

（5）通過(guò)對(duì)工程菌的生長(zhǎng)特性、底物降解的特異性以及酶活性、遺傳物質(zhì)的穩(wěn)定性等等因素進(jìn)行研究，直至該工程菌具有降解石油中不同組分且效率較高的效果，同時(shí)其生長(zhǎng)特性沒(méi)有發(fā)生很明顯的改變。

（6）制備工程菌菌劑，在實(shí)驗(yàn)室中模擬石油污染的環(huán)境修復(fù)過(guò)程，了解在污染區(qū)域的環(huán)境條件下，工程菌的降解效率如何。

4 前景與展望

鑒于對(duì)環(huán)境的破壞很小而且能永久地清除污染物的同時(shí)不帶來(lái)二次污染，使用的經(jīng)濟(jì)成本低，生物法治理石油污染是以后該領(lǐng)域的必然趨勢(shì)。但目前對(duì)高分子多環(huán)芳烴以及瀝青質(zhì)的降解依然是難以攻克的難題，未來(lái)的研究方向可以朝尋找該類石油降解基因方向發(fā)展。此外，在實(shí)驗(yàn)室研究相對(duì)成熟的基因工程菌還未投入到壞境中使用主要是存在如下安全隱患：

（1）工程菌細(xì)胞內(nèi)帶有的抗生素基因會(huì)導(dǎo)致廣泛的耐藥菌出現(xiàn)。

（2）工程菌攜帶的致病因子在環(huán)境中傳播，后果嚴(yán)重。所以在真正將基因工程菌投入到環(huán)境中使用之前，需要慎重的考慮，同時(shí)應(yīng)該應(yīng)用一些新的方法，例如加入一段自殺基因等使其完成任務(wù)后自動(dòng)消失，解決安全隱患。

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