姜黃素治療幼年小鼠腦外傷的實(shí)驗(yàn)研究

李 杰 李 珍 程 田

1) 開封市兒童醫(yī)院兒童重癥監(jiān)護(hù)室，河南 開封 475000 2)開封市兒童醫(yī)院急診科，河南 開封 475000 3)鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院，河南 鄭州 450000

·論著科研之窗·

姜黃素治療幼年小鼠腦外傷的實(shí)驗(yàn)研究

李 杰1)李 珍2)程 田3)△

1) 開封市兒童醫(yī)院兒童重癥監(jiān)護(hù)室，河南 開封 475000 2)開封市兒童醫(yī)院急診科，河南 開封 475000 3)鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院，河南 鄭州 450000

目的探討幼年小鼠腦外傷后應(yīng)用姜黃素(CCM)治療是否具有神經(jīng)保護(hù)和促進(jìn)神經(jīng)再生的作用。方法將92只C57BL/6小鼠隨機(jī)分為3組，建立自由落體腦外傷動(dòng)物模型，并分為假手術(shù)(Sham)組，腦外傷+生理鹽水(TBI+Vehicle)組，腦外傷+姜黃素(TBI+CCM)組。尼氏染色觀察大腦損傷體積，mNSS評(píng)分評(píng)價(jià)小鼠的運(yùn)動(dòng)功能，干濕稱重法檢測(cè)小鼠損傷側(cè)大腦水含量，Edu染色觀察SGZ區(qū)神經(jīng)再生，Western blot 檢測(cè)β-catenin和GSK3β蛋白表達(dá)。結(jié)果幼年小鼠腦外傷后，CCM治療可減少大腦損傷體積，改善運(yùn)動(dòng)功能, 明顯增加Edu陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，減少GSK3β的表達(dá)，同時(shí)增加β-catenin的表達(dá)(P<0.05)。結(jié)論幼年小鼠腦外傷后應(yīng)用CCM治療能間接激活Notch通路，同時(shí)具有神經(jīng)保護(hù)和促進(jìn)神經(jīng)再生的作用，為今后治療兒童腦外傷提供新的思路。

幼年小鼠；腦外傷；姜黃素；神經(jīng)保護(hù)；神經(jīng)再生

腦外傷(Traumatic brain injury，TBI)是由外力導(dǎo)致的大腦損傷。兒童腦外傷的發(fā)生率為2%～3%[1]，腦外傷后遺留的運(yùn)動(dòng)、認(rèn)知和精神障礙仍會(huì)給家庭和社會(huì)帶來沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)和精神負(fù)擔(dān)，目前尚未發(fā)現(xiàn)行之有效的治療方法[2]。姜黃素(curcumin，CCM)是姜科姜黃屬植物根莖的主要成分，醫(yī)學(xué)研究表明，姜黃素具有降血脂、抗腫瘤、抗炎、利膽、抗氧化等作用。隨后發(fā)現(xiàn)其在神經(jīng)系統(tǒng)疾病中也有較好的效果，如阿爾茨海默病、帕金森病和神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤等[3]，但關(guān)于姜黃素治療兒童腦外傷的研究未見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)中，我們擬用新生21 d小鼠腦外傷模型模擬兒童腦外傷，mNSS評(píng)分評(píng)價(jià)小鼠運(yùn)動(dòng)功能[4]，同時(shí)應(yīng)用EdU(5-ethynyl-2'-deoxyuridine)[5]染色觀察海馬體齒狀回顆粒下層(subgranular zone of the lateral ventricles，SGZ)神經(jīng)再生情況，探討幼年小鼠腦外傷后運(yùn)動(dòng)，Notch通路表達(dá)及SGZ區(qū)神經(jīng)再生情況，并觀察CCM在神經(jīng)再生和神經(jīng)保護(hù)中的作用。

1 材料與方法

設(shè)計(jì)：隨機(jī)對(duì)照動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。時(shí)間及地點(diǎn)：實(shí)驗(yàn)于2015-01—2016-01鄭州大學(xué)實(shí)驗(yàn)中心完成。

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和分組C57BL/6小鼠92只(3周)隨機(jī)分為3組：假手術(shù)(Sham)組，腦外傷+生理鹽水(TBI+Vehicle)組，腦外傷+(TBI+CCM)組。其中Sham組30只，TBI+Veh組31只，TBI+CCM組31只。

1.2動(dòng)物模型的建立模型建立前，應(yīng)用10%水合氯醛3 mL/kg進(jìn)行麻醉，待麻醉成功后，備皮，酒精消毒，并將小鼠固定于腦立體定位儀上，采用改良式自由落體腦外傷動(dòng)物模型[6]擊打小鼠。Sham組只開骨窗，不予打擊，縫合。打擊后3 h，TBI+CCM組小鼠給予腹腔注射CCM(2 mol/kg)，1次/d。TBI+Veh組給予同體積生理鹽水。進(jìn)行EdU染色的小鼠，在腦外傷24 h后腹腔注射EdU(50 mmg/kg)，1次/d，第3次注射后4 h處死小鼠。

1.3運(yùn)動(dòng)功能評(píng)分腦外傷后應(yīng)用mNSS(modifi-ed neurologic severity score)評(píng)分，評(píng)價(jià)小鼠運(yùn)動(dòng)功能[4]。mNSS評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)是從小鼠運(yùn)動(dòng)、感覺、平衡能力及反射情況等方便進(jìn)行評(píng)估。分別在1 d、3 d、7 d、14 d、21 d和28 d給予mNSS評(píng)分檢測(cè)，采用雙盲法評(píng)判并記錄分值。

1.4腦水含量的測(cè)量腦外傷后3 d，小鼠麻醉后處死，快速取出損傷的左側(cè)半腦，稱取濕質(zhì)量。隨后將腦組織放入烤箱，100 ℃，48 h后稱得干質(zhì)量。根據(jù)公式得到大腦水含量，以判定大腦水腫程度。大腦腦水含量(%)=(濕質(zhì)量-干質(zhì)量)/濕質(zhì)量×100%。

1.5尼氏染色和大腦損傷體積計(jì)算按照尼氏染色步驟進(jìn)行尼氏染色，在顯微鏡下獲得染色圖像，用Image J 軟件分析每個(gè)腦片大腦的缺損面積。缺損體積(mm3)=平均缺損面積× 0.025 ×10 × N。

1.6 EdU染色按EdU染色試劑盒(Thermofish-er)操作步驟進(jìn)行染色，然后用4，6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)染色顯示細(xì)胞核。在熒光顯微鏡下觀察實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

1.7 Western Blot檢測(cè)TBI后第3天，麻醉小鼠，灌注取損傷側(cè)腦組織，使用蛋白提取試劑盒提取損傷組織蛋白，NanoQ儀器測(cè)量蛋白濃度，加入溴化乙錠，金屬浴煮好備用。按照Western blot試劑盒說明書步驟進(jìn)行實(shí)驗(yàn)[7]，使用Image J軟件分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 CCM治療幼年小鼠腦外傷，可減少損傷體積，改善運(yùn)動(dòng)功能，未明顯減少腦水含量TBI術(shù)后28 d，腦組織切片尼氏染色，計(jì)算大鼠大腦損傷體積(圖1A，10×)。結(jié)果顯示TBI+Veh組損傷體積為(10.91±0.87)mm3，高于TBI+CCM組的(7.94±1.05)mm3，2組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，n=6/組)。腦外傷后14 ～28 d，經(jīng)CCM治療后，小鼠的mNSS評(píng)分顯著降低(P<0.05，n=6/組，圖1B)。腦外傷3 d后，大腦水含量可以顯著增加。由TBI+Sham組的(76.06 ± 0.93)%增加到TBI+Veh組的(80.63±0.91)%(P<0.05)。經(jīng)CCM治療，大腦水含量減至(79.52±1.06)%，和TBI+Veh組相比，未見明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05，n=6/組，圖1C)。

圖1 TBI后CCM減少大腦損傷體積，改善運(yùn)動(dòng)功能，未明顯減少腦水含量

2.2 CCM治療幼年小鼠腦外傷，可減少GSK3β的表達(dá)，并增加β-catenin的表達(dá)腦外傷后，應(yīng)用CCM治療3 d后，Western blot 結(jié)果顯示，TBI+CCM組中β-catenin表達(dá)高于Vehicle治療組，而GSK3β在CCM治療組中的表達(dá)量明顯少于Vehicle治療組(P<0.05，n=6/組，見圖2)。證實(shí)腦外傷后CCM治療可減少GSK3β表達(dá)，同時(shí)間接激活Wnt通路，增加β-catenin的表達(dá)。

圖2 CCM治療腦外傷，減少GSK3β表達(dá)，增加β-catenin表達(dá)，減少損傷周圍細(xì)胞壞死

2.3 CCM治療幼年小鼠腦外傷，增加海馬區(qū)神經(jīng)再生用EdU染色標(biāo)記海馬區(qū)增殖的神經(jīng)干細(xì)胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，腦外傷后3 d，TBI+CCM組小鼠海馬SGZ區(qū)的EdU陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，明顯高于Vehicle治療組(P<0.05，n=6/組，見圖3)。

圖3 CCM治療腦外傷，增加SGZ區(qū)神經(jīng)干細(xì)胞增殖

3 討論

兒童腦外傷是一種常見的兒童疾病，至今仍無一種有效的方法進(jìn)行治療。近期發(fā)現(xiàn)，CCM具有神經(jīng)保護(hù)作用，但至今尚無應(yīng)用CCM治療兒童腦外傷的相關(guān)報(bào)道。我們應(yīng)用幼年小鼠腦外傷模型模擬兒童腦外傷，并觀察腦外傷28 d后，小鼠成年后的運(yùn)動(dòng)功能改變，檢測(cè)CCM的療效，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：(1)應(yīng)用CCM治療幼年小鼠腦外傷，可減少小鼠大腦損傷體積，改善小鼠運(yùn)動(dòng)功能；(2)CCM治療可間接激活Notch通路，促進(jìn)神經(jīng)再生。研究表明Notch通路是神經(jīng)再生中的重要通路，調(diào)節(jié)SGZ區(qū)和SVZ去神經(jīng)干細(xì)胞的增殖和分化[8]。在此實(shí)驗(yàn)中，姜黃素治療腦外傷可增加SGZ區(qū)神經(jīng)干細(xì)胞的增殖，促進(jìn)神經(jīng)再生。同時(shí)，CMM有抗炎、抗氧化和清除自由基等廣泛藥理活性，有研究表明其對(duì)帕金森、癲癇等多種中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病具有一定的神經(jīng)保護(hù)作用[9]。通過此研究，我們發(fā)現(xiàn)姜黃素在治療幼年小鼠腦外傷中的神經(jīng)保護(hù)和促進(jìn)神經(jīng)再生的重要作用，為今后TBI后促進(jìn)神經(jīng)再生，改善認(rèn)知能力的臨床治療效果奠定基礎(chǔ)。而關(guān)于SGZ區(qū)神經(jīng)干細(xì)胞的分化及成熟情況，我們將在以后做進(jìn)一步的研究。

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TheroleofCCMontraumaticbraininjuryinyoungmice

LIJie*，LIZhen，CHENGTian

*DepartmentofPICU，Children'sHospitalofKaifengcity，Kaifeng475000，China

ObjectiveTo detect whether CCM could protect the brain after TBI.Methods92 C57BL/6 mice were divided into 3 groups randomly：Sham group，TBI+Vehicle (NaCl) group and TBI+CCM group.Construct the weight drop model which could mimic TBI.The lesion volume，motor and cognition function，the expression of β-catenin and GSK3β protein，the cell death near injury area and the neurogenesis in SGZ area were detected in each group.ResultsCCM treatment could decrease the volume of brain injury, improve motor function, significantly increase the number of Edu positive cells, reduce the expression of GSK3β, while increasing the expression of β-catenin (P<0.05).ConclusionIn the young mice TBI model，CCM decreased the lesion volume，promoted the motor and the cognition function，activated Notch pathway indirectivity，reduced the cell death near injury area，increased the neurogenesis in SGZ area and promoted a new method to treat TBI in young mice.

Young mice；Traumatic brain injury；CCM；Neuroprotection；Nerve regeneration

10.3969/j.issn.1673-5110.2017.22.001

鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院院內(nèi)青年基金，項(xiàng)目編號(hào)：YNQN2017042

△通信作者：程田(1982—)，博士，主治醫(yī)師。研究方向：腦、脊髓神經(jīng)損傷及修復(fù)。Email：chengtianzy@163.com

R-332

A

1673-5110(2017)22-0001-04

(收稿2017-05-11)

王喜梅