電針對圍絕經(jīng)期抑郁癥大鼠海馬神經(jīng)元凋亡的影響?

荊 秦，林 卉，任 路

(遼寧中醫(yī)藥大學(xué)針灸推拿學(xué)院，沈陽 110847)

【針灸研究】

電針對圍絕經(jīng)期抑郁癥大鼠海馬神經(jīng)元凋亡的影響?

荊 秦，林 卉，任 路△

(遼寧中醫(yī)藥大學(xué)針灸推拿學(xué)院，沈陽 110847)

目的：研究電針對圍絕經(jīng)期抑郁癥大鼠海馬神經(jīng)元凋亡的影響，探討其治療抑郁癥的作用機制。方法：將48只雌性SD大鼠隨機分為空白組、模型組、藥物組和電針組各12只；采用去勢和慢性不可預(yù)見性應(yīng)激制備圍絕經(jīng)期抑郁癥大鼠模型，藥物組采用鹽酸氯米帕明灌胃，電針組選擇“百會”“三陰交”和“腎俞”。檢測陰道圖片，比較大鼠強迫游泳不動時間，采用ELISA法檢測大鼠海馬DA、5-HT和Caspase-3含量，通過尼氏染色法觀察DG區(qū)神經(jīng)細胞的病理變化。結(jié)果：與模型組比較，電針組和藥物組強迫游泳不動時間明顯縮短；海馬DA和5-HT含量升高，Caspase-3蛋白表達降低，DG區(qū)神經(jīng)細胞數(shù)目增多，胞漿內(nèi)尼氏小體總面積、積分光密度和平均黑度均升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)論：電針療法明顯改善大鼠的抑郁癥狀，阻止神經(jīng)細胞的凋亡，促進大鼠海馬神經(jīng)細胞的修復(fù)和新生。

圍絕經(jīng)期抑郁癥；神經(jīng)遞質(zhì)；Caspase-3；尼氏小體；細胞凋亡

圍絕經(jīng)期抑郁癥是在圍絕經(jīng)期發(fā)生的一種精神疾病，常發(fā)生在絕經(jīng)前5～10年，平均年齡為47.5歲。圍絕經(jīng)期出現(xiàn)不同程度的內(nèi)分泌、軀體和心理方面的變化，以情感憂郁、焦慮和緊張為主要臨床表現(xiàn)。隨著社會的發(fā)展，其發(fā)病率逐年上升，已成為生物-心理-社會醫(yī)學(xué)模式的一種典型代表。據(jù)統(tǒng)計，在發(fā)達國家抑郁癥發(fā)病率可達26%～33%[1]。目前，國內(nèi)外西醫(yī)治療圍絕經(jīng)期綜合征的主要方法是激素療法，此療法得到廣泛認可，但許多研究表明長期使用可增加乳腺癌等疾病發(fā)生的風(fēng)險[2]。近年來，中醫(yī)學(xué)者越來越關(guān)注圍絕經(jīng)期綜合征，其治療立足于整體治療，調(diào)節(jié)臟腑功能，且副作用少可以長期應(yīng)用。本實驗選用圍絕經(jīng)期抑郁癥大鼠模型，檢測海馬組織多巴胺(DA)、5-羥色胺(5-HT)和半胱氨酸天冬氨酸特異性蛋白酶-3(Caspase-3)含量，計算海馬齒狀回(DG區(qū))神經(jīng)細胞和尼氏小體數(shù)量以觀察神經(jīng)元功能狀態(tài)，從海馬神經(jīng)元凋亡這一角度探討電針對圍絕經(jīng)期抑郁癥的作用機理。

1 材料與方法

1.1 動物與分組

選用SPF級SD大鼠48只，17周齡，均為雌性，體質(zhì)量(200±20) g，由北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司提供(許可證號SCXK(京)2012-0001)，所有大鼠給予適應(yīng)性喂養(yǎng)21 d(遼寧中醫(yī)藥大學(xué)SPF級動物實驗室)。采用隨機數(shù)字表法將48只大鼠分為空白組、模型組、藥物組和電針組各12只，實驗過程中對動物的處置符合《關(guān)于善待實驗動物的指導(dǎo)性意見的規(guī)定》[3]。

1.2 試劑與儀器

試劑：鹽酸氯米帕明片25 mg/片(江蘇恩華藥業(yè)股份有限公司生產(chǎn)，生產(chǎn)批號20140104)，1%戊巴比妥鈉(40 mg/kg)，10%水合氯醛(北京索萊寶股份有限公司)，無水乙醇(天津市大茂化學(xué)試劑廠)，吉姆薩染色液(北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司)，青霉素(華北制藥股份有限公司，生產(chǎn)批號F4041108)，酶聯(lián)免疫試劑盒(ameko購于上海嵐派生物科技有限公司)，C01117尼氏染色液。

儀器：805-AⅡ型電針治療儀(廣東汕頭市醫(yī)用設(shè)備廠)，LEICA DMLS2顯微鏡(德國，Leica公司生產(chǎn))，DFC500數(shù)碼成相軟件(德國，Leica公司),酶標(biāo)儀(Gnth52010)，華佗牌針灸(0.25×25 mm，蘇州醫(yī)療用品廠有限公司)，強迫游泳系統(tǒng)(自制)。

1.3 模型制備

本實驗除空白組外，其余大鼠采用雙側(cè)卵巢切除結(jié)合慢性不可預(yù)見性應(yīng)激建立圍絕經(jīng)期抑郁癥大鼠模型。

1.3.1 卵巢切除術(shù) 大鼠以腹位置于固定臺上，用1%戊巴比妥鈉40 mg/kg腹腔注射麻醉，以最后肋骨稍后方為中心剪毛，消毒后自腰椎沿背部正中線向下做縱行切口約1～2 cm，切開皮膚和背肌，在背中線側(cè)方約1 cm處向腹腔方向分離肌肉。打開腹膜，用鑷子夾起位于腹膜下的卵巢分離脂肪團，結(jié)扎卵巢下輸卵管，切除雙側(cè)卵巢[4]。將其余組織重新恢復(fù)于腹腔內(nèi)，以80萬單位青霉素溶于5 ml生理鹽水，滴入配好的青霉素2～3滴，將腹膜與肌肉層縫合，最后縫合皮膚。

1.3.2 慢性不可預(yù)見性應(yīng)激 卵巢切除術(shù)后，全部大鼠接受21 d慢性不可預(yù)見性應(yīng)激[5]。刺激包括夾尾(用止血鉗夾住距大鼠尾尖1 cm處1 min)、熱應(yīng)(45 ℃，5 min)、冰水游泳(4 ℃，5 min)、束縛限制行動(1 h)、禁食禁水(24 h)、潮濕墊料并傾斜鼠籠(24 h)和晝夜顛倒(24 h)7種，每只大鼠每天隨機選擇1種刺激，連續(xù)2 d不能給予同樣刺激，每種刺激平均使用3次。

1.4 干預(yù)方法

空白組和模型組大鼠正常飼養(yǎng)不接受刺激。造模21 d后藥物組使用鹽酸氯米帕明灌胃，將藥片碾碎后溶于0.9%生理鹽水中，每天以20 mg/kg灌胃1次，連續(xù)28 d。電針組針刺百會、腎俞和三陰交，取穴方法參照普通高等教育“十五”國家級規(guī)劃教材《實驗針灸學(xué)》，施針后連接電針儀，毫針電極(負載 250Ω)0～18 V，選用疏密波，疏波4 Hz，密波20 Hz，以穴位皮膚肌肉輕微抽動為度，留針20 min，每天1次，連續(xù)28 d。

1.5 樣品采集

干預(yù)結(jié)束后統(tǒng)計各組大鼠情況，造模過程中大鼠共死亡8只。剩余的40只大鼠用10%水合氯醛麻醉，剝離大鼠腹主動脈使其失血死亡后，剪開大鼠顱骨放在冰盒上，切掉小腦及周邊組織，分離海馬組織，勻漿后離心10 min(3000 r/min)，吸取上清液，放入-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6 觀察指標(biāo)及檢測方法

1.6.1 陰道涂片 卵巢切除術(shù)后，第4、5、6、7、8天逐只進行陰道涂片檢查，以不出現(xiàn)動情期反應(yīng)確定卵巢摘除完全為造模成功[6]。

1.6.2 強迫游泳實驗 在安靜的室內(nèi)選用一個40 cm×60 cm黑色塑料桶，桶壁光滑，每只桶內(nèi)放入1只大鼠，加水液面距離桶沿10～15 cm，大鼠浮在水中時四肢不能借助桶壁的力量。大鼠最初表現(xiàn)為在水中游動和劇烈掙扎并試圖逃脫，逃脫失敗后將頭露出水面并肢體漂浮，不再掙扎和游泳，保持靜止不動狀態(tài)稱為“行為絕望”[7]。實驗時間為6 min，前3 min讓大鼠適應(yīng)游泳的環(huán)境，記錄后3 min內(nèi)大鼠保持靜止?fàn)顟B(tài)的時間，靜止不動時間說明大鼠的絕望程度。

1.6.3 測定含量 采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA法)檢測海馬組織DA、5-HT和Caspase-3蛋白含量，試劑盒購自上海嵐派生物科技有限公司，試劑配制和檢測操作按照試劑盒說明書進行。每只大鼠隨機選取3張海馬組織切片，觀察海馬3個不重疊連續(xù)視野(×400), 用捷達801形態(tài)學(xué)圖像分析系統(tǒng)統(tǒng)計神經(jīng)細胞數(shù)目以及神經(jīng)細胞漿內(nèi)尼氏小體總面積、積分光密度和平均黑度。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 陰道涂片結(jié)果

圖1顯示，空白組大鼠動情前期以有核上皮細胞為主；動情期以不規(guī)則的角化上皮細胞為主；動情后期不規(guī)則的角化上皮細胞、有核上皮細胞和白細胞同時可見；動情間期細胞總數(shù)較稀少，以白細胞為主。卵巢切除后，連續(xù)5 d檢測陰道涂片未見任何動情周期變化，說明大鼠去勢成功。

圖1 空白組大鼠陰道涂片染色結(jié)果

2.2 電針對大鼠強迫游泳不動時間的影響

表1顯示，造模前，各組大鼠強迫游泳時間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。造模后，各組大鼠強迫游泳不動時間明顯延長，與空白組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；治療后,藥物組和電針組強迫游泳不動時間明顯縮短，與模型組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

表1 各組大鼠強迫游泳不動時間結(jié)果比較

注：與空白組比較：*P<0.05；與模型組比較：△P<0.05

2.3 電針對大鼠海馬神經(jīng)遞質(zhì)含量的影響

表2顯示，造模后DA和5-HT含量明顯降低，與空白組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。經(jīng)過28 d治療，藥物組和電針組DA和5-HT含量明顯升高，與模型組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

表2 各組大鼠海馬神經(jīng)遞質(zhì)含量結(jié)果比較

注：與空白組比較：*P<0.05；與模型組比較：△P<0.05

2.4 電針對大鼠海馬Caspase-3蛋白表達影響

表3顯示，造模后Caspase-3蛋白表達升高，與空白組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。經(jīng)過28 d治療，藥物組和電針組Caspase-3蛋白表達均降低，且電針組Caspase-3蛋白表達低于藥物組；與模型組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

表3 各組大鼠海馬Caspase-3蛋白表達結(jié)果比較

注：與空白組比較：*P<0.05；與模型組比較：△P<0.05

2.5 電針對大鼠海馬DG區(qū)神經(jīng)元的影響

表4顯示，造模后海馬DG區(qū)神經(jīng)細胞數(shù)量減少，尼氏小體總面積、積分光密度和平均黑度均降低，與空白組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。經(jīng)過28 d治療，藥物組和電針組DG區(qū)神經(jīng)細胞數(shù)量增多，尼氏小體總面積、積分光密度和平均黑度均增加，與模型組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

表4 各組大鼠海馬DG區(qū)神經(jīng)細胞計數(shù)、尼氏小體總面積、積分光密度和平均黑度結(jié)果比較

注：與空白組比較：*P<0.05；與模型組比較:△P<0.05

3 討論

中醫(yī)古籍中無圍絕經(jīng)期抑郁癥的記載，其描述多見于“郁證”“臟躁”等病證。《靈樞·海論》曰：“腦為髓之海?！蹦I主骨生髓通腦，《類證治裁》曰:“使之神明下通于腎，腎之精華上升于腦，精能生氣，氣能生神，神定氣消?！毕忍熘渥?，上益于髓海，心神得養(yǎng)。若腎精不足，則髓?？仗摚瑢?dǎo)致腦的精神意識功能失常，出現(xiàn)抑郁等情志異常疾病。本實驗從“腎腦相濟”角度出發(fā)，選取腎俞、三陰交和百會。腎俞為背俞穴，可益腎填精；三陰交為肝、脾及腎三經(jīng)交會穴，可調(diào)理肝、脾、腎三臟，使氣血充盛；百會屬督脈，居于巔頂，為諸陽之會，三穴相合具有補腎益腦、安神解郁作用。

目前研究發(fā)現(xiàn)，抑郁癥患者存在海馬損害，且與海馬神經(jīng)細胞凋亡增加有關(guān)[8-9]。中醫(yī)所說的腦髓相當(dāng)于現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的腦內(nèi)神經(jīng)元[10]，腦內(nèi)神經(jīng)元細胞萎縮和凋亡即可造成髓海不足。海馬是邊緣系統(tǒng)的重要組成部分，內(nèi)存大量神經(jīng)干細胞及5-HT、DA等神經(jīng)遞質(zhì),對應(yīng)激最為敏感，神經(jīng)遞質(zhì)的平衡失調(diào)在情感調(diào)節(jié)活動中具有重要作用。研究表明，在應(yīng)激過程中海馬的結(jié)構(gòu)和功能產(chǎn)生損傷，可導(dǎo)致情志疾病的發(fā)生[11]。Caspase家族是直接導(dǎo)致細胞解體凋亡的蛋白酶系統(tǒng)，是多條細胞凋亡途徑的交匯點。在外來刺激下，Caspase家族起始蛋白被激活，激活后執(zhí)行蛋白水解靶蛋白，最終導(dǎo)致細胞解體凋亡，即Caspase過度表達可導(dǎo)致細胞凋亡[12]。其中，Caspase-3被稱為“死亡蛋白酶”，是細胞凋亡的執(zhí)行蛋白，與細胞凋亡關(guān)系最密切。尼氏小體廣泛存在于神經(jīng)元的胞體和樹突中，其功能是合成高級神經(jīng)活動所需的蛋白質(zhì)。神經(jīng)元在興奮傳導(dǎo)過程中，不斷消耗蛋白質(zhì)，需要尼氏小體合成新的蛋白質(zhì)以補充消耗[13]，故尼氏小體與神經(jīng)元的功能關(guān)系密切[14]。正常情況下, 尼氏小體數(shù)量多,說明神經(jīng)細胞合成蛋白質(zhì)的功能強。本文選擇檢測海馬組織中5-HT和DA的含量，通過Caspase-3蛋白表達和尼氏小體的數(shù)量形態(tài)反應(yīng)神經(jīng)元的功能活性。

本實驗采用去勢手術(shù)模擬圍絕經(jīng)期綜合征，該方法周期短、簡單易行，是公認的一種圍絕經(jīng)期綜合征造模方法，同時結(jié)合慢性不可預(yù)見性應(yīng)激制備圍絕經(jīng)期抑郁癥大鼠模型。造模后，發(fā)現(xiàn)大鼠強迫游泳的不動時間延長，提示大鼠絕望無助行為增加；檢測大鼠海馬組織中DA和5-HT含量降低，表明大鼠處于抑郁狀態(tài)，即圍絕經(jīng)期抑郁癥大鼠造模成功。檢測Caspase-3蛋白表達升高，提示抑郁通過激活下游凋亡執(zhí)行蛋白Caspase-3而產(chǎn)生細胞凋亡，觀察海馬DG區(qū)發(fā)現(xiàn)神經(jīng)細胞數(shù)量減少，尼氏小體總面積、積分光密度和平均黑度均降低，說明抑郁模型大鼠海馬細胞損傷，凋亡增多。經(jīng)藥物和電針治療后，大鼠絕望無助行為減少，海馬組織內(nèi)DA和5-HT含量升高，表明大鼠抑郁癥狀明顯改善；Caspase-3蛋白表達降低，海馬DG區(qū)神經(jīng)細胞數(shù)量增多，尼氏小體總面積、積分光密度和平均黑度均升高，說明海馬內(nèi)細胞凋亡減少，神經(jīng)元活性增強，具有類似于神經(jīng)營養(yǎng)因子的保護作用，反映出圍絕經(jīng)期抑郁癥與神經(jīng)細胞凋亡關(guān)系密切。

綜上所述，本實驗結(jié)果顯示電針療法通過抑制海馬神經(jīng)元細胞的凋亡，促進神經(jīng)元功能恢復(fù)以改善大鼠抑郁狀態(tài)，其效果優(yōu)于鹽酸氯米帕明。

[1] COHEN LS,SOARES CN,VITONIS AF,et al. Risk for new onset of depression during the menopausal transition:the Harvard study of moods and cycles [J]. Arch Gen Psychiatry， 2006,63(4):385-390.

[2] GRADY D,GEBRETSADIK T,KERLIKOWSKE K,et al. Hormone replacement therapy and endometrial cancer risk:a meta-analysis [J]. Obstetrics&Gynecology, 1995,85(2):304-313.

[3] 關(guān)于善待實驗動物的指導(dǎo)性意見[S]．中華人民共和國科學(xué)技術(shù)部， 2006:9-30 ．

[4] 劉瑞連．紫參膠囊對去卵巢大鼠更年期綜合癥模型的實驗研究[J]．中醫(yī)藥導(dǎo)報， 2009,15(6):97-98 ．

[5] WILLNER P,TOWELL A,SAMPSON D,et al．Reduction of sucrose preference by chronic mild unpredictable stress and its restoration by a tricyclic antidepressant[J]. Psychoph-armacology, 1987,93(3):358-364 ．

[6] 秦琴,劉利學(xué). 抑郁癥動物模型概述及評價[J]． 實驗動物科學(xué)， 2010,27(1): 53-59 ．

[7] PORSOLT RD,BERTIN A,JALFRE M. Behavioral despair in mice:a Primary screening test for antidepressants [J]. Arch Int Pharmacodyn Ther, 1977,229(2):327-336.

[8] 傅錦華,劉勇,王清勇,等. 舒肝解郁膠囊對抑郁模型大鼠海馬神經(jīng)元凋亡及腦組織Caspase-3蛋白表達的影響[J]. 中南大學(xué)學(xué)報醫(yī)學(xué)版， 2012,37(12): 1198-1204.

[9] LUCASSENA PJ,MEERLO P,NAYLOR AS,et al. Regulation of adult neurogenesis by stress,sleep disruption,exercise and inflammation: Implications for depression and antidepressant action[J]. European Neuropsychopharmacology， 2010,20(1): 1-17.

[10] 李林,魏海峰,張?zhí)m,等. 中醫(yī)“腎生髓,腦為髓海”現(xiàn)代生物學(xué)基礎(chǔ)探討[J]．中國中藥雜志， 2006,31(17):1397-1400 ．

[11] HAYLEY S,POULTER MO,MERALI Z,et al. The pathogenesis of clinical depression:stressor and cytokine-induced alterations of neuroplasticity[J]. Neuroscience， 2005,135(3):659-678 ．

[12] STEPIEN A, LZDEBSKA M, GRZANKA A. The types of cell death [J]. Postepy Hig Med Dosw (Online)， 2007,61(9):420-428.

[13] SAWADA K,KALAM AZAD A,SAKATA-HAGA H,et al. Striking Pattern of purkinje cell loss in cerebellum of an ataxic mutant mouse,tottering[J]. Acta Neurobiol Exp(Wars)， 2009,69(1):138-145.

[14] HEBERT AE,DASH PK. Nonredundant roles for hippocampal and entorhinal cortical plasticity in Spatial memory storage[J]. Pharmacology Biochemistry and Behavior， 2004,79(1):143-153.

EffectofElectroacupunctureonNeuronalApoptosisinTheHippocampalofPerimenopausalDepressionRat

JING Qin, LIN Hui, REN Lu△

(SchoolofAcu-moxibustionandTuina,LiaoningUniversityofTraditionalChineseMedicine，Shenyang110847，China)

Objective: To evaluate the effect of electroacupuncture(EA) therapy on neuronal apoptosis in the hippocampal of depression rat model, and investigate its pharmacological mechanisms in depression treatment. Methods: Forty-eight male SD rats were randomly divided into 4 groups: control group，model group, medicine group and EA group. The rat model was established under bilateral overiectomy combined with chronic unpredictable stress (CUMS). Medicine group was treated with clomipramine hydrochloride orally and EA group

EA therapy at Bai hui(DU20)，San yin jiao(SP6) and Shen shu(BL23).The behavior was measured by forced swimming test. We detected vaginal pictures, dopamine(DA), serotonin (5-HT) and cysteinyl aspartate specific proteinase-3 (Caspase-3) in the hippocampal by immunoassay (ELISA).Using Nissl's staining method to observe the pathological changes of nerve cells in the dentate gyrus (DG) of hippocampal. Results: Compared with model group, in the forced swimming test immobility time significantly shortened; DA and 5-HT increased,the protein level of Caspase-3 decreased, number of nerve cells, total area, integral optical density(IOD) and average blackness of nissl's body in DG area increased, the difference was statistically significant.Conclusion: Electroacupuncture therapy can reduce the depression symptoms and reverse neurocyte apoptosis in the depression rat model，help to increase hippocampal neuron generation, survival and neogenesis.

Perimenopausal depression; Neurotransmitter; Caspase-3; Niss' l body; Cell apoptosis

國家自然科學(xué)基金面上項目(81373718)-基于“腎腦相濟”理論探討電針誘導(dǎo)腦海馬內(nèi)源性神經(jīng)干細胞分化治療圍絕經(jīng)期抑郁癥的作用；中醫(yī)“腎精命火”臟象理論相關(guān)疾病與證候的研究(2010CB530401973)

荊 秦(1987-)，女，遼寧大連人，講師，醫(yī)學(xué)碩士，從事針刺機理的現(xiàn)代研究。

△通訊作者：任 路，Tel：024-31207318,E-mail: renlu2008.student@sina.com。

R245.9+7

B

1006-3250(2017)11-1607-04

2017-03-10