針刺對(duì)支氣管哮喘大鼠肺組織PI3K蛋白表達(dá)的影響?

楊金華，趙 葉，李 雙，韓君萍，虞躍躍，樊志忠，崔建美

(華北理工大學(xué)，河北 唐山 063000)

【針灸研究】

針刺對(duì)支氣管哮喘大鼠肺組織PI3K蛋白表達(dá)的影響?

楊金華，趙 葉，李 雙，韓君萍，虞躍躍，樊志忠，崔建美△

(華北理工大學(xué)，河北 唐山 063000)

目的：探討針刺對(duì)哮喘大鼠肺組織中PI3K蛋白表達(dá)的影響。方法：將40 只SPF級(jí)雄性SD大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為空白組、模型組、針刺組和阻斷劑組各10只，各組分別給予相應(yīng)干預(yù)后用生理記錄儀檢測(cè)大鼠肺功能的變化，用Western Blot法和免疫組織化學(xué)法檢測(cè)大鼠肺組織PI3K蛋白的表達(dá)。結(jié)果：呼吸功能測(cè)定顯示模型組大鼠肺順應(yīng)性降低，肺彈性阻力升高，較空白組、針刺組和阻斷劑組改變明顯；western Blot和免疫組化法檢測(cè)示模型組PI3K蛋白表達(dá)較空白組、針刺組、阻斷劑組升高；針刺后PI3K蛋白表達(dá)降低，阻斷劑組與空白組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論：針刺可降低大鼠肺組織中PI3K蛋白表達(dá)以減輕氣道重塑，改善和恢復(fù)肺功能。

針刺；哮喘；PI3K

支氣管哮喘(簡(jiǎn)稱(chēng)哮喘)是臨床常見(jiàn)的疑難病和多發(fā)病，其發(fā)病率和死亡率在全世界范圍內(nèi)呈逐漸增長(zhǎng)趨勢(shì)[1]，是危害人類(lèi)健康的常見(jiàn)疾病之一，目前全球哮喘患者約有3億人。西醫(yī)認(rèn)為，哮喘是由多種細(xì)胞(包括氣道的炎性細(xì)胞和結(jié)構(gòu)細(xì)胞)和多種細(xì)胞因子、炎性介質(zhì)參與的氣道慢性炎癥性疾病。中醫(yī)認(rèn)為，哮為痰鳴有聲，喘為短氣不足以息，哮喘發(fā)病主因痰飲伏肺而引發(fā)，病機(jī)有寒飲伏肺、痰熱壅肺、肺脾氣虛、肺腎陰虛、心腎陽(yáng)虛。對(duì)哮喘的治療西醫(yī)以糖皮質(zhì)激素抗炎為主，中醫(yī)多采用針灸、中藥等方法改善肺功能。大量研究證實(shí)，針灸能避免因服用藥物而出現(xiàn)的副作用，對(duì)治療和預(yù)防哮喘發(fā)作有重要意義，但是針灸療法發(fā)揮治療作用的機(jī)制尚不明確。本實(shí)驗(yàn)采用Western Blot法和免疫組化法觀(guān)察針刺對(duì)哮喘大鼠肺組織PI3K蛋白表達(dá)的影響，以及針刺對(duì)哮喘大鼠肺功能的影響，探討針刺治療哮喘的機(jī)制。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 主要試劑與儀器

卵蛋白粉末，PV6000通用性試劑盒，兔來(lái)源PI3K第一抗體，DAB染色試劑盒，PVDF膜，LY294002粉末，Western及IP細(xì)胞裂解液、磷酸酶抑制劑(100 mmol/L)、BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒(增強(qiáng)型)、SDS-PAGE凝膠配制試劑盒、彩色預(yù)染蛋白Marker，超敏ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒、兔來(lái)源GAPDH第一抗體，辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔二抗，Western一抗二抗去除液(強(qiáng)堿性)、一次性無(wú)菌針灸針、切片機(jī)、光學(xué)顯微鏡、低溫高速離心機(jī)R134 A、電泳、電轉(zhuǎn)儀；PRO200勻漿機(jī)、水平搖床、霧化器、生理記錄儀和自制霧化罩。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

40只雄性SPF級(jí)SD大鼠，體質(zhì)量100～130 g，購(gòu)自天津山川紅實(shí)驗(yàn)動(dòng)物公司，符合實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用標(biāo)準(zhǔn)(許可證號(hào)SYXK 2015-0038)，飼養(yǎng)于華北理工大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，環(huán)境溫度20～25 ℃，濕度60%～70%，通風(fēng)良好。正常飼料喂養(yǎng)(飼料批號(hào)SCXK-(軍)2014-0001)，飲水為超濾系統(tǒng)處理的無(wú)菌水，定期更換墊料。

2 方法

2.1 動(dòng)物分組及造模

大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d，按隨機(jī)數(shù)字表法將40只大鼠分為空白組、模型組、針刺組和阻斷劑組4組各10只。

哮喘模型制備方法[2]：模型組大鼠腹腔注射含卵蛋白(OVA)1 mg和Al(OH)310 mg的生理鹽水1 ml致敏，1周后再次腹腔注射相同成分生理鹽水1 ml加強(qiáng)致敏，加強(qiáng)致敏后第2天用1%OVA混懸液霧化吸入激發(fā)30 min，隔天1次共14次；空白組參照上述方法，但致敏和激發(fā)時(shí)均以生理鹽水代替；針刺組在模型組的基礎(chǔ)上，激發(fā)霧化1%OVA混懸液之前30 min進(jìn)行針刺操作；阻斷劑組在模型組基礎(chǔ)上，激發(fā)霧化1%OVA混懸液之前30 min霧化阻斷劑治療，1 mg/kg以阻斷PI3K/AKT通路。

2.2 治療方法

2.2.1 針刺操作 取穴：取大椎、肺俞(雙)、風(fēng)門(mén)(雙)。針刺方法：將大鼠置于高臺(tái)上進(jìn)行針刺，平補(bǔ)平瀉，每次留針20 min，每隔5 min行針1次(以200次/min捻轉(zhuǎn)速度捻針20次為行針1次)，隔日針刺1次，共針刺14次。

2.2.2 阻斷劑干預(yù) 造模期間，阻斷劑組大鼠激發(fā)霧化1%OVA混懸液之前，先霧化LY294002混懸液30 min，隔天1次共14次。LY294002混懸液配制方法：取2 mg LY294002粉末溶解于200ul的DMSO中，生理鹽水定容至6 ml，震蕩混勻。

2.3 指標(biāo)檢測(cè)方法

2.3.1 氣道阻力測(cè)定 末次霧化激發(fā)之后24 h內(nèi)測(cè)定氣道阻力，各組大鼠稱(chēng)重后，用10%的水合氯醛按3.5 ml/kg腹腔注射麻醉。打開(kāi)RM6.240生物信號(hào)采集處理系統(tǒng)，設(shè)置相應(yīng)的指標(biāo)包括頻率、速度等，將大鼠用膠布固定在鼠板上，剪開(kāi)頸部皮膚，鈍性剝離皮下組織，充分暴露氣管和食管上段，氣管食管插管并固定，氣管測(cè)呼吸，食管接壓力換能器，記錄氣道阻力R和肺順應(yīng)性C，共記錄30 min保存波形。每只大鼠圖像截取20個(gè)波段，保存數(shù)據(jù)到excel表并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。

2.3.2 免疫組化法檢測(cè)肺組織PI3K表達(dá)水平 制作肺組織切片：各組大鼠用生理記錄儀記錄完畢后打開(kāi)腹腔，腹主動(dòng)脈取血后剪開(kāi)胸腔，整體取出心肺和氣管，清除心臟、氣管、大血管和肺門(mén)周?chē)Y(jié)締組織，剝離肺生理鹽水漂洗干凈，吸水紙拭干。右肺中葉于4%多聚甲醛固定，剩余右肺于液氮保存。右肺中葉固定超過(guò)48 h后，常規(guī)石蠟包埋、切片，做成組織切片，其余右肺提取蛋白備用。

免疫組化步驟：65 ℃烤片40 min，室溫放置5 min做免疫組化。石蠟切片常規(guī)脫蠟至水，放入純水中2 min；微波修復(fù)抗原，修復(fù)液枸櫞酸鹽(自制)，高火燒開(kāi)后中火燒7 min，冷水冷卻，PBS 洗3×5 min；組織周?chē)粮桑渭舆^(guò)氧化氫，室溫下孵育15 min，PBS 洗3×5 min；滴加一抗(兔抗大鼠PI3K 單克隆抗體，工作濃度1∶200)，置濕盒內(nèi)4 ℃冰箱過(guò)夜，PBS 洗3×5 min；滴加二抗(PV6000試劑盒中B液)置濕盒內(nèi)，37 ℃恒溫箱孵育15 min，PBS 洗3×5 min；切片DAB 顯色30 s(顯微鏡下觀(guān)察)，流水充分沖洗；蘇木素復(fù)染2 min泡水，鹽酸酒精分化13 s，自來(lái)水沖洗返藍(lán)30 min;梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹(shù)膠封固，光鏡觀(guān)察、掃圖，使用Image-pro plus 6.0軟件測(cè)圖片IOD值，結(jié)果以平均光密度值(mean density簡(jiǎn)稱(chēng)MD)IOD/AREA表示。

2.3.3 Western Blot法檢測(cè)肺組織PI3K表達(dá)水平 (1)提取肺組織蛋白：取100 mg肺組織放于5 ml EP管內(nèi)，手術(shù)剪剪碎并用生理鹽水清洗肺組織內(nèi)殘留血漬，移液槍吸走生理鹽水，加入500 μl Western及IP細(xì)胞裂解液和50 μl磷酸酶抑制劑裂解組織，勻漿后4 ℃ 12000 r/min離心10 min，取15 μl上清用于BCA法測(cè)定蛋白濃度，剩余上清液取出-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

Western Blot法步驟：按照SDS-PAGE凝膠配制試劑盒說(shuō)明書(shū)制備10%的分離膠和5%的濃縮膠，注入安裝好的電泳儀內(nèi)，每組各取100 μl蛋白與25 μl的5×上樣緩沖液混合制備樣品，上樣到SDS-聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行電泳，電泳時(shí)設(shè)置電壓為80V，等到Maker跑開(kāi)后將電壓調(diào)到120 V，待檢測(cè)因子相應(yīng)分子量的位置都完全分開(kāi)后停止電泳，小心取出凝膠放入轉(zhuǎn)膜緩沖液中進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，電壓調(diào)至90 V，轉(zhuǎn)膜50 min。5%的脫脂奶粉封閉1 h后，將膜清洗干凈，分別用兔來(lái)源GAPDH(1∶5000)、PI3K(1∶1000)第一抗體孵育，4 ℃過(guò)夜。洗膜后孵育辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的山羊抗兔第二抗體，室溫1 h。ECL染色，保存圖像條帶。

約在110 kD分子量位置上出現(xiàn)陽(yáng)性條帶，即為PI3K蛋白條帶；約在37 kD分子量位置上出現(xiàn)陽(yáng)性條帶，即為GAPDH蛋白條帶。使用Image-Pro Plus 6.0軟件處理?xiàng)l帶IOD值，結(jié)果以PI3K與內(nèi)參GAPDH灰度值的比值表示。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 氣道阻力測(cè)定結(jié)果

表1顯示，模型組大鼠肺彈性阻力明顯高于空白組、針刺組和阻斷劑組，3組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P<0.05)，而空白組和針刺組、霧化阻斷劑組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P>0.05)；模型組大鼠肺順應(yīng)性明顯低于空白組、針刺組和阻斷劑組3組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P<0.05)，而空白組和針刺組、阻斷劑組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P>0.05)。

表1 大鼠氣道阻力、肺組織PI3K表達(dá)結(jié)果

注：與空白組比較：▲P<0.05；與模型組比較：△P<0.05

3.2 免疫組化法檢測(cè)肺組織PI3K蛋白表達(dá)結(jié)果

圖1表1顯示，空白組、模型組、針刺組與阻斷劑組各組圖片平均光密度值MD比較顯示，哮喘模型組平均光密度值明顯高于空白組、針刺組和阻斷劑組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.000<0.05，P=0.000<0.05，P=0.002<0.05)，而針刺組、空白組和阻斷劑組3組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.841>0.05,P=0.272>0.05，P=0.197>0.05)。

圖1 各組大鼠肺組織免疫組化PI3K表達(dá)結(jié)果(IHC×400)

3.3 Western Blot法檢測(cè)肺組織PI3K蛋白表達(dá)結(jié)果

圖2表1顯示，PI3K蛋白條帶IOD值與內(nèi)參條帶的IOD比值顯示，模型組明顯高于空白組、針刺組和阻斷劑組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P<0.05)；而針刺組與空白組、阻斷劑組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P>0.05)。

圖2 PI3K在大鼠肺組織中的表達(dá)(Western Blot)

4 討論

哮喘是由多種細(xì)胞和細(xì)胞因子參與的慢性氣道炎癥性疾病，屬于中醫(yī)學(xué)“哮病”“喘證”范疇，以反復(fù)發(fā)作的喘息、氣促、胸悶或咳嗽等為主要癥狀，其主要病理特征有慢性氣道炎癥、氣道高反應(yīng)性、黏液分泌過(guò)多和氣道重塑[3-4]。其中，氣道重塑是哮喘的典型病癥，指氣道組織結(jié)構(gòu)的病理生理改變，以上皮分離、上皮下纖維化、膠原沉積、氣道平滑肌細(xì)胞和杯狀細(xì)胞增生肥大為典型特征，是造成氣道不可逆阻塞和氣道高反應(yīng)性的重要原因，也是臨床癥狀加重以及肺功能障礙的重要原因，是頑固性哮喘的重要病理生理基礎(chǔ)[5]。

氣道重塑是哮喘發(fā)病的重要機(jī)制，而其主要原因是氣道平滑肌細(xì)胞ASMC增殖引起的氣道平滑肌和氣道壁增厚，在哮喘患者和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物哮喘模型中普遍存在A(yíng)SMC增殖。研究表明，PI3K通路在A(yíng)SMC 增殖中起主要正向調(diào)節(jié)作用，PI3K可以通過(guò)調(diào)節(jié)ASMC和氣道上皮細(xì)胞的增殖參與調(diào)節(jié)氣道重塑[6-7]。Scott 等[8]在研究中培養(yǎng)牛的ASMC，探討PI3K活性與ASMC增殖的關(guān)系，運(yùn)用PI3K抑制劑wortmannin抑制PI3K的活性，同時(shí)發(fā)現(xiàn)ASMC的DNA有絲分裂也受到抑制，結(jié)果表明PI3K的活性越高越能促進(jìn)氣道平滑肌細(xì)胞的增殖。莫碧文[9]等研究PI3K在支氣管哮喘大鼠氣道重塑中的作用，發(fā)現(xiàn)哮喘組大鼠氣道上皮細(xì)胞、氣道平滑肌細(xì)胞內(nèi)PI3K P85α的表達(dá)明顯高于正常對(duì)照組，且ASMC數(shù)量、氣道壁厚度明顯增加，表明PI3K信號(hào)通路可能通過(guò)促進(jìn)ASMC增殖參與哮喘氣道高反應(yīng)性及氣道重構(gòu)的發(fā)病過(guò)程。Krymskaya等研究PI3K對(duì)AMSC增殖的影響，運(yùn)用顯微注射法把活化的ⅠA型PI3K導(dǎo)入到ASMC內(nèi)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)氣道平滑肌細(xì)胞的DNA合成明顯增加，表明PI3K能單獨(dú)刺激ASMC DNA的合成，從而促進(jìn)ASMC的增殖[10]。

本實(shí)驗(yàn)在造模干預(yù)完成后，取右肺中葉固定包埋后制作石蠟切片，取右肺下葉提取肺組織蛋白，分別用免疫組織化學(xué)法和免疫印跡法(Western Blot)檢測(cè)大鼠肺組織PI3K的表達(dá)量。結(jié)果顯示，哮喘組大鼠肺組織內(nèi)PI3K蛋白的表達(dá)較高，明顯高于正常對(duì)照組、針刺組和阻斷劑組。同時(shí)，哮喘組大鼠的肺彈性阻力較高，肺順應(yīng)性較低，提示哮喘組大鼠出現(xiàn)氣流受限的癥狀，針刺和阻斷劑干預(yù)后，PI3K蛋白的表達(dá)降低，肺彈性阻力降低，肺順應(yīng)性升高，肺功能有所改善。由于PI3K調(diào)節(jié)ASMC的增殖參與氣道重塑，氣道的結(jié)構(gòu)發(fā)生病理性改變，氣道壁增厚，官腔變窄，故氣流受限的癥狀與PI3K蛋白的含量和活性有關(guān)，抑制PI3K的表達(dá)可以減輕哮喘的癥狀。LY294002是PI3K通路的抑制劑，作用于PI3K Pll0β催化亞單位，可抑制PI3K的表達(dá)，也可以通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)與AT P結(jié)合區(qū)的結(jié)合抑制PI3K途徑，且能明顯抑制磷脂酞肌醇轉(zhuǎn)換，阻斷PI3K途徑。從本實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析，針刺組PI3K的表達(dá)明顯降低接近阻斷劑組，針刺組大鼠的肺功能接近正常組，可見(jiàn)針刺能阻斷PI3K通路，從而改善哮喘患者的肺功能，減輕哮喘癥狀。

[1] DINSMOOR R. The rising tide of asthma: A look at what is causing this epidemic[J]. Asthma Mag, 2005, 10(1): 14.

[2] LIN Z R, WANG W G, YAN H M, et al. A method to induce asthma model by OVA in 129Sv mice strain [J]. Chinese Journal of Cell Biology, 2011, 33(9): 964- 968.

[3] NAKAGOME K, NAGATA M. Pathogenesis of airway inflammation in bronchial asthma[J]. Auris Nasus Larynx, 2011, 38(5): 555563.

[4] HOLTAGE ST. Pathogenesis of asthma[J]. Clin Exp Allergy, 2008, 38(6): 872-897.

[5] RHEE C K, KANG J Y, PARK C K, et al. Effect of nilotinib on airway remodeling in a murine model of chronic asthma[J]. Exp Lung Res, 2014, 40(5): 199-210.

[6] LIM D H, CHO J Y, SONG D J, et al. PI3K gamma-deficient mice have reduced levels of allergen-induced eosinophilic inflammation and airway remodeling[J]. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol, 2009, 296: 210-219.

[7] YADAV U C, NAURA A S, AGUILERA-AGUIRRE L, et al. Aldose reductase inhibition prevents allergic airway remodeling through PI3K/AKT /GSK3β pathway in mice[J]. PLoS One, 2013, 8(2): 57442.

[8] SCOTT P H, BELHAM C M, AL-HAFIDH J, et al. A regulatory Role for cAMP in Phosphatidylinositol 3-Kinase/p70 Ribosomal S6 Kinase-Mediated DNA Synthesis in Platelet-Derived-Growth-Factor-Stimulated Bovine Airway Smooth Muscle Cells[J]. Biochem J, 1996, 318(3): 965-971.

[9] 莫碧文, 王昌明, 張珍祥, 等. 磷脂酰肌醇3激酶促進(jìn)支氣管哮喘大鼠氣道平滑肌細(xì)胞增殖[J]. 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與臨床, 2006, 26(5), 489-493.

[10] KRYMSKAYA V P, AMMIT A J, HOFFMAN R K, et al. Activation of class IA PI3K stimulates DNA synthesis in human airway smooth muscle cells[J]. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol, 2001, 280(5): 1009-1018.

RegulationofAcupunctureonPI3KExpressioninTheLungTissuesofAsthmaRats

YANG Jin-hua, ZHAO Ye, LI Shuang, HAN Jun-ping, YU Yue-yue, FAN Zhi-zhong, CUI Jian-mei△

(NorthChinaUniversityofScienceandTechnology,Hebei，Tangshan063000China)

Objective： To examine the mechanism of acupuncture on PI3K expression in the lung tissues of asthmatic rats. Methods： 40 SPF male SD rats were randomly divided into 4 groups with 10 rats in each group. Groups were given accordingly interventions. Physiological recorder is used to inspect the pulmonary function changes,western blot and immunohistochemical method were employed to observe the protein expression of PI3K in the lung tissue of rats. Results:The lung compliance of the asthma model group are decreased with the pulmonary elastic resistance increased comparing with the blank group,acupuncture group and blocking group.Western Blot and immunohistochemical method, The protein expression of PI3K was higher in asthmatic model group than other groups. but there was no statistical difference among the blocking group,the acupuncture group and the blank group. Conclusion:Acupuncture can reduce the protein expression of PI3K in lung tissue of rats to reduce airway remodeling and improve lung function.

Acupuncture; Bronchial asthma; PI3K

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81303046)-ERK1/2通路對(duì)哮喘大鼠氣道重塑、氣道炎癥的調(diào)控與針刺干預(yù)的分子機(jī)制研究

楊金華(1989-)，女，河北秦皇島人，醫(yī)學(xué)碩士，從事針灸治療免疫系統(tǒng)疾病的機(jī)制研究。

△通訊作者：崔建美(1978-)，女，河北保定人，教授，醫(yī)學(xué)博士，從事針灸治療免疫系統(tǒng)疾病的機(jī)制研究，Tel:0315-3725189，E-mail:cjm2188@126.com。

R 245.9

B

1006-3250(2017)11-1602-03

2017-04-17