瘢痕灸肝俞穴、足三里穴對(duì)原發(fā)性肝癌大鼠Wnt10b、Wnt3a表達(dá)的影響?

王 穎，趙萬(wàn)爽，張曉露，李 迪，胡曉龍，李夢(mèng)迪，陳 金，王琪格

(1. 遼寧中醫(yī)藥大學(xué)針灸推拿學(xué)院， 沈陽(yáng) 110847； 2. 遼寧中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床學(xué)院， 沈陽(yáng) 110847)

【針灸研究】

瘢痕灸肝俞穴、足三里穴對(duì)原發(fā)性肝癌大鼠Wnt10b、Wnt3a表達(dá)的影響?

王 穎1，趙萬(wàn)爽1，張曉露1，李 迪1，胡曉龍1，李夢(mèng)迪1，陳 金1，王琪格2

(1. 遼寧中醫(yī)藥大學(xué)針灸推拿學(xué)院， 沈陽(yáng) 110847； 2. 遼寧中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床學(xué)院， 沈陽(yáng) 110847)

目的：探討瘢痕灸肝俞穴、足三里穴對(duì)原發(fā)性肝癌大鼠Wnt/β-catenin信號(hào)傳導(dǎo)通路中Wnt3a、Wnt10b表達(dá)的影響。方法：健康雄性Wistar大鼠隨機(jī)分成對(duì)照組、模型組、阿霉素組、肝俞組、足三里組，通過(guò)注射二乙基亞硝胺制備肝癌模型，用RT-PCR檢測(cè)各組Wnt3a、Wnt10b表達(dá)量，觀察肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)和形態(tài)變化。結(jié)果：與對(duì)照組比較，模型組、阿霉素組、肝俞組和足三里組Wnt3a、Wnt10b表達(dá)量均顯著升高；與模型組比較，阿霉素組、肝俞組和足三里組表達(dá)量降低；與阿霉素組比較，肝俞組、足三里組表達(dá)幅度下降；與肝俞組比較，足三里組表達(dá)量升高。鏡下觀察可見(jiàn)，對(duì)照組為正常肝細(xì)胞，模型組細(xì)胞有假小葉形成，阿霉素組有明顯增生灶，肝俞組細(xì)胞核多形、核漿部分消失，足三里組纖維樣變。結(jié)論：瘢痕灸肝俞穴、足三里穴對(duì)原發(fā)性肝癌大鼠有治療效果，其機(jī)制可能是通過(guò)調(diào)節(jié)Wnt/β-catenin信號(hào)傳導(dǎo)通路中Wnt3a、Wnt10b的表達(dá)量來(lái)實(shí)現(xiàn)的。

瘢痕灸；肝俞；足三里；原發(fā)性肝癌；Wnt3a；Wnt10b

肝癌是臨床常見(jiàn)疾病，在我國(guó)有很高的發(fā)病率，每年約有15萬(wàn)人死于本病，占全世界肝癌死亡人數(shù)的45%[1]。且肝癌發(fā)病時(shí)不易被察覺(jué)，多數(shù)人確診時(shí)已經(jīng)處于晚期[2]。手術(shù)是目前治療肝癌最有用的方法，但對(duì)于多數(shù)中晚期肝癌患者來(lái)說(shuō)并不適用[3]。

相關(guān)研究表明，33%～67%的腫瘤中可發(fā)現(xiàn)Wnt/β-catenin信號(hào)通路，其中原發(fā)性肝癌(Hepatic Carcinoma，HCC)中約占30%～70%，且通路中Wnt3a、Wnt10b的表達(dá)與肝癌關(guān)系密切[4]。而瘢痕灸通過(guò)對(duì)穴位所在區(qū)域造成一定的灼傷，引起機(jī)體炎癥反應(yīng)，進(jìn)而刺激相關(guān)臟腑產(chǎn)生免疫調(diào)節(jié)，能在一定程度上抑制腫瘤生長(zhǎng)[5]。因此本實(shí)驗(yàn)采用注射二乙基亞硝胺復(fù)制大鼠肝癌模型，通過(guò)PT-PCR技術(shù)，對(duì)Wnt/β-catenin信號(hào)傳導(dǎo)通路中Wnt3a、Wnt10b基因進(jìn)行分析，深入研究瘢痕灸肝俞穴、足三里穴對(duì)HCC的治療作用及可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

健康雄性Wistar大鼠60只，體質(zhì)量(180±20)g，購(gòu)自遼寧長(zhǎng)生生物技術(shù)有限公司，許可證號(hào)SCXH(遼)2010-0001，使用許可證號(hào)SYXH(遼)2013-0009。大鼠6只每籠，在室溫(24±1)℃、相對(duì)濕度(50±5)%條件下自由攝取食物和水源，2 d更換1次墊料。

1.2 試劑與儀器

1.2.1 主要試劑 DEN(sigma公司，批號(hào)049k1613v)；阿霉素(索萊寶公司，批號(hào)313A028)；PCR擴(kuò)增試劑盒(海靈生物公司，批號(hào)AK2601)；反轉(zhuǎn)錄試劑盒(海靈生物公司，批號(hào)AK5705)；艾絨(河南南陽(yáng)市水木榮春生物技術(shù)有限公司)；水合氯醛(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)20110509)；伊紅染色液、蘇木素染色液(Leagene公司，批號(hào)1030A15)。

1.2.2 主要儀器 生物安全柜(上海力申科技有限公司)；熒光顯微鏡(日本Olympus公司)；紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(北京普析通用儀器有限公司)；PCR反轉(zhuǎn)儀(Applied biosystems公司)；擴(kuò)增儀(Applied biosystems公司)；凝膠成像分析儀(北京市六一儀器廠)；組織破碎儀(IKA公司)；脫水機(jī)(浙江省金華市科迪儀器設(shè)備有限公司)；包埋機(jī)、攤片機(jī)、烘片機(jī)(Leica公司)。

1.3 模型制備、分組及干預(yù)方法

隨機(jī)抽取12只大鼠作為對(duì)照組，其余大鼠均給予腹腔注射二乙基亞硝胺(diethylnitrosamine, DEN)(50 mg/kg)，1～4周，每周2次；5～14周，每周1次[6]。將造模成功的48只大鼠隨機(jī)分成模型組、阿霉素組、肝俞組和足三里組各12只。阿霉素組給予阿霉素腹腔注射(2 mg/kg)，每周2次共2周；肝俞組和足三里組分別在其相應(yīng)穴位進(jìn)行瘢痕灸，其穴位定位參考《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》[7]。瘢痕灸方法：將艾絨做成麥粒型艾炷(5 mg/壯)，雙側(cè)穴位同時(shí)施灸，每壯艾柱使其燃盡為止,每穴12壯。

1.4 實(shí)驗(yàn)取材

瘢痕灸2周后用水合氯醛對(duì)大鼠進(jìn)行麻醉，取各組大鼠相同部位的肝中葉下緣肝臟組織(1 cm×1cm×0.3 cm)進(jìn)行石蠟包埋切片，伊紅染色液、蘇木素染色液染色后鏡下觀察肝細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化。

1.5 RT-PCR檢測(cè)

1.5.1 肝臟組織中總RNA用Trizol法裂解提取，-80 ℃下進(jìn)行保存。

1.5.2 反轉(zhuǎn)錄 Wnt10b正向引物：5′-GTAATCACGACATGGACTTTGGAG-3′；Wnt10b反向引物：3′-GCACTTCCGCTTCAGGGTTTT-5′。Wnt3a正向引物：5′-GGACCTATTCCATTCCCAGA-3′；Wnt3a反向引物：3′- GCACTTCCGCTTCAGGGTTTT-5′。取DEPC處理過(guò)的200 μL PCR管，分別加入總RNA 2 μL,隨機(jī)引物1 μL，無(wú)RNA 酶水混合均勻，放置PCR儀器上70 ℃進(jìn)行5 min，然后取出放置冰上進(jìn)行冷卻，依次加入試劑5×RT Buffer 4 μL、10 mM dNTP 2 μL、M-MuLV逆轉(zhuǎn)錄酶200 u,然后加入DEPC處理水使總體積為20 μL。條件37 ℃，時(shí)間為15 min循環(huán)6次，85 ℃ 進(jìn)行5 s，4℃ 進(jìn)行7 s。

1.5.3 PCR反應(yīng) 取PCR管分別加入RNase Free dH2O 10 μL，Wnt10b引物上游20 pmol，Wnt10b引物下游20 pmol，Wnt3a引物上游20 pmol，Wnt3a引物下游20 pmol，2×PCR Master Mix12.5 μL于PCR儀器中進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)。反應(yīng)條件如下：95 ℃ 預(yù)變性2 min；95 ℃ 變性30 s；60 ℃ 退火30 s，72 ℃延伸45 s，共40個(gè)循環(huán)；72 ℃最終延伸1 min。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠肝臟組織形態(tài)變化

圖1顯示，鏡下觀察可見(jiàn)對(duì)照組肝細(xì)胞形態(tài)正常，肝竇和肝小梁有序排列；模型組大鼠肝細(xì)胞為空泡樣變，細(xì)胞核多形，肝細(xì)胞形態(tài)多樣化，形成腫瘤灶，有典型的假小葉形成；阿霉素組的肝細(xì)胞形成明顯的增生灶，有空泡樣改變，細(xì)胞排列無(wú)序，肝細(xì)胞纖維樣變化，部分卵圓形細(xì)胞變成方形，細(xì)胞形態(tài)發(fā)生變化，且部分細(xì)胞出現(xiàn)核異質(zhì)變；足三里組的大鼠肝細(xì)胞呈纖維樣的變化，細(xì)胞核多形；肝俞組出現(xiàn)大鼠肝細(xì)胞部分空泡樣變，細(xì)胞核多形，核漿部分消失，出現(xiàn)部分纖維化，但較足三里組程度較輕。

2.2 各組大鼠肝細(xì)胞中Wnt10b、Wnt3a表達(dá)量的變化

表1顯示，與對(duì)照組比較，模型組、阿霉素組、肝俞組和足三里組Wnt3a、Wnt10b表達(dá)量明顯升高(P<0.01)；與模型組比較，阿霉素組、肝俞組、足三里組2指標(biāo)的表達(dá)量相對(duì)降低(P<0.01)；與阿霉素組比較，肝俞組、足三里組表達(dá)量明顯降低(P<0.05)；與肝俞組比較，足三里組Wnt3a、Wnt10b表達(dá)上調(diào)(P<0.05)。

表1 各組大鼠肝細(xì)胞中Wnt10b、Wnt3a表達(dá)量變化

注：與對(duì)照組比較:##P<0.01；與模型組比較:△△P<0.01；與肝俞組比較:○P<0.05

3 討論

Wnt信號(hào)通路有非經(jīng)典Wnt通路和經(jīng)典Wnt通路2種。目前較受關(guān)注的是經(jīng)典Wnt通路，即Wnt/β-catenin信號(hào)通路。該通路有Wnt分泌蛋白、低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白5/6(low density lipopro-tein receptor related protein 5 /6,LRP5 /6)、軸蛋白(Axin)、結(jié)直腸腺瘤性息肉(adenomatous polyposis coli,APC)、卷曲蛋白(Frizzleds,Frz)、糖原合酶激酶-3β(glycogen syntase kinase-3β，GSK-3β)、 細(xì)胞核內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子T細(xì)胞因子(T cell factor,TCF) /淋巴樣增強(qiáng)因子(lymphoid enhancing factor,LEF)、β-連環(huán)蛋白(β-catenin)等[8]。Wnt/β-catenin信號(hào)通路在正常細(xì)胞的傳導(dǎo)途徑中是不被激活的，表現(xiàn)為β-catenin定位于核內(nèi)并保持穩(wěn)定的狀態(tài)[9]。但是Wnt分泌蛋白高表達(dá)時(shí)會(huì)與LRP5 /6 受體及Frz受體結(jié)合，Wnt通路的穩(wěn)定狀態(tài)被打破進(jìn)而引起癌癥的發(fā)生發(fā)展[10]。Wnt分泌蛋白包括Wnt1、Wnt3a、Wnt8a、Wnt10b等[11]。張錫峰等發(fā)現(xiàn)，Wnt3a使肝干細(xì)胞抗凋亡，導(dǎo)致肝干細(xì)胞發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化，引起HCC的發(fā)生[12]。而且有研究顯示，Wnt3a在HCC中的表達(dá)明顯上調(diào)[13]；Yuzugullu H等發(fā)現(xiàn)，在HCC組織中Wnt10b表達(dá)上調(diào)且高于對(duì)應(yīng)的癌旁組織，認(rèn)為HCC的發(fā)生可能與Wnt10b的異?；钴S有很大關(guān)系[14-15]，因此調(diào)節(jié)Wnt3a、Wnt10b的異常表達(dá)可以作為治療HCC的新策略。

本實(shí)驗(yàn)瘢痕灸足三里穴、肝俞穴治療HCC，通過(guò)觀察對(duì)Wnt/β-catenin通路相關(guān)基因表達(dá)量的影響和肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)與形態(tài)變化判斷瘢痕灸對(duì)HCC的治療效果及比較兩穴治療的效果差異。足三里穴是足陽(yáng)明胃經(jīng)的經(jīng)穴、下合穴，具有扶正祛邪、防病保健的作用，為補(bǔ)后天之脾土、滋先天之腎水、益氣血生化之源的要穴[16]?！叭粢玻锍２桓伞?，即是指瘢痕灸足三里穴具有強(qiáng)身健體、增強(qiáng)機(jī)體正氣以達(dá)到抵抗邪氣的功效。《素問(wèn)·咳論》云：“治臟者治其俞。”《難經(jīng)·六十七難》曰：“陰病行陽(yáng)，陽(yáng)病行陰，故令募在陰，俞在陽(yáng)。”因此，肝俞穴作為背俞穴之一，可以快速、直接、有效地激發(fā)肝臟經(jīng)氣，達(dá)到扶助正氣、破除邪氣的效果。已有研究證實(shí)，直接灸肝俞穴可以抑制肝癌細(xì)胞的生長(zhǎng)，加速其凋亡，對(duì)延緩HCC癌前病變有重要作用[17]。《素問(wèn)·長(zhǎng)刺節(jié)論》記載：“迫臟刺背俞也”，說(shuō)明背俞穴對(duì)其相對(duì)應(yīng)臟腑疾病有特異的治療效果。本實(shí)驗(yàn)觀察到，瘢痕灸肝俞穴后，Wnt3a、Wnt10b基因的表達(dá)量較足三里穴下調(diào)幅度更大，肝俞組肝細(xì)胞的組織結(jié)構(gòu)和形態(tài)好于足三里組，說(shuō)明瘢痕灸肝俞穴的療效優(yōu)于足三里穴，認(rèn)為瘢痕灸肝俞穴較足三里穴對(duì)HCC的治療效果更加明顯。

《醫(yī)學(xué)入門》中記載了“凡病藥之不及，針之不到，必須灸之”的論述，瘢痕灸最早見(jiàn)于《針灸甲乙經(jīng)》，相比較其他灸法有刺激性較強(qiáng)、作用更顯著的特點(diǎn)。有研究顯示，瘢痕灸可以提高荷瘤小鼠T淋巴細(xì)胞的應(yīng)答能力，使其對(duì)腫瘤壞死因子有更強(qiáng)的殺傷作用[18]。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為“正氣存內(nèi)，邪不可干”，說(shuō)的正氣就是現(xiàn)在人們普遍認(rèn)為的免疫功能。癌癥的發(fā)生和轉(zhuǎn)移與免疫系統(tǒng)功能下降密切相關(guān)，而瘢痕灸可以增強(qiáng)機(jī)體的免疫功能，因此其有明顯抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖的效果，可以延長(zhǎng)患者生存時(shí)間[19-20]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，肝俞組、足三里組和阿霉素組的大鼠肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)和形態(tài)好于模型組，且Wnt3a和Wnt10b表達(dá)量明顯下調(diào)，說(shuō)明3組均有治療HCC的效果，進(jìn)一步說(shuō)明瘢痕灸對(duì)腫瘤有抑制作用；相比較阿霉素組，瘢痕灸肝俞組和足三里組Wnt3a和Wnt10b均表達(dá)下調(diào)，表明瘢痕灸肝俞組和足三里組的效果優(yōu)于阿霉素組，其機(jī)制可能是通過(guò)調(diào)節(jié)Wnt/β-catenin信號(hào)傳導(dǎo)通路中Wnt3a和Wnt10b的表達(dá)量引起的。

[1] 杜經(jīng)麗,韋立新.原發(fā)性肝細(xì)胞癌的診斷及相關(guān)基因研究進(jìn)展[J].武警醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2011，20(12):1004-1008.

[2] JI EUN LEE, SI HYUN BAE, JONG YOUNG CHOI, et al. Epirubicin, Cisplatin, 5-FU combination chemotherapy in sorafenib-refractory metastatic hepatocellular carcinoma[J]. World J Gastroenterol, 2014, 20(1): 235.

[3] 陸再英,鐘南山.內(nèi)科學(xué)[M].7版.北京:人民衛(wèi)生出版社,2008:457-462.

[4] KIM M,LEE HC,TSEDENSODNOM O,et al.Functional interaction between Wnt3 and Frizzled-7 leads to activation of the Wnt/beta-catenin signaling pathway in hepatocellular carcinoma cells[J]. J Hepatol, 2008,48(5): 780-791.

[5] 楊一玲，關(guān)玲.麥粒灸輔助治療進(jìn)展期胃癌回顧性分析[J].針灸臨床雜志，2014，30(6)：1-4.

[6] 宋藝君，劉曉婷，馮麗莉，等.二乙基亞硝胺誘發(fā)肝癌前病變大鼠模型的建立[J].世界華人消化雜志，2012，20(27):2562-2569.

[7] 李忠仁，方劍喬.實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)[M].北京:中國(guó)中醫(yī)藥出版社，2007:244.

[8] 周威，熊奇如.Wnt/β-catenin 信號(hào)通路重要分子及靶基因在原發(fā)性肝癌中的作用機(jī)制[J].肝膽外科雜志，2013，21(2)：150-155.

[9] 鄭勤，徐瀚峰.Wnt/β-catenin 信號(hào)通路在肝癌中的研究進(jìn)展[J].國(guó)際消化病雜志，2010，30(2)：76-78.

[10] 李偉，謝肖俊，陳盛林，等.Wnt/β-catenin信號(hào)通路在肝癌發(fā)生中的分子機(jī)制研究[J].中國(guó)現(xiàn)代手術(shù)學(xué)雜志，2014，18(1)：3-8.

[11] 劉佳，張明娟，朱琴梅，等.Wnt/β-catenin 信號(hào)通路在肝癌發(fā)病機(jī)制中作用的研究[J].胃腸病學(xué)和肝病學(xué)雜志，2014，23(9)：994-997.

[12] 張錫峰，胡代曦，盧永良，等.Wnt3a過(guò)表達(dá)對(duì)小鼠胚胎肝干細(xì)胞凋亡的抑制作用[J].細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志，2013，29(12)：1277-1280.

[13] YOSHIKAWA, MATSUBARAK,ZHOUXA, et al.Wnt10b Functional dualism：beta-catenin/tcf-dependent growth promotion or independent supperssion with deregulated expression in cancer[J]. Molbiocell, 2007, 18(11)：4292-4303.

[14] YUZUGULLU H, BEN HAI K, OZTURK N, et al. Canonical wnt signaling is antagonized by noncanonical wnt5a in hepatocellular carcinoma cells [J]. Mol cancer, 2009(8): 90.

[15] 浮鳳州，范曉麗，孫莉，等.Wnt10b在肝細(xì)胞肝癌中的表達(dá)[J].重慶醫(yī)學(xué)，2014， 43(28): 3753-3756.

[16] 石學(xué)敏.針灸學(xué)[M].2版.北京：中國(guó)中醫(yī)藥出版社，2007:45.

[17] 柳楊，侯中偉，盧俊，等.麥粒灸“肝俞”對(duì)原發(fā)性肝癌癌前病變模型大鼠肝功能的影響[J].中國(guó)針灸，2015，35(7):702-706.

[18] 吳皓,水野海騰,呂誠(chéng),等.瘢痕灸對(duì)荷瘤及化療小鼠腸道淋巴結(jié)及固有層淋巴細(xì)胞亞群的影響[J].中國(guó)中醫(yī)藥信息雜志，2009，16(7):31-37.

[19] 付玲，萬(wàn)茜，徐天舒.麥粒灸對(duì)腫瘤患者生活質(zhì)量及其外周血IL-10表達(dá)的影響[J].上海針灸雜志，2015，34(4):305-309.

[20] 洪金標(biāo)，彭宏，易受鄉(xiāng).艾灸對(duì)機(jī)體產(chǎn)生的多重效應(yīng)及其機(jī)理探討[J].中華中醫(yī)藥學(xué)刊，2010，28(2):277-281.

EffectsofScarringMoxibustionGanshu-pointandZusanli-pointonExpressionofWnt10BandWnt3AofHepaticCarcinomaRats

WANG Ying1, ZHAO Wan-shuang1, ZHANG Xiao-lu1, LI Di1, HU Xiao-long1, LI Meng-di1, CHEN Jin1, WANG Qi-ge2

(1.DepartmentofAcupunctureandMoxibustioncolleage,LiaoningUniversityofTraditionalChineseMedicine,Shenyang110847,China; 2.FirstClinicalCollegeofTraditionalChineseMedicine,Shenyang110847,China)

Objective: To explore the scarring moxibustion Ganshu-point(BL18), Zusanli-point(ST36) on expression of Wnt3a, Wnt10b of Wnt / β-catenin signaling pathway of hepatic carcinoma rats. Methods: Healthy male Wistar rats were randomly divided into Control group, Model group, Adriamycin group, Ganshu-point(BL18) group, Zusanli-point(ST36) group. Liver cancer models were prepared by injection of diethylnitrosamine. The expression of Wnt3a and Wnt10b was detected by RT-PCR and the structure and morphological changes of hepatocytes were observed. Results: Compared with the control group, the expression of Wnt10b and Wnt3a in Model group, Zusanli-point(ST36) group, Ganshu-point(BL18) group and Adriamycin group increased significantly; Compared with the Model group, Adriamycin group, Ganshu-point(BL18) group and Zusanli-point(ST36) group expression reduced; Compared with Adriamycin group, the expression of Zusanli-point(ST36) group and Ganshu-point(BL18) group decreased obviously; Compared with the Zusanli-point(ST36) group, Ganshu-point(BL18) group expression was significantly increased. Visible were observed: Control group of normal liver tissue; The cells in the model group had false lobular formation; Adriamycin group was significantly hyperplastic lesions; In the Ganshu-point(BL18) group, the nucleus became more pleomorphic and the nuclear plasma fraction disappeared；Fibrous changes in the Zusanli-point(ST36) group. Conclusions: Scarring moxibustion Ganshu-point(BL18), Zusanli-point(ST36) for hepatic carcinomain rats have therapeutic effects. The mechanism may be by regulating the Wnt / β-catenin signaling pathway Wnt3a, Wnt10b expression to achieve.

Scarred Moxibustion; Ganshu-point; Zusanli-point; Hepatic carcinoma; Wnt3a; Wnt10b

遼寧省科學(xué)技術(shù)基金資助項(xiàng)目(2014020047)-瘢痕灸治療原發(fā)性肝癌

王 穎(1964-)，男，遼寧阜新人，副教授，醫(yī)學(xué)碩士，從事針灸機(jī)理研究。

R245.81

B

1006-3250(2017)11-1611-04

2017-04-23