草甘膦對(duì)斑馬魚生殖發(fā)育的毒性研究進(jìn)展

杜太峰，鄭樹楷，黃苑妮，包 冕，吳庫生*

( 汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院公共衛(wèi)生與預(yù)防醫(yī)學(xué)教研室，廣東 汕頭 515041 )

草甘膦是一種廣泛應(yīng)用的廣譜除草劑，主要針對(duì)小范圍的生物體，特別是綠色植物。植物通過莖葉快速吸收使得雜草能有效根除，尤其對(duì)于一年生的闊葉雜草，因此被廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)、園藝、森林種植等方面[1-2]。近年來，草甘膦的使用量逐漸增加，估計(jì)每年全球的需求量為50萬噸[3]，噴灑、大雨沖刷、農(nóng)田灌溉都直接導(dǎo)致了水體受到了不同程度的污染[4]。研究發(fā)現(xiàn)其存在于黏性土壤中的半衰期長達(dá)151 d，存在于肥沃土壤中的半衰期為10 d左右，在水體中的半衰期大約為45～60 d[5]，草甘膦半衰期的延長及降解的緩慢增加了其對(duì)生物體毒性與環(huán)境污染的風(fēng)險(xiǎn)[6]。

斑馬魚屬于熱帶硬骨魚，由于其產(chǎn)卵量大、易收集、胚胎具有光學(xué)透明性、受精率較高等優(yōu)勢(shì)，可清楚觀察其發(fā)育的任何階段，在毒理學(xué)研究中可方便評(píng)價(jià)毒性終點(diǎn)；同時(shí)，由于其與人類基因組具有87%的相似度，與人類有相似的信號(hào)傳導(dǎo)通路，在解剖學(xué)與分子水平上均已證明與哺乳動(dòng)物相似，所以斑馬魚毒性結(jié)果可大部分適用人類[7]。目前，斑馬魚已成為研究毒理學(xué)的新型毒性評(píng)價(jià)模型[8]。草甘膦等除草劑對(duì)水體的污染極為常見，對(duì)水生生物造成多種毒性影響[9]，研究其毒性作用及可能機(jī)制顯得尤為重要。本文對(duì)目前草甘膦對(duì)斑馬魚造成的生殖與發(fā)育毒性研究結(jié)果作一綜述。

1 生殖毒性

1.1 草甘膦對(duì)斑馬魚精子質(zhì)量的影響

精子與卵細(xì)胞的質(zhì)量是決定生殖能力的一項(xiàng)重要因素，Yousef等[10]研究表明，雄兔慢性暴露于草甘膦將導(dǎo)致其精子濃度降低，異常的精細(xì)胞和精細(xì)胞死亡數(shù)將增加。這可能與草甘膦直接影響精子發(fā)生和間接影響下丘腦-垂體-睪丸軸分泌激素有關(guān)。Lopes等[11]將斑馬魚暴露于草甘膦(5 、10 mg/L)24和96 h后，切除睪丸，分析精子質(zhì)量，與對(duì)照組相比，暴露處理損害了精子DNA的完整性，破壞了線粒體膜的完整性及其功能，降低了精子活力，從而大大降低了斑馬魚的生殖力。Cavalli等[12]研究將大鼠暴露于草甘膦[12]，發(fā)現(xiàn)其繁殖力下降，可能是由于暴露誘導(dǎo)了支持細(xì)胞(Sertoli cells)的凋亡，從而抑制了精子發(fā)生。Clair等[13]研究表明，大鼠暴露于高劑量草甘膦(10 000 mg/L)，引起睪丸間質(zhì)細(xì)胞的凋亡；暴露于低濃度(1 mg/L)時(shí)干擾了內(nèi)分泌作用，表現(xiàn)為睪酮值下降了35%。

Uren等[14]將斑馬魚暴露于草甘膦(0.01、0.5、10 mg/L)21 d，在10 mg/L時(shí)檢測(cè)到睪丸中hsd3b2、cat、sod1表達(dá)上調(diào)。草甘膦暴露影響了睪丸的類固醇激素合成，使得部分基因表達(dá)上調(diào)，從而對(duì)雄性的生殖功能產(chǎn)生了不利影響。

1.2 草甘膦對(duì)斑馬魚卵巢功能的影響

卵巢作為雌性動(dòng)物的生殖器官，主要功能是產(chǎn)生卵細(xì)胞與類固醇激素，雌性斑馬魚產(chǎn)卵量也直接跟其生殖能力相關(guān)。Armiliato等[15]將斑馬魚卵巢體外暴露于草甘膦(65 μg/L)15 d，結(jié)果表明形態(tài)學(xué)上與對(duì)照相比無明顯變化；其卵母細(xì)胞直徑增加，這可能與類固醇生成因子-1(SF-1)的表達(dá)有關(guān)；同時(shí)，卵巢超微結(jié)構(gòu)出現(xiàn)異常，發(fā)現(xiàn)有同心膜和髓磷脂樣結(jié)構(gòu)，草甘膦對(duì)卵母細(xì)胞產(chǎn)生的這些不利影響直接影響到其繁殖功能。

Uren等[14]將斑馬魚暴露于草甘膦，發(fā)現(xiàn)其卵巢中cyp19a1與ers1基 因表 達(dá)顯著上調(diào)。 cy p19a1上調(diào)可能原因是，由于草甘膦暴露引起類固醇激素的機(jī)制反饋，潛在的抑制了芳香化酶的轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，增加了芳香酶以維持類固醇激素的比率， er s1上調(diào)是卵巢為維持雌激素通路產(chǎn)生一種代償機(jī)制的結(jié)果；基因表達(dá)上調(diào)間接影響卵巢的功能，減少了產(chǎn)卵量。

2 發(fā)育毒性

2.1 草甘膦對(duì)斑馬魚體細(xì)胞的影響

Goulart等[16]研究將斑馬魚暴露于草甘膦(32.5、65、130 μg/L)，檢測(cè)到該除草劑引起了細(xì)胞毒性，直接影響到細(xì)胞膜的完整性和線粒體的功能[17]。由于線粒體功能受到抑制作用，導(dǎo)致了ATP不能合成，呼吸活動(dòng)減少。暴露前6 h線粒體活性下降，這是由于其自身克服除草劑引起的細(xì)胞毒性作用[18]。同時(shí)，暴露也破壞了溶酶體的功能，減少了其對(duì)機(jī)體的保護(hù)作用，更加重了細(xì)胞毒性效應(yīng)。

活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)是需氧細(xì)胞在代謝過程中產(chǎn)生的，高濃度的ROS可通過細(xì)胞氧化應(yīng)激反應(yīng)誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡。Sulukan 等[19]將4 hpf(hours post fertilization)的斑馬魚暴露于草甘膦(1、5、10、100 mg/L)96 h，檢測(cè)到高濃度時(shí)鰓區(qū)ROS產(chǎn)生增加。低劑量暴露時(shí)，產(chǎn)生的ROS減少或無明顯改變[20]。ROS的產(chǎn)生可能是碳酸酐酶對(duì)二氧化碳減少產(chǎn)生抑制作用的結(jié)果，大量的ROS誘發(fā)了細(xì)胞凋亡，最終造成了斑馬魚多器官畸形，比如心包水腫、脊柱彎曲等。

2.2 草甘膦對(duì)斑馬魚形態(tài)學(xué)的影響

在商業(yè)殺蟲劑中，草甘膦是從上世紀(jì)70年代就開始廣泛應(yīng)用的一種除草劑[21]。由于草甘膦應(yīng)用的廣泛性，研究發(fā)現(xiàn)其存在地表水長達(dá)60多天，對(duì)水體生物產(chǎn)生了潛在的毒性作用，對(duì)斑馬魚的形態(tài)損害大多發(fā)生在發(fā)育的早期階段[4]。 Bridi等[22]將幼苗期的斑馬魚暴露于草甘膦(0、0.01、0.065、0.5 mg/L)96 h，7 dpf(days post fertilization)時(shí)觀察到其體長明顯縮短，暴露于高濃度(0.5 mg/L)時(shí)，其眼距也明顯縮短。Zhang等[23]將4 dpf的斑馬魚暴露于草甘膦(0～400 mg/L)，濃度越高，導(dǎo)致其體長變短、眼睛變小、頭部縮小等形態(tài)異常，當(dāng)濃度達(dá)到600 mg/L時(shí)，胚胎無法存活。De等[24]將斑馬魚胚胎暴露于不同配方的除草劑(草甘膦AKB480、農(nóng)達(dá))，分別觀察其24、48、72、96 h的發(fā)育毒性，發(fā)現(xiàn)胚胎與幼苗的存活率隨著時(shí)間的增加而降低，孵化率也相應(yīng)降低。

形態(tài)學(xué)的改變與相關(guān)基因的表達(dá)有著密切的關(guān)系，n t l是斑馬魚在神經(jīng)胚期形成脊索的關(guān)鍵基因，krox20是參與脊椎動(dòng)物前腦分節(jié)的一種轉(zhuǎn)錄因子，s h h是控制斑馬魚背中線結(jié)構(gòu)表達(dá)的一個(gè)基因。Zhang等[23]研究斑馬魚(0.75 hpf)暴露于草甘膦(0、0.1、1、10、100 mg/L)，10 hpf時(shí)，與對(duì)照相比，通過原位雜交技術(shù)檢測(cè)到 n tl基因表達(dá)減少，說明了脊索結(jié)構(gòu)的缺陷，從而導(dǎo)致了其體長的縮短；13 hpf時(shí)檢測(cè)到暴露對(duì) sh h基因無明顯影響，krox20的表達(dá)隨著暴露濃度的增加發(fā)生了改變，擾亂了斑馬魚菱腦原節(jié)的形成與大小。

2.3 草甘膦對(duì)斑馬魚心臟發(fā)育的影響

心臟主要由心肌構(gòu)成，其強(qiáng)有力的收縮功能滿足了全身的供血，是脊椎動(dòng)物的重要器官之一，影響心臟的正常發(fā)育因素有很多，有機(jī)磷農(nóng)藥就是其中之一。Roy等[25]研究將斑馬魚(5 hpf)暴露于草甘膦(50 μg/mL)到48 hpf，觀察到其心房心室結(jié)構(gòu)異常、心臟循環(huán)無規(guī)律、內(nèi)臟逆位、心率降低。肌細(xì)胞增強(qiáng)因子-2(Mef2)對(duì)心肌細(xì)胞的調(diào)控和分化起著關(guān)鍵性的作用[26]，暴露后導(dǎo)致的心血管缺陷可能是Mef2的表達(dá)缺失以至心肌細(xì)胞異常分化的結(jié)果。Yusof等[27]發(fā)現(xiàn) 草 甘膦暴露導(dǎo)致斑馬魚心率增加，中間趨于緩和最后下降，這可能是面對(duì)應(yīng)激慢慢適應(yīng)環(huán)境的結(jié)果；但有研究[28]表明 草 甘膦暴露導(dǎo)致心動(dòng)過速，可能原因是應(yīng)激反應(yīng)及腎上腺素增加。探究發(fā)現(xiàn) 草 甘膦低劑量長時(shí)間暴露導(dǎo)致心率加快，短時(shí)間急性暴露通常導(dǎo)致心率下降。

2.4 草甘膦對(duì)斑馬魚大腦發(fā)育的影響

大腦作為中樞神經(jīng)中最大最復(fù)雜的結(jié)構(gòu)，是調(diào)節(jié)機(jī)體功能的器官，是意識(shí)、學(xué)習(xí)、記憶、運(yùn)動(dòng)等高級(jí)神經(jīng)活動(dòng)的物質(zhì)基礎(chǔ)。研究斑馬魚大腦發(fā)育，選擇5～24 h的窗口期實(shí)施暴露，在此期間斑馬魚經(jīng)過了分節(jié)、體節(jié)發(fā)生、神經(jīng)胚形成三個(gè)階段，可更好的反映其大腦發(fā)育變化[29]。 乙 酰膽堿酯酶(AChE)參與了體內(nèi)細(xì)胞的發(fā)育與成熟，同時(shí)具有促進(jìn)神經(jīng)元發(fā)育的功能。有研究發(fā)現(xiàn)，斑馬魚暴露于草甘膦導(dǎo)致了A ChE基因在大腦和肌肉表達(dá)的下調(diào)，從而影響了其正常發(fā)育[20，30]。Roy等[4]對(duì)斑馬魚(5～24 hpf)暴露于草甘膦(50 μg/mL)，觀察到前腦與中腦發(fā)育缺陷、腦室輪廓的損失，后腦無發(fā)育毒性，存在前腦與中腦的基因pax2、 otx2、 pax6、 ephA4表達(dá)減少，而該基因表達(dá)與大腦發(fā)育的關(guān)聯(lián)，還有待于進(jìn)一步研究。

3 展望

綜上所述，草甘膦及其制劑對(duì)生物性腺、心臟及大腦發(fā)育等產(chǎn)生了不同程度的毒性作用。目前，針對(duì)其產(chǎn)生的毒性作用機(jī)制還處于初級(jí)階段，未來利用斑馬魚等模式生物開展更深入的研究，探索相關(guān)機(jī)制極為重要。另外，由于食物鏈的富集作用和生物放大作用，草甘膦的廣泛使用對(duì)食物鏈頂端的生物體產(chǎn)生的危害逐漸引起了越來越多的人關(guān)注，因此，有必要對(duì)接觸人群展開監(jiān)測(cè)，對(duì)促進(jìn)全民健康有著深遠(yuǎn)的意義。