煙草糖酯SSR分子標(biāo)記篩選及輔助育種應(yīng)用

陳彪　陳銘　李洋洋　屈亞芳　程立銳　楊愛國(guó)　胡日生　劉旦　羅成剛　向世鵬　馮全福　常愛霞

摘? 要：為明確與糖酯緊密連鎖的SSR分子標(biāo)記在煙草實(shí)際育種工作中的可用性，加快烤煙糖酯遺傳改良進(jìn)程，本研究利用聚丙烯酰胺凝膠電泳技術(shù)和GC-MS檢測(cè)技術(shù)，以不同遺傳背景的5個(gè)煙草種質(zhì)以及192份重組自交系遺傳群體為試驗(yàn)材料，對(duì)5個(gè)SSR分子標(biāo)記開展了篩選和驗(yàn)證研究。結(jié)果表明，5個(gè)分子標(biāo)記中，PT20315、PT30354兩個(gè)分子標(biāo)記在不同遺傳背景中多態(tài)性穩(wěn)定，并且其多態(tài)性條帶與糖酯表型差異的對(duì)應(yīng)性較好;在重組自交系群體中，兩個(gè)分子標(biāo)記鑒定的基因型與糖酯表型的一致率分別為93.75%和90.58%，可用于高糖酯煙草分子輔助育種中。目前，利用兩個(gè)分子標(biāo)記輔助選擇，已經(jīng)定向改良獲得高糖酯K326等新品系材料。

關(guān)鍵詞：煙草;糖酯;分子標(biāo)記;輔助育種

中圖分類號(hào)：S572.03?? ???????文章編號(hào)：1007-5119（2019）03-0008-08????? DOI：10.13496/j.issn.1007-5119.2019.03.002

In order to clarify the usability of SSR molecular markers closely linked to sugar esters in the actual breeding of tobacco， and to accelerate the genetic improvement of flue-cured tobacco sugar esters， in this study， using polyacrylamide gel electrophoresis and GC-MS detection techniques， 5 tobacco germplasms with different genetic backgrounds and a genetic population with 192 recombinant inbred lines were used as experimental materials for screening and testing of 5 SSR molecular markers. The results showed that， among the 5 molecular markers， the polymorphisms of 2 molecular markers PT20315 and PT30354 were stable in different genetic backgrounds， and the correspondence between their polymorphic bands and the phenotypic difference of sugar esters were better. In the recombinant inbred line population， the consistency rate between the genotypes identified by the 2 molecular markers and phenotypes of sugar esters reached 93.75% and 90.58% respectively. The 2 molecular markers could be used in the molecular-assisted breeding of high-sugar ester tobacco. Currently， using of the 2 molecular markers in assisted selection has directionally improved new lineage materials such as high sugar ester K326 etc.

： tobacco; sugar ester; molecular marker; assisted breeding

煙草糖酯是煙葉表面化學(xué)重要組成成分之一，由煙草腺毛的腺頭特異合成，是腺毛分泌物中除二萜外，含量最豐富的成分。糖酯具有抗蟲、抗菌、抗氧化、防止老化等多種生物功能，也是煙草重要的致香前體物質(zhì)，其降解產(chǎn)生的小分子揮發(fā)性脂肪酸，對(duì)煙葉香氣品質(zhì)具有重要貢獻(xiàn)。

此外，糖酯類化合物也是煙用香料的重要組成部分之一，加到煙絲上可起到增香保潤(rùn)作用，該類化合物作為揮發(fā)性香味成分前體物已經(jīng)得到國(guó)內(nèi)外煙用香精香料行業(yè)研究人員的認(rèn)可和重視。因此，通過多種途徑提高煙葉表面糖酯含量，對(duì)改善煙葉香吃味品質(zhì)及提高煙葉抗性均具有重要意義。在眾多途徑中，培育高糖酯含量的新品種是最經(jīng)濟(jì)有效的手段。

已有研究表明，栽培煙草中的糖酯類型主要是蔗糖四酯，一般分為6個(gè)型（蔗糖酯Ⅰ-Ⅵ型，其中Ⅲ-Ⅵ型蔗糖酯含有3-甲基戊酰，稱為BMVSE），不同類型煙草中蔗糖四酯的類型及含量有較大差異?？緹煛桌邿?、馬里蘭煙中一般含有少量的Ⅰ-Ⅱ型蔗糖酯以及痕量（或幾乎沒有）的Ⅲ-Ⅵ型蔗糖酯，而大多數(shù)香料煙和許多雪茄煙品種中含有大量的BMVSE。遺傳研究表明，煙草BMVSE的遺傳受單顯性基因控制。2010年，VONTIMITTA等利用SSR分子標(biāo)記對(duì)調(diào)控BMVSE的基因進(jìn)行了遺傳定位，結(jié)果表明，有2個(gè)SSR標(biāo)記PT30209、PT20315與BMVSE完全共分離，PT30354與PT52061+PT61362分布于基因兩側(cè)，緊密連鎖，遺傳距離分別為3.9 cM與1.3 cM。長(zhǎng)期以來，煙草育種中提高糖酯含量的研究，多是靠氣相色譜法（GC-MS）等儀器檢測(cè)，由于費(fèi)用較高、前處理過程復(fù)雜繁瑣，大大限制了含有多類型糖酯的優(yōu)良中間世代材料的選擇進(jìn)度。這些BMVSE分子標(biāo)記的獲得，為煙草BMVSE糖酯分子標(biāo)記輔助育種奠定了很好的基礎(chǔ)。但是，這些分子標(biāo)記主要是基于雪茄煙品種Beinhart-1000和烤煙品種Hicks雜交構(gòu)建的加倍單倍體遺傳群體獲得，是否能在其他品種的雜交分離群體中輔助選擇利用、哪些標(biāo)記能夠利用等，目前尚未知。

當(dāng)前烤煙主栽品種中均不含BMVSE，利用連續(xù)回交的手段向這些品種中快速定向?qū)隑MVSE，是豐富其表面分泌物糖酯類型和含量、改善其香氣品質(zhì)、培育特色高香氣烤煙品種的重要途徑之一。為加快BMVSE向主栽烤煙品種中的定向改良進(jìn)程，

本研究對(duì)5個(gè)BMVSE分子標(biāo)記進(jìn)行了篩選和驗(yàn)證，從中篩選出了帶型清晰、種質(zhì)間差異明顯的標(biāo)記，用于BMVSE向烤煙定向回交轉(zhuǎn)移時(shí)輔助選擇。本研究結(jié)果對(duì)多類型糖酯種質(zhì)資源的鑒定，以及向烤煙、白肋煙、馬里蘭煙等不含BMVSE的煙草類型中快速定向轉(zhuǎn)移BMVSE，均具有很好的借鑒意義。

1? 材料與方法

1.1? 供試材料

供試烤煙品種K326、紅花大金元和小黃金1025，香料煙Samsun和雪茄煙Beinhart 1000-1等由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所煙草種質(zhì)資源中期庫提供。雪茄煙Beinhart 1000-1和小黃金1025為親本構(gòu)建的RIL群體（F7）以及K326、紅花大金元等主栽品種定向改良遺傳群體材料，均由課題組創(chuàng)建獲得。

本研究2016年完成分子標(biāo)記初篩和RIL群體驗(yàn)證;2016—2018年，多態(tài)性分子標(biāo)記應(yīng)用于課題組創(chuàng)建的BMVSE定向轉(zhuǎn)移K326和紅花大金元回交群體，技術(shù)線路如圖1。

1.2? 試驗(yàn)方法

1.2.1? DNA提取? 參照CHEN等的SLS法分別提取供試材料鮮煙葉全基因組DNA。

1.2.2? PCR反應(yīng)? PCR反應(yīng)總體系為10 μL。其中，2×EasyTaq PCR SuperMix（+dye）（北京全式金生物技術(shù)有限公司）5 μL，10 pmol/μL正、反向引物各1 μL，100 ng/μL DNA模板1 μL，ddHO 2 μL。PCR擴(kuò)增程序?yàn)?4 ℃預(yù)變性5 min;94 ℃ 30 s，55℃ 30 s，72 ℃ 30 s，35次循環(huán);最后72 ℃延伸8 min，4 ℃保存。

1.2.3? 電泳檢測(cè)（銀染法）? PCR產(chǎn)物擴(kuò)增結(jié)束72 h內(nèi)，取1 μL PCR產(chǎn)物上樣于8%非變性聚丙烯酰胺凝膠單泳道，選用寶日醫(yī)生物技術(shù)（北京）有限公司DL系列500 bp DNA Markers作為參照，1×TBE電泳緩沖液電泳分離。電泳結(jié)束后，參照任民等改良的NaOH銀染方法快速顯影。試驗(yàn)所用電泳儀器為DYY-12C型（北京市六一儀器廠），儀器運(yùn)行參數(shù)為恒電壓1200 V，電流200 mA，功率60 W，電泳1 h 50 min。

1.2.4? 鮮煙葉表面分泌物提取及硅烷化處理方法? 鮮煙葉表面分泌物提取及硅烷化處理方法參照屈亞芳等的方法進(jìn)行。

1.2.5? GC-MS聯(lián)用儀鑒定蔗糖酯的方法? GC-MS

聯(lián)用儀參數(shù)：色譜柱是Rtx-5MS（30 m×0.25 μm×0.25

μm）;進(jìn)樣口溫度265 ℃;離子源溫度280 ℃;接口溫度280 ℃;柱箱溫度165 ℃;傳輸線溫度280 ℃;升溫程序：從165 ℃開始，以4 ℃/min升至280 ℃，保持25 min;進(jìn)樣量1 μL;分流比15：1;柱頭壓100 kPa;采集方式Scan;檢索譜庫：NIST8S。

本文蔗糖酯定性分析參照文獻(xiàn)[18，23-24]中不同類型蔗糖酯的特征離子進(jìn)行（表1）。

2? 結(jié)? 果

2.1? 分子標(biāo)記篩選

本試驗(yàn)選擇與III-VI型糖酯共分離的PT20315、PT30209以及緊密連鎖的PT30354、PT52061、PT61362 SSR分子標(biāo)記作為候選引物，以含有I-II型糖酯的烤煙品種K326、紅花大金元、小黃金1025，以及含有I-VI型糖酯（除含有I-II型糖酯外，還含有III-VI型糖酯，即BMVSE）的香料煙Samsun、雪茄煙Beinhart1000-1等5個(gè)種質(zhì)作為引物初篩的供試材料，驗(yàn)證5個(gè)候選引物在不同類型蔗糖酯種質(zhì)材料間是否具有多態(tài)性。試驗(yàn)結(jié)果如圖2。由圖2可知，分子標(biāo)記PT20315、PT30354的引物在烤煙品種K326、紅花大金元、小黃金1025三品種中

擴(kuò)增出的DNA片段，通過電泳帶型一致，在香料煙Samsun、雪茄煙Beinhart1000-1中擴(kuò)增出的DNA片段，在兩品種內(nèi)電泳帶型一致，但與3個(gè)烤煙品種的帶型間具有明顯的多態(tài)性，并且兩個(gè)標(biāo)記在不同種質(zhì)間電泳帶型清晰可辨，結(jié)果穩(wěn)定，符合選擇預(yù)期;分子標(biāo)記PT30209、PT52061在不同種質(zhì)間擴(kuò)增結(jié)果雖然具有多態(tài)性，但PT30209存在擴(kuò)增效果不穩(wěn)定（部分種質(zhì)無條帶）、PT52061多態(tài)性結(jié)果與目標(biāo)性狀糖酯類型對(duì)應(yīng)性較差的情況;PT61362電泳結(jié)果各種質(zhì)間多態(tài)性不明顯。研究結(jié)果初步表明，PT30209、PT52061、PT61362三個(gè)分子標(biāo)記不宜作為III-VI型糖酯的輔助篩選標(biāo)記利用，PT20315、PT30354兩個(gè)標(biāo)記可以作為III-VI型糖酯輔助篩選標(biāo)記進(jìn)一步驗(yàn)證利用。

2.2? PT20315和PT30354的群體驗(yàn)證

為進(jìn)一步驗(yàn)證篩選的PT20315、PT30354兩個(gè)標(biāo)記的可用性，一方面，利用兩個(gè)分子標(biāo)記，對(duì)Beinhart1000-1和小黃金1025為親本構(gòu)建的192份RIL群體材料進(jìn)行了基因型鑒定。將RIL群體中各材料的電泳帶型分別與含多類型糖酯的Beinhart1000-1和不含多類型糖酯的小黃金1025的電泳帶型比較，帶型相同的材料表示基因型相同（圖3）。由圖3可見，篩選的PT20315、PT30354兩個(gè)分子標(biāo)記在RIL遺傳群體中具有穩(wěn)定、清晰的帶型和多態(tài)性，能夠準(zhǔn)確鑒定區(qū)分群體中不同材料的基因型。

另一方面，提取RIL群體中各材料的鮮煙葉表面分泌物，利用GC-MS表型檢測(cè)技術(shù)，鑒定了RIL群體各材料的糖酯表型，統(tǒng)計(jì)了群體中各材料基因型和糖酯表型的一致性（表2）。由表2可見，利用兩個(gè)分子標(biāo)記鑒定的群體材料的基因型，與利用GC-MS技術(shù)檢測(cè)的群體材料的表型，其一致率均在90%以上，說明兩個(gè)分子標(biāo)記可以有效用于高糖酯煙草輔助育種中。

2.3? 多態(tài)性分子標(biāo)記輔助育種應(yīng)用

當(dāng)前，烤煙主栽品種中，糖酯類型較少，含量相對(duì)較低。為了加快多類型糖酯向烤煙主栽品種中的快速定向轉(zhuǎn)移，以當(dāng)前生產(chǎn)主栽品種K326、紅花大金元等為定向改良對(duì)象，在分子標(biāo)記輔助創(chuàng)建

的BC4、BC5代回交世代中，均已篩選到含有目標(biāo)分子標(biāo)記且綜合性狀優(yōu)良的定向改良種質(zhì)材料。入選的優(yōu)良材料，經(jīng)表型鑒定確認(rèn)，已經(jīng)導(dǎo)入多類型糖酯。其中，烤煙K326定向改良前、后糖酯表型檢測(cè)結(jié)果如圖4。由圖4可知，改良前K326中僅檢測(cè)到I、II型糖酯存在，而改良后K326中除檢測(cè)到I、II型糖酯外，也檢測(cè)到豐富的III、Ⅳ、V型糖酯存在。

利用分子標(biāo)記輔助對(duì)主栽品種糖酯定向改良研究的有效性，進(jìn)一步證明了研究篩選的兩個(gè)分子標(biāo)記在煙草育種中的可用性。同時(shí)，也證明，利用糖酯分子標(biāo)記輔助選擇，可以加快煙草糖酯定向改良的進(jìn)程。

3? 討? 論

糖酯是一類重要的植物表面化合物，在許多茄科植物如番茄、馬鈴薯、煙草、曼陀羅、矮牽牛等的腺毛分泌物中發(fā)現(xiàn)，而非茄科植物表面卻很少發(fā)現(xiàn)。因其具有抗蟲、抗菌、抗氧化等多種性能，目前，在番茄和馬鈴薯等茄科植物的育種工作中，提高糖酯含量已經(jīng)成為一個(gè)重要育種目標(biāo)。在煙草中，糖酯除具有以上生物功能外，還是煙草重要的致香前體物，也是當(dāng)前卷煙加香加料的重要成分。隨著中式卷煙的發(fā)展和新型煙草制品的開發(fā)，卷煙工業(yè)越來越需求香氣質(zhì)好、香氣量足、香氣風(fēng)格特色突出的高端卷煙原料。經(jīng)定向改良的高糖酯紅花大金元品種的煙葉樣品，感官評(píng)價(jià)各項(xiàng)主要指標(biāo)均優(yōu)于對(duì)照紅花大金元，進(jìn)一步說明糖酯對(duì)煙葉香氣品質(zhì)的重要貢獻(xiàn)。因此，提高煙葉糖酯含量，特別是培育高糖酯含量的煙草品種，已經(jīng)受到煙草工農(nóng)業(yè)科技工作者的重視。

烤煙主栽品種中一般不含BMVSE，糖酯類型較少、含量較低，為加快高糖酯含量品種篩選和培育工作，本研究對(duì)VONTIMITTA等定位獲得的與BMVSE基因連鎖的5個(gè)SSR標(biāo)記，利用不同遺傳背景種質(zhì)，進(jìn)一步開展了篩選驗(yàn)證研究。研究結(jié)果表明，PT20315、PT30354兩個(gè)分子標(biāo)記在不同遺傳背景中多態(tài)性穩(wěn)定，并且電泳條帶清晰，利用兩個(gè)分子標(biāo)記輔助高糖酯表型篩選，準(zhǔn)確率達(dá)到90%以上，可以有效用于高糖酯煙草分子輔助育種中。在這兩個(gè)分子標(biāo)記輔助育種應(yīng)用過程中我們也發(fā)現(xiàn)，雖然文獻(xiàn)[17]報(bào)道PT20315與糖酯目標(biāo)性狀表現(xiàn)共分離，PT30354與目標(biāo)性狀連鎖距離稍遠(yuǎn)，但在本研究的有些分離群體中，PT20315分子標(biāo)記比PT30354更易打破與目標(biāo)性狀的連鎖，說明不同遺傳背景中，分子標(biāo)記所在染色體位點(diǎn)的重組率可能有所不同。分子標(biāo)記PT30209在不同種質(zhì)間存在擴(kuò)增效果稍差、部分種質(zhì)無條帶，PT52061多態(tài)性結(jié)果與目標(biāo)性狀糖酯類型對(duì)應(yīng)性較差，PT61362電泳結(jié)果各種質(zhì)間多態(tài)性不明顯等情況。原因可能是本研究所用種質(zhì)與VONTIMITTA等所用種質(zhì)遺傳背景不同，經(jīng)長(zhǎng)期進(jìn)化或育種選擇馴化，這些分子標(biāo)記在不同遺傳背景中對(duì)應(yīng)位點(diǎn)的序列可能有差異所致。

本研究中篩到的兩個(gè)可用標(biāo)記，雖然準(zhǔn)確率達(dá)到90%以上，但仍然存在少部分植株雖含有分子標(biāo)記，但卻不含目標(biāo)性狀的情況。原因可能是分子標(biāo)記受環(huán)境和遺傳背景等因素影響，導(dǎo)致分子標(biāo)記所檢測(cè)材料的基因型結(jié)果與糖酯表型存在差異。所以，在實(shí)際的育種工作中，在雜交、回交早期分離世代，可以利用分子標(biāo)記輔助選擇，對(duì)高世代入選的目標(biāo)株系，還需結(jié)合表型鑒定進(jìn)一步確認(rèn)。根據(jù)遺傳研究結(jié)果，栽培煙草BMVSE糖酯類型受單基因調(diào)控，所以，深入發(fā)掘糖酯類型差異調(diào)控基因并開發(fā)其功能分子標(biāo)記，是進(jìn)一步提高糖酯分子輔助育種準(zhǔn)確性的重要途徑。此外，遺傳研究表明，

BMVSE調(diào)控基因與煙草表面重要致香前體物順-冷杉醇的調(diào)控基因緊密連鎖，并且已有研究表明，順-冷杉醇也是特香型烤煙（如大白筋599，革新三號(hào)等）的重要致香物質(zhì)基礎(chǔ)。因此，利用本文篩選的分子標(biāo)記輔助糖酯篩選的同時(shí)，也將提高糖酯和順-冷杉醇同時(shí)篩選的可能性。這將對(duì)利用分子標(biāo)記加快特色高香氣品種的培育工作具有重要意義。

4? 結(jié)? 論

PT20315等5個(gè)糖酯連鎖SSR分子標(biāo)記在不同遺傳背景的煙草種質(zhì)的篩選和驗(yàn)證結(jié)果表明，PT20315、PT30354兩個(gè)分子標(biāo)記在不同遺傳背景中多態(tài)性穩(wěn)定，電泳條帶清晰，并且其多態(tài)性條帶與糖酯表型差異的對(duì)應(yīng)性較好。在重組自交系群體中，兩個(gè)分子標(biāo)記輔助高糖酯表型篩選的準(zhǔn)確率均達(dá)到90%以上，可以有效用于高糖酯煙草分子輔助育種中。分子標(biāo)記PT30209在不同種質(zhì)間擴(kuò)增效果稍差、PT52061多態(tài)性結(jié)果與糖酯表型對(duì)應(yīng)性較差、PT61362在各種質(zhì)間多態(tài)性不明顯，這3個(gè)標(biāo)記不宜在糖酯分子標(biāo)記輔助育種中利用。利用PT20315、PT30354兩個(gè)分子標(biāo)記輔助選擇，已獲得定向改良高糖酯K326新品系。

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