不同部位雪茄煙葉晾制過(guò)程中多酚、色素及相關(guān)酶活性的變化

盧紹浩　張嘉雯　趙喆　鐘秋　宋朝鵬　張瑞娜　趙銘欽

摘? 要：為明確晾制過(guò)程中雪茄煙葉多酚類物質(zhì)和質(zhì)體色素的降解規(guī)律以及相關(guān)酶活性的動(dòng)態(tài)變化，以德雪1號(hào)為試驗(yàn)材料，研究了不同部位煙葉晾制期間多酚類物質(zhì)、質(zhì)體色素及相關(guān)酶活性的變化規(guī)律，并進(jìn)行了相關(guān)分析。結(jié)果表明，不同部位雪茄煙葉中多酚類物質(zhì)含量主要表現(xiàn)為中部葉>下部葉>上部葉，其中各部位綠原酸含量均呈下降趨勢(shì)，而蕓香苷和莨菪亭含量均呈現(xiàn)單峰曲線。各部位質(zhì)體色素含量隨著晾制過(guò)程的推進(jìn)而逐漸降低，整體表現(xiàn)為上部葉>中部葉>下部葉。各部位煙葉中脂氧合酶、苯丙氨酸解氨酶、多酚氧化酶、過(guò)氧化物酶等酶活性均呈先增后降趨勢(shì)。相關(guān)分析表明，晾制期間各部位多酚氧化酶活性與多酚、色素含量呈正相關(guān)，且與綠原酸和β-胡蘿卜素達(dá)到顯著水平;苯丙氨酸解氨酶活性與多酚、色素含量呈負(fù)相關(guān)，且與綠原酸達(dá)到顯著水平。過(guò)氧化物酶與脂氧合酶、苯丙氨酸解氨酶、多酚氧化酶均呈顯著正相關(guān)，因此在晾制過(guò)程中合理調(diào)控各類酶活性，可以控制多酚類物質(zhì)及質(zhì)體色素含量，有利于提高雪茄煙葉調(diào)制特性。

關(guān)鍵詞：雪茄煙葉;晾制;多酚類物質(zhì);質(zhì)體色素;酶活性

中圖分類號(hào)：S572.03????????? 文章編號(hào)：1007-5119（2019）03-0084-07????? DOI：10.13496/j.issn.1007-5119.2019.03.012

： In order to clarify the degradation of polyphenols and plastid pigments and the changes of related enzyme activities in cigar leaves during air-curing， taking Dexue No.1 as the test material， the changes of polyphenols， plastid pigments and related enzyme activities in leaves at different positions of cigar tobacco were studied， and the correlation analyses were carried out. The results showed that the polyphenol contents showed cutters > lower leaf > upper leaf at different positions of cigar plants. The chlorogenic acid content showed a downward trend at all positions， but rutin and scopoletin showed a single peak curve. The plastid pigment gradually decreased with the air-curing process， and it showed upper leaf > cutters > lower leaf. The activities of lipoxygenase， phenylalanine ammonia lyase， polyphenol oxidase and peroxidase at different positions of cigar first increased and then decreased. Correlation analysis showed that polyphenol oxidase activity was positively correlated with polyphenols and pigment content at different positions during air-curing， and significant correlations with chlorogenic acid and β-carotene were also observed. The negative correlations were observed between phenylalanine ammonia lyase activity and polyphenols and pigments， and the significant correlations with chlorogenic acid. Significant positive correlations were observed between peroxidase and lipoxygenase， phenylalanine ammonia lyase and polyphenol oxidase. Therefore， reasonable regulation of enzyme activities during air-curing can control the content of polyphenols and plastid pigments， which is beneficial to improvement of the curing characteristics of cigar.

cigar leaves; air-curing; polyphenols; plastid pigments;?enzyme activities

雪茄煙是一種特殊的煙草制品，具有勁頭大，焦油量少，香氣豐滿，對(duì)人體危害較小的特點(diǎn)。煙草調(diào)制是煙葉生產(chǎn)過(guò)程中的關(guān)鍵步驟，煙草中多酚類化合物在調(diào)制過(guò)程中通過(guò)酶促棕色化反應(yīng)形成醌類等棕色色素使煙葉顏色轉(zhuǎn)深，進(jìn)而影響煙葉的色澤和香氣。質(zhì)體色素主要有葉綠素和類胡蘿卜素，在調(diào)制過(guò)程中葉綠素未充分降解，會(huì)導(dǎo)致調(diào)制后煙葉的外觀質(zhì)量不良且內(nèi)在品質(zhì)不佳，類胡蘿卜素降解產(chǎn)生的萜烯類物質(zhì)以及葉綠素降解產(chǎn)生的新植二烯均是影響煙葉香氣質(zhì)量的重要化合物。因此，在煙草調(diào)制過(guò)程中，多酚類物質(zhì)和質(zhì)體色素的轉(zhuǎn)化對(duì)煙葉外觀質(zhì)量和內(nèi)在品質(zhì)有著重要意義。王昇等研究表明，煙草中的多酚可以反映煙草的遺傳特性和生長(zhǎng)發(fā)育狀態(tài)，并對(duì)煙草的顏色、煙氣的質(zhì)量和生理強(qiáng)度起著明顯的作用，并且煙草中多酚含量與煙葉品質(zhì)呈正相關(guān)。石盼盼等研究表明，煙草中類胡蘿卜素的降解會(huì)形成多種香味物質(zhì)，這些香味物質(zhì)閾值相對(duì)較低、刺激性較小，對(duì)煙葉香氣貢獻(xiàn)率大。前人對(duì)調(diào)制過(guò)程中烤煙多酚類物質(zhì)和質(zhì)體色素變化規(guī)律及品質(zhì)關(guān)系進(jìn)行了大量研究，然而對(duì)于雪茄煙這一特色類型煙葉多酚類物質(zhì)和質(zhì)體色素的相關(guān)研究甚少。本文研究了不同部位雪茄煙葉在晾制過(guò)程中多酚類物質(zhì)、質(zhì)體色素含量及其相關(guān)酶活性的動(dòng)態(tài)變化，旨在探討雪茄煙葉中多酚類物質(zhì)及質(zhì)體色素在晾制過(guò)程中的降解機(jī)理，為調(diào)控雪茄煙葉中多酚類物質(zhì)及質(zhì)體色素含量提供理論依據(jù)。

1? 材料與方法

1.1? 試驗(yàn)概況

試驗(yàn)于2018年在四川省什邡市師古鎮(zhèn)大泉坑村雪茄煙葉生產(chǎn)基地進(jìn)行，供試品種為德雪1號(hào)，試驗(yàn)田土壤pH值5.8～7.0，有機(jī)質(zhì)含量3.01 g/kg，速效鉀含量89 mg/kg，速效磷含量38.1 mg/kg，速效氮含量120 mg/kg，按照當(dāng)?shù)匮┣褵熑~生產(chǎn)技術(shù)規(guī)范進(jìn)行統(tǒng)一管理。

1.2? 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

采收時(shí)選取大田長(zhǎng)勢(shì)基本一致、葉片成熟度相對(duì)一致的煙株進(jìn)行晾制，各部位采摘標(biāo)準(zhǔn)見表1。將采摘后的煙葉編桿掛入晾房（長(zhǎng)×寬×高=16 m×20 m×6 m），掛桿長(zhǎng)150 cm，桿距15 cm，每桿掛30～32片煙葉，避光晾制，參照鄒宇航等的方法進(jìn)行晾制過(guò)程中溫濕度設(shè)定。雪茄煙葉晾制分為凋萎期、變褐期、定色期和干筋期4個(gè)時(shí)期，針對(duì)雪茄煙葉晾制的不同時(shí)期，對(duì)上、中、下3個(gè)部位煙葉在晾制第0、5、10、15和20 d進(jìn)行取樣，共取5次。每次選取外觀相同的煙葉30片分成兩份，一份取葉中部分用于生理指標(biāo)的測(cè)定，另一份去除主脈、葉尖和葉基部殺青后用于多酚及色素的測(cè)定，各重復(fù)3次。

1.3? 測(cè)定項(xiàng)目與方法

1.3.1? 多酚類物質(zhì)和質(zhì)體色素含量測(cè)定? 分別采用YC/T 202—2006和YC/T 382—2010的方法測(cè)定煙草中的多酚類物質(zhì)和質(zhì)體色素含量。

1.3.2? 相關(guān)酶活性的測(cè)定? 脂氧合酶（LOX）、苯丙氨酸解氨酶（PAL）、多酚氧化酶（PPO）、過(guò)氧化物酶（POD）活性分別按照蘇州科銘生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)的相應(yīng)酶試劑盒說(shuō)明書方法進(jìn)行測(cè)定。

1.4? 數(shù)據(jù)分析

采用Excel進(jìn)行作圖及數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，利用SPSS 21.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2? 結(jié)? 果

2.1? 不同部位雪茄煙葉晾制過(guò)程中多酚類物質(zhì)含量的變化

由表2可看出，不同部位雪茄煙葉在晾制過(guò)程中綠原酸含量變化規(guī)律相似，呈逐漸下降趨勢(shì)，至20 d時(shí)達(dá)到最低值。在晾制過(guò)程中，下部葉綠原酸含量始終高于中部葉和上部葉，且與上部葉在0～10 d差異顯著;在晾制結(jié)束時(shí)各部位綠原酸含量趨于一致。各部位蕓香苷含量在晾制5 d內(nèi)逐漸降低，隨著晾制的進(jìn)行，蕓香苷含量稍有增加隨后又逐漸減少。鮮葉中以中部葉的蕓香苷含量最高（3.638 mg/g），其次為下部葉（3.235 mg/g）和上部葉（2.556 mg/g），并且在晾制5 d內(nèi)3個(gè)部位蕓香苷含量存在差異。各部位相比，以中部葉降解幅度最大為77.82%，其次為下部葉與上部葉分別為65.35%和43.58%。與綠原酸和蕓香苷含量相比，煙葉內(nèi)莨菪亭含量較低。在晾制開始時(shí)各部位葉片莨菪亭含量表現(xiàn)為中部葉>下部葉>上部葉，晾制結(jié)束時(shí)，各部位以中部葉莨菪亭降解量最大，其次為下部葉和上部葉，部位間的莨菪亭含量差異均不顯著。

2.2? 不同部位雪茄煙葉晾制過(guò)程中質(zhì)體色素含量的變化

在晾制初期，煙葉質(zhì)體色素中葉綠素a含量最高，葉黃素含量最低，各類色素隨晾制過(guò)程的進(jìn)行發(fā)生降解（圖1）。不同部位葉綠素a含量在晾制的0～10 d降解速度較快，之后緩慢下降（圖1a）。下部葉相比于中、上部葉在0～5 d內(nèi)降解緩慢，之后趨勢(shì)基本一致。晾制開始前各部位葉綠素a含量以上部葉最高下部葉最低，并且達(dá)到極顯著差異（=0.007），這可能是由于上部葉晚熟并且在大田中接受陽(yáng)光充足而有利于光合作用的進(jìn)行。降解幅度以中部葉最大，其次是上部葉和下部葉，分別是96.56%、90.85%、90.48%。由圖1b所示，葉綠素b含量變化趨勢(shì)與葉綠素a基本一致，在5～10 d各部位降解速率最高，變褐期結(jié)束時(shí)（10 d）葉綠素b基本完全降解，之后趨于平緩。不同部位間葉綠素b含量差異均不顯著（>0.05）。由圖1c可看出，各部位雪茄煙晾制過(guò)程中β-胡蘿卜素含量逐漸下降，在0～15 d降解速度略快，之后相對(duì)平緩。晾制初期β-胡蘿卜素含量以上部葉最高，整個(gè)晾制過(guò)程中降解幅度表現(xiàn)為中部葉>下部葉>上部葉，但部位間β-胡蘿卜素含量差異不顯著（>0.05）。與葉綠素和β-胡蘿卜素含量相比，煙葉中葉黃素含量最低（圖1d），各部位在晾制過(guò)程中降解速度較均勻，除5 d時(shí)上部葉葉黃素含量與中、下部葉差異顯著外（=0.034），其余時(shí)期各部位間差異不顯著（>0.05）。

2.3? 不同部位雪茄煙葉晾制過(guò)程中多酚、色素降解相關(guān)酶活性的變化

如圖2a所示，不同部位的LOX活性在晾制期間具有相同的動(dòng)態(tài)變化趨勢(shì)，呈先上升后急劇下降的趨勢(shì)。各部位煙葉LOX活性在10 d均達(dá)到了峰值并存在顯著差異，此時(shí)的LOX活性表現(xiàn)為上部葉>中部葉>下部葉，分別為733.18、627.87、505.08 U/g，之后活性迅速下降;晾制結(jié)束時(shí)，3個(gè)部位LOX活性差異不顯著。不同部位PPO活性變化規(guī)律趨于一致，呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)（圖2b）。晾制后5 d，PPO活性最高，之后逐漸降低。除晾制開始時(shí)（0 d）各部位PPO活性無(wú)明顯差異外，晾制過(guò)程中上部葉PPO活性始終大于中部葉和下部葉，且差異達(dá)到了顯著水平。各部位雪茄煙葉PAL活性變化趨勢(shì)基本相同，呈先升高后降低趨勢(shì)（圖2c）。在晾制過(guò)程中上、中、下3個(gè)部位煙葉PAL活性逐漸升高，在15 d達(dá)到峰值，比晾制開始時(shí)分別升高了71.88%、64.87%、50.29%，之后急劇下降。如圖2d可知，不同部位間煙葉隨著晾制過(guò)程的進(jìn)展，POD活性呈現(xiàn)單峰波動(dòng)趨勢(shì)，在10 d達(dá)到峰值，此時(shí)表現(xiàn)為上部葉>中部葉>下部葉，且均達(dá)到顯著性差異;在晾制15 d時(shí)，中部葉顯著高于下部葉和上部葉;在晾制結(jié)束時(shí)，以中部葉下降幅度最大，其次是上部葉和下部葉，依次為88.73%、85.30%、79.18%。

2.4? 不同部位雪茄煙葉晾制過(guò)程中多酚類物質(zhì)和質(zhì)體色素與相關(guān)酶的相關(guān)分析

脂氧合酶（LOX）、苯丙氨酸解氨酶（PAL）、多酚氧化酶（PPO）、過(guò)氧化物酶（POD）與多酚類物質(zhì)和質(zhì)體色素代謝密切相關(guān)。如表3所示，POD與LOX、PPO、PAL均呈顯著正相關(guān)，LOX與PPO在各部位均達(dá)到了顯著正相關(guān)，而PAL與LOX和PPO關(guān)系不明顯。LOX活性與莨菪亭、蕓香苷以及質(zhì)體色素含量呈正相關(guān)，但均未達(dá)到顯著水平;PPO活性與多酚、色素含量呈正相關(guān)，尤其與綠原酸和β-胡蘿卜素達(dá)到顯著水平;在不同部位中PAL活性與多酚類物質(zhì)和質(zhì)體色素的含量呈負(fù)相關(guān)，尤其與綠原酸達(dá)到顯著水平;各部位POD活性與類胡蘿卜素呈正相關(guān)但未達(dá)到顯著水平。

3? 討? 論

多酚類化合物與質(zhì)體色素是煙草中的重要物質(zhì)，其含量直接影響調(diào)制后煙葉的色澤和外觀質(zhì)量。綠原酸、莨菪亭和蕓香苷是煙草中主要的多酚類物質(zhì)。柴家榮等研究表明，白肋煙TN86總酚含量隨晾制的進(jìn)行而下降，在3 d時(shí)含量較低，在6 d時(shí)稍有回升但仍比砍收時(shí)低，然后又逐漸下降。本試驗(yàn)結(jié)果表明雪茄煙具有相似規(guī)律，其中綠原酸含量呈下降趨勢(shì)，且下降明顯，莨菪亭和蕓香苷含量表現(xiàn)為先下降后略有回升然后下降，這也與過(guò)偉民等的研究結(jié)果一致。不同部位比較，晾制初期雪茄煙葉綠原酸和蕓香苷含量中部葉顯著高于上部葉，隨著晾制進(jìn)行，差異逐漸減小，各部位莨菪亭含量在整個(gè)晾制過(guò)程中差異不顯著。晾制期間下、中部葉3種多酚類物質(zhì)含量高于上部葉，這與李力等研究略有不同，這可能是當(dāng)?shù)刂?、下部葉采收時(shí)期降雨量過(guò)大、氣溫低延遲采收造成的。

煙草中質(zhì)體色素包括葉綠素和類胡蘿卜素，其含量高低決定了煙葉調(diào)制后顏色的優(yōu)劣，其降解產(chǎn)物對(duì)香氣質(zhì)和香氣量有較大影響。劉曉迪等研究表明，煙葉類胡蘿卜素在調(diào)制前期大量降解，在調(diào)制后期含量趨于穩(wěn)定。本研究發(fā)現(xiàn)，雪茄煙葉各質(zhì)體色素含量在晾制過(guò)程中變化規(guī)律基本相同，均呈下降趨勢(shì)，且部位間表現(xiàn)為上部葉>中部葉>下部葉，這可能由于隨著部位的升高，光照條件改善，光合作用增強(qiáng)有利于色素的合成，這與柴家榮等研究結(jié)果相似。但各質(zhì)體色素降解幅度存在一定差異，葉綠素a降解幅度大于葉綠素b，β-胡蘿卜素降解幅度大于葉黃素，且類胡蘿卜素降解幅度遠(yuǎn)小于葉綠素，這說(shuō)明晾制期間葉綠素含量的降解可能是調(diào)制后煙葉顏色變化的關(guān)鍵因素。

LOX是質(zhì)體色素降解的關(guān)鍵酶，其活性可用來(lái)表示色素的降解速率。本試驗(yàn)結(jié)果表明，不同部位LOX活性在晾制期間呈先上升后下降的趨勢(shì)，這可能由于隨著晾制的進(jìn)行，煙葉受到外界環(huán)境的脅迫，LOX活性升高，使煙葉內(nèi)質(zhì)體色素降解加快;而后期膜脂過(guò)氧化作用加劇，使細(xì)胞結(jié)構(gòu)破壞，LOX活性下降^[22-23]，質(zhì)體色素降解緩慢。PAL與多酚和色素都具有密切關(guān)系，可通過(guò)苯丙烷代謝途徑形成酚類化合物和木質(zhì)素。在晾制過(guò)程中PAL活性在不同部位間變化趨勢(shì)基本一致，表現(xiàn)為前中期逐漸升高，后期急劇降低。這可能由于煙葉在晾制期間逐漸衰老使細(xì)胞膜通透性增大，自由基和過(guò)氧化物進(jìn)入細(xì)胞，刺激細(xì)胞啟動(dòng)PAL防御機(jī)制來(lái)提高植物的抗逆性，晾制后期細(xì)胞膜被破壞，使PAL活性急劇降低。PAL與綠原酸達(dá)到了顯著負(fù)相關(guān)，表明PAL與多酚類物質(zhì)存在拮抗作用。PPO是呼吸鏈末端氧化酶，煙草在調(diào)制過(guò)程中可催化發(fā)生酶促棕色化反應(yīng)。在晾制期間不同部位PPO呈現(xiàn)單峰趨勢(shì)，在5 d達(dá)到峰值，此時(shí)也是蕓香苷和莨菪亭含量的谷值，之后PPO活性逐漸下降而蕓香苷和莨菪亭含量略有回升。PPO活性與酚類物質(zhì)和色素含量存在顯著正相關(guān)，因此雪茄煙葉在晾制過(guò)程中，可通過(guò)合理調(diào)控PPO活性，使多酚類物質(zhì)轉(zhuǎn)化有利于優(yōu)質(zhì)煙葉色澤的形成。POD是植物中重要的HO清除劑，能夠預(yù)防細(xì)胞膜的損傷和酚類物質(zhì)過(guò)度氧化發(fā)生的褐變。POD活性隨著晾制的進(jìn)行呈先增加后下降的趨勢(shì)，且在整個(gè)晾制過(guò)程中活性保持在較高的水平，這樣可以避免自由基積累過(guò)多，防止棕色化反應(yīng)的過(guò)度發(fā)生，這與宋朝鵬等研究一致。相關(guān)分析表明，各部位POD與多酚類物質(zhì)和質(zhì)體色素關(guān)系不明顯，但與LOX、PAL、PPO均達(dá)到顯著正相關(guān)，說(shuō)明多酚類物質(zhì)和質(zhì)體色素的降解是多種酶共同作用的結(jié)果。

等酶活性均表現(xiàn)為上部葉>中部葉>下部葉，可能是因?yàn)殡S著部位的升高葉片結(jié)構(gòu)更緊密，內(nèi)含物質(zhì)增加，細(xì)胞抗氧化脅迫能力增強(qiáng)。

4? 結(jié)? 論

在晾制過(guò)程中，不同部位雪茄煙葉多酚類物質(zhì)與質(zhì)體色素含量總體降低;而LOX、PAL、PPO、POD等相關(guān)酶活性均呈先升后降的趨勢(shì)，并且各部位酶活性均以上部葉最高，中部葉次之，下部葉最低;PPO活性與多酚、色素含量呈正相關(guān)，而PAL活性與多酚、色素的含量呈負(fù)相關(guān)，且POD與LOX、PAL、PPO均呈顯著正相關(guān)，可以看出多酚與色素的降解是多種酶共同作用的結(jié)果。本試驗(yàn)研究多酚、色素與相關(guān)酶活性之間的關(guān)系，有助于通過(guò)合理的措施，調(diào)控調(diào)制期間雪茄煙葉的色澤和致香成分的變化，進(jìn)而提高晾制后的煙葉質(zhì)量，為優(yōu)質(zhì)雪茄煙葉的晾制提供了理論依據(jù)。

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