毒素脅迫煙草抗黑脛病鑒定及抗性指標(biāo)分析

盧小亮　張強(qiáng)　孫渭　王佩　張帥　李春蓮　齊寧海　陳耀鋒

摘? 要：為建立一種高效準(zhǔn)確的煙草黑脛病抗性鑒定方法，以4種具有不同抗性特性的煙草品種為材料，研究培養(yǎng)基附加不同濃度黑脛病病菌毒素及不同脅迫時(shí)間對(duì)煙草種子萌發(fā)和根系生長(zhǎng)的影響。結(jié)果表明，煙草黑脛病病菌毒素脅迫對(duì)煙草種子的發(fā)芽率和根系生長(zhǎng)均有抑制作用，抑制效果隨脅迫濃度的增加而增強(qiáng)，且不同品種對(duì)毒素脅迫的耐受力不同，利用體積濃度為50%的毒素脅迫15 d時(shí)，抗病品種G28、中抗品種YN116、中感品種凈葉黃、感病品種紅花大金元的根系長(zhǎng)進(jìn)培養(yǎng)基中的株數(shù)比率分別為79.38%、70.74%、33.55%和13.36%。初步確定鑒別煙草種子抗性特性的最佳粗毒素脅迫濃度為50%（即含蛋白質(zhì)13.53 μg/mL，含糖19.64 mg/mL）、最佳鑒定時(shí)間為脅迫15 d，利用該方法可在短期內(nèi)高效準(zhǔn)確地鑒定出不同品種（種質(zhì)）對(duì)煙草黑脛病的抗感水平，加快煙草抗黑脛病育種進(jìn)程。

關(guān)鍵詞：煙草;黑脛病;毒素脅迫;抗性鑒定

中圖分類號(hào)：S435.72????????? 文章編號(hào)：1007-5119（2019）03-0060-07????? DOI：10.13496/j.issn.1007-5119.2019.03.009

In order to establish an efficient and accurate method for identification of resistance to tobacco black shank， experiments were performed using 4 tobacco varieties with different resistance characteristics. The toxin was added to the medium to study the effects of different concentrations of toxin stress and different stress time on tobacco seed germination and root growth. The results showed that the toxin stress of black shank disease could inhibit the germination and root growth of tobacco seedlings， and the inhibitory effect increased with the increase of toxin concentration. Different varieties have different tolerance to toxin stress. When the toxin was used at a concentration of 50% for 15 days， the ratio of the number of plants in the root growth medium of G28， YN116， Jingyehuang and Hongda was 79.38%， 70.74%， 33.55% and 13.36%， respectively. It was preliminarily determined that the optimal crude toxin concentration for identifying the resistance level of different varieties （germplasm） to tobacco black shank was 50% （protein content 13.53 μg/mL， sugar content 19.64 mg/mL）， and the optimal stress time was 15 days. This method can effectively and accurately identify the resistance level of different varieties （germplasm） to tobacco black shank in a short period of time， and accelerate the breeding process of tobacco resistance to black shank.

tobacco; black shank disease; toxin stress; resistance identification

煙草黑脛?。╲ar.）是由卵菌綱疫霉屬煙草疫霉引起的一種分布廣泛、嚴(yán)重危害煙草生產(chǎn)的真菌性病害，每年因黑脛病給我國(guó)煙草行業(yè)造成巨大損失，其影響僅次于煙草病毒病。黑脛病病原菌的最適培養(yǎng)條件已有詳細(xì)的報(bào)道，黃麗華等篩選出了黑脛病病菌毒素的高產(chǎn)培養(yǎng)條件。

抗病育種是作物病害防治的重要途徑，應(yīng)用抗病品種和提高品種的抗病性是防治煙草黑脛病最經(jīng)濟(jì)有效、且有利于環(huán)境保護(hù)的措施。傳統(tǒng)煙草黑脛病抗性的鑒定主要采用苗期接種鑒定、田間病圃抗性鑒定和離體葉片接種鑒定。苗期接種鑒定一定程度上受接種時(shí)間、接種方法以及培養(yǎng)條件的影響，導(dǎo)致鑒定結(jié)果出現(xiàn)較大誤差，而田間病圃抗性鑒定主要應(yīng)用于煙草成株的鑒定，往往由于氣候環(huán)境條件影響而不能準(zhǔn)確評(píng)價(jià)材料的抗性水平。王橋美等研究表明，煙草品種對(duì)黑脛病病菌毒素的抗性與煙草品種對(duì)黑脛病的抗性有高度的相關(guān)性，選用適當(dāng)?shù)亩舅貪舛瓤勺鳛榧闹髦参飳?duì)病害抗性的鑒定劑。時(shí)焦等利用培養(yǎng)基添加赤星病菌毒素的方法建立了一種培養(yǎng)皿中篩選煙草抗赤星病種質(zhì)材料的體系。丁燕芳等對(duì)粗毒素浸種法、粗毒素浸根法、孢子懸浮液浸根法及田間病圃接種法4種黑脛病抗性鑒定方法進(jìn)行了比較，結(jié)果顯示粗毒素浸種法可對(duì)煙草黑脛病抗性進(jìn)行初期篩選，然而因種子質(zhì)量影響形成的低發(fā)芽率可造成“假感病”的現(xiàn)象，影響毒素浸種法的判定效果。盡管在利用黑脛病菌毒素篩選和抗病性鑒定方面取得了令人興奮的成果，但仍存在很多不足，如易受其他雜菌影響、鑒定歷時(shí)長(zhǎng)、耗費(fèi)高、溫濕度條件不易控制等。

鑒于此，本研究以4種具不同抗性水平的煙草品種為材料，采用培養(yǎng)基附加煙草黑脛病病菌毒素的方法，通過不同毒素濃度、不同時(shí)間脅迫，研究了煙草黑脛病病菌毒素對(duì)具不同抗性煙草種子發(fā)芽特性的影響，篩選能有效鑒別區(qū)分煙草不同抗性特性的最佳毒素濃度和脅迫時(shí)間，旨在建立一種高效、準(zhǔn)確、廣適的煙草黑脛病離體脅迫抗性鑒定方法，為煙草抗病育種提供一定的理論依據(jù)。

1? 材料與方法

1.1? 材料

1.1.1? 供試菌種? 供試的煙草黑脛病菌強(qiáng)致病力菌株P(guān)PBS042由西北農(nóng)林科技大學(xué)農(nóng)學(xué)院?jiǎn)涡l(wèi)星教授饋贈(zèng)。

1.1.2? 供試煙草品種? 供試煙草品種均由中國(guó)煙草總公司陜西省公司提供，分別為G28（抗黑脛病品種，R）、YN116（中抗黑脛病品種，MR）、凈葉黃（中感黑脛病品種，MS）和紅花大金元（感黑脛病品種，S）。

1.2? 試驗(yàn)方法和地點(diǎn)

1.2.1? 試驗(yàn)地點(diǎn)? 本試驗(yàn)于2017—2018年在西北農(nóng)林科技大學(xué)農(nóng)學(xué)院細(xì)胞工程實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。

1.2.2? 黑脛病菌的活化、產(chǎn)毒培養(yǎng)與毒素的制備? 菌種的活化：采用5% CA培養(yǎng)基（胡蘿卜汁50 mL/L、β-谷甾醇0.02 g/L、碳酸鈣0.1 g/L、瓊脂8 g/L），23 ℃光照培養(yǎng)4～7 d，菌絲布滿整個(gè)培養(yǎng)皿為宜。

產(chǎn)毒培養(yǎng)與毒素的制備：參照龐龍等制備毒素的方法，取直徑0.5 cm已經(jīng)活化的黑脛病菌菌餅接于土豆培養(yǎng)液中（土豆600 g/L、蔗糖50 g/L、硫酸銨3 g/L、硫酸鎂0.8 g/L），26 ℃避光振蕩（150 r/min）培養(yǎng)24 d。培養(yǎng)液用無菌雙層紗布過濾后，再用定性濾紙過濾兩次，8000 r/min離心5 min，上清液即為粗毒素原液，然后經(jīng)抽濾滅菌，4 ℃保存，備用。

1.2.3? 黑脛病菌毒素活性測(cè)定? 采用葉片注射法確定毒素的活性，用微量注射器將毒素液沿活體煙草葉背的葉脈注人5～10 μL，使之在表皮內(nèi)形成一個(gè)漬斑，以水作同樣注射為對(duì)照。分別于24 h和48 h觀察注射部位壞死斑的出現(xiàn)情況。

1.2.4? 黑脛病菌毒素有效成分測(cè)定? 龐龍等研究發(fā)現(xiàn)煙草黑脛病菌毒素的主要成分為蛋白質(zhì)和糖。分別采用考馬斯亮藍(lán)G-250染色法和蒽酮比色法對(duì)上述制備毒素中蛋白質(zhì)含量和糖含量進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果表明該毒素液含蛋白質(zhì)27.06 μg/mL，含糖39.28 mg/mL。

1.2.5? 不同濃度毒素培養(yǎng)基的制備? 毒素培養(yǎng)基：MS+30 g/L蔗糖+6.5 g/L瓊脂+黑脛病病菌粗毒素，pH值5.8。制備方法：按量配制每200 mL毒素培養(yǎng)基所需要的蔗糖、瓊脂粉等基本成分，裝于250 mL三角瓶中，121 ℃滅菌20 min后，50 ℃保溫備用;將裝有黑脛病病菌粗毒素的15 mL離心管于微波爐低溫加熱至45 ℃，然后按濃度需要向培養(yǎng)

基中加入已過濾除菌的黑脛病病菌毒素，充分搖勻后分裝到13 cm的方形培養(yǎng)皿，每200 mL分裝到3個(gè)培養(yǎng)皿。培養(yǎng)基中毒素的濃度分別為：0（CK）、10%、20%、30%、40%、50%。

1.2.6? 毒素脅迫培養(yǎng)? 每個(gè)供試品種分別挑選150粒籽粒飽滿且大小均一的種子于2 mL離心管中，在無菌環(huán)境中先用75%酒精對(duì)種子表面消毒30 s，無菌水沖洗2次，再用10% HO深層消毒10 min后用無菌水沖洗4次，以不附加黑脛病病菌毒素的MS培養(yǎng)基為空白對(duì)照，將消毒好的4個(gè)品種間隔開接種于同一培養(yǎng)皿為一個(gè)處理，3次重復(fù)。（27±2）℃，16 h/d光照條件下培養(yǎng)，于10、15、20 d統(tǒng)計(jì)其發(fā)病情況，以發(fā)芽率（%）和煙草種子根系長(zhǎng)進(jìn)培養(yǎng)基中的株數(shù)比率（%）為鑒定指標(biāo)，篩選出能有效鑒別煙草不同抗性特性的最佳毒素濃度和脅迫時(shí)間。

1.3? 數(shù)據(jù)分析

利用Excel 2010和DPS軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，采用Duncan新復(fù)極差法進(jìn)行差異顯著性分析。

2? 結(jié)? 果

2.1? 黑脛病菌毒素生物活性測(cè)定

毒素生物活性測(cè)定結(jié)果見圖1，將水和毒素液沿?zé)煵萑~背的葉脈分別注入后在葉肉組織內(nèi)立即形成漬斑。24 h時(shí)觀察發(fā)現(xiàn)注射毒素液部位表現(xiàn)為葉片失綠，而注射水的漬斑消失，葉片恢復(fù)正常。48 h時(shí)注射毒素產(chǎn)生的失綠斑外圍出現(xiàn)組織壞死，對(duì)照則正常生長(zhǎng)。

2.2? 毒素脅迫對(duì)煙草種子發(fā)芽率的影響

利用培養(yǎng)基附加病原菌毒素脅迫，研究了毒素脅迫時(shí)間和脅迫濃度對(duì)煙草種子發(fā)芽率的影響，通過不同處理發(fā)芽率顯著性差異分析可知（表1），煙草黑脛病病菌毒素脅迫處理對(duì)所有煙草品種種子發(fā)芽均有較大影響，特別是高濃度毒素抑制煙草種子發(fā)芽。在脅迫條件下，低濃度（≤40%）毒素脅迫5 d時(shí)，抗病品種G28發(fā)芽率最高，顯著高于其他3個(gè)品種（<0.05）;脅迫濃度達(dá)到50%時(shí)，所有供試品種種子的發(fā)芽率均急速下降，高濃度毒素的抑制作用凸顯。然后隨脅迫時(shí)間延長(zhǎng)，各濃度毒素脅迫對(duì)各品種煙草種子發(fā)芽率的影響差異水平逐漸降低。

2.3? 毒素脅迫對(duì)煙草種子根系生長(zhǎng)的影響

為了進(jìn)一步探究黑脛病菌毒素脅迫對(duì)煙草種子根系生長(zhǎng)的影響，對(duì)各品種煙草種子不同脅迫時(shí)間、不同脅迫濃度下根系長(zhǎng)進(jìn)毒素培養(yǎng)基中的能力進(jìn)行比較，差異顯著性分析結(jié)果（表2）表明，不同濃度毒素脅迫對(duì)煙草種子根系生長(zhǎng)的影響顯著不同，根系長(zhǎng)進(jìn)毒素培養(yǎng)基中的株數(shù)比率（根系長(zhǎng)進(jìn)毒素培養(yǎng)基中的株數(shù)/總發(fā)芽數(shù)×100%）隨毒素濃度的增大而降低，體積濃度為50%的毒素脅迫第15天時(shí)，抗病品種G28的根系長(zhǎng)進(jìn)培養(yǎng)基中的株數(shù)比率最高，為79.38%，顯著高于其他3個(gè)品種，與YN116、凈葉黃、紅花大金元的根系長(zhǎng)進(jìn)培養(yǎng)基中的株數(shù)比率相比分別是其1.12、2.37、5.94倍。脅迫時(shí)間增加至20 d時(shí)，0～40%的病菌毒素對(duì)根系生長(zhǎng)無顯著影響，但50%的病菌毒素仍對(duì)凈葉黃和紅花大金元影響顯著，其根系長(zhǎng)進(jìn)毒素培養(yǎng)基中的株數(shù)比率分別為72.56%和47.83%。綜合不同脅迫時(shí)間和脅迫濃度對(duì)煙草根系長(zhǎng)進(jìn)培養(yǎng)基的株數(shù)比率的變化，可得出抗黑脛病能力大小為G28>YN116>凈葉黃>紅花大金元。

2.4? 毒素脅迫煙草抗黑脛病鑒定指標(biāo)分析

綜合表1、2表明，黑脛病病菌毒素脅迫對(duì)煙草種子的萌發(fā)具有一定的抑制效應(yīng)，低濃度（≤40%）毒素脅迫5 d時(shí)，G28的發(fā)芽率均顯著高于同等條件下YN116、凈葉黃和紅花大金元的發(fā)芽率，隨脅迫時(shí)間延長(zhǎng)不同品種間發(fā)芽率的差異水平降低，難以進(jìn)一步鑒定對(duì)黑脛病的抗感性差異。另外毒素脅迫對(duì)煙草種子根系長(zhǎng)進(jìn)毒素培養(yǎng)基中的株數(shù)比率影響顯著，各品種煙草種子根系長(zhǎng)進(jìn)培養(yǎng)基的株數(shù)均隨脅迫濃度增加而下降，但不同品種間有所差異，低毒素濃度（0～40%）脅迫下，表現(xiàn)為毒素選擇壓力過低，使得感病品種能夠克服毒素的抑制作用而導(dǎo)致對(duì)煙草黑脛病的抗性水平難以準(zhǔn)確判斷;而濃度為50%的毒素脅迫15 d時(shí)，品種間表現(xiàn)出顯著性差異（<0.05），G28、YN116、凈葉黃和紅花大金元的種子根系長(zhǎng)進(jìn)培養(yǎng)基中的株數(shù)比率分別為79.38%、70.74%、33.55%和13.36%。說明通過對(duì)比分析煙草種子根系在50%毒素（含蛋白質(zhì)13.53 μg/mL，含糖19.64 mg/mL）培養(yǎng)基上長(zhǎng)進(jìn)培養(yǎng)基中的株數(shù)比率，能夠快速準(zhǔn)確地鑒別出不同品種或種質(zhì)對(duì)煙草黑脛病的抗性水平。

3? 討? 論

植物病原菌毒素的本質(zhì)是病原菌產(chǎn)生的有生物毒性的代謝產(chǎn)物，該產(chǎn)物可使寄主植物產(chǎn)生特定的病癥反應(yīng)，病癥反應(yīng)的強(qiáng)弱與寄主植物的抗病性具有高度的相關(guān)性。本研究發(fā)現(xiàn)，黑脛病病菌毒素脅迫對(duì)煙草種子的萌發(fā)具有一定的抑制效應(yīng)，抑制效果的強(qiáng)弱與煙草品種對(duì)黑脛病的抗病性呈正相關(guān)，這與時(shí)焦等在煙草赤星病中的研究結(jié)果一致。近年來，以細(xì)胞工程為基礎(chǔ)篩選抗病突變體的研究取得了一系列成就，最適毒素濃度的確定是高效鑒定并篩選抗煙草黑脛病材料的關(guān)鍵，晏娟等采用細(xì)胞突變體離體篩選與組織培養(yǎng)技術(shù)相結(jié)合的方法初步確定紅花大金元和云煙85的最佳篩選毒素濃度。

本試驗(yàn)結(jié)果表明，黑脛病病菌毒素脅迫對(duì)煙草種子的萌發(fā)和生長(zhǎng)均有顯著影響。煙草根系長(zhǎng)進(jìn)毒素培養(yǎng)基中的株數(shù)比率隨毒素濃度的增大而降低，低濃度毒素（0～40%）脅迫處理前期表現(xiàn)出輕微的抑制作用，但后期因毒素濃度過低，表現(xiàn)為篩選壓力不足，致使感病品種能夠適應(yīng)致病毒素對(duì)煙草生長(zhǎng)造成的影響。所有品種在50%的毒素濃度處理5 d時(shí)嚴(yán)重抑制了種子發(fā)芽，表現(xiàn)為毒素濃度過高，即超過抗性品種的耐受范圍，導(dǎo)致抗病材料的抗性“丟失”。因此，在供試材料的抗性耐受范圍內(nèi)選用高毒素濃度可有效的鑒定并篩選出抗黑脛病的煙草種質(zhì)，高崇等在煙草菌核病的試驗(yàn)中也得到了類似的結(jié)論。

傳統(tǒng)上煙草黑脛病抗性的鑒定主要采用苗期接種鑒定和田間病圃抗性鑒定，苗期接種鑒定主要包括育苗、接種體的制備和誘發(fā)3個(gè)環(huán)節(jié)，對(duì)接種苗齡、接種方法以及誘發(fā)條件的依賴性較強(qiáng)，導(dǎo)致鑒定結(jié)果出現(xiàn)較大誤差，而田間病圃抗性鑒定主要應(yīng)用于煙草成株的鑒定，由于氣候環(huán)境條件影響進(jìn)而不能準(zhǔn)確的評(píng)價(jià)材料的抗性水平。毒素脅迫鑒定方法與現(xiàn)有技術(shù)相比具有如下優(yōu)點(diǎn)：1）與苗期接種鑒定相比較，毒素脅迫法在煙草種子水平上利用其病菌毒素能夠引起寄主植物產(chǎn)生特定病癥反應(yīng)為依據(jù)進(jìn)行煙草黑脛病抗性的鑒定，有效克服了因接種苗齡不一致和誘發(fā)條件受外界影響大等因素而出現(xiàn)較大誤差;2）與田間病圃抗性鑒定相比，本研究方法利用煙草種子可在短期內(nèi)對(duì)其進(jìn)行高通量抗性水平鑒定，避免了從育苗移栽到成株期歷時(shí)長(zhǎng)、大田氣候環(huán)境多變而不易控制溫濕度條件等影響鑒定結(jié)果準(zhǔn)確性的眾多因素;3）技術(shù)難度小、鑒定成本低，結(jié)果可靠性高，抗感品種對(duì)毒素脅迫的反應(yīng)差異顯著。

盡管毒素脅迫對(duì)煙草種子的萌發(fā)和生長(zhǎng)均有顯著影響，但不同品種的煙草種子在毒素脅迫條件下的萌發(fā)差異可能與種子的質(zhì)量有關(guān)，即使來源于同一品種，不同植株的煙草種子抗逆性也會(huì)與自身生物學(xué)特性密切相關(guān)。此外，人為控制的相同條件下不同品種間的發(fā)芽指標(biāo)對(duì)于品種抗病性的判斷存在一定局限性。因此，種質(zhì)材料抗性的最終評(píng)價(jià)，需結(jié)合外界環(huán)境中田間抗性鑒定結(jié)果。

4? 結(jié)? 論

培養(yǎng)基附加黑脛病病菌毒素的鑒定方法具有較強(qiáng)的實(shí)用性，體積濃度為50%的毒素（含蛋白質(zhì)13.53 μg/mL，含糖19.64 mg/mL）脅迫15 d時(shí)，通過對(duì)比分析煙草種子根系在毒素培養(yǎng)基上長(zhǎng)進(jìn)培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的株數(shù)比率，能夠有效鑒定出不同品種（種質(zhì)）對(duì)煙草黑脛病的抗感水平。該方法利用煙草種子可在短期內(nèi)高效準(zhǔn)確地的鑒定出不同品種（種質(zhì)）對(duì)煙草黑脛病的抗感水平，并且不受其他雜菌影響和季節(jié)的限制，從而加快煙草抗黑脛病育種進(jìn)程。

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