斷奶仔豬源小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌的分離鑒定及其致病性研究

關(guān)乃瑜，夏 爽，趙麗麗，羅繼龍，谷珊珊，崔 文，葛俊偉*，陳洪巖*

(1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物醫(yī)學(xué)學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150030；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所實(shí)驗(yàn)動物與比較醫(yī)學(xué)創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)，黑龍江哈爾濱 150001)

小腸結(jié)腸炎耶爾森菌(Yersinia enterocolitica)為一種常見的食源性致病菌，屬于少數(shù)幾種能夠在低溫下生長的腸道病原菌之一[1]，通常認(rèn)為豬為Y.enterocolitica 的貯存宿主，為該菌感染人類最主要的傳染源[2-4]。該菌感染多發(fā)于秋冬季，人感染病例多見于嬰幼兒腹瀉，也可以感染多種家畜、家禽和嚙齒類動物，對幼齡動物具有較高的感染率和致病性。鑒于病原菌源性腹瀉尤其是斷奶仔豬腹瀉等頻發(fā)于幼齡仔豬的腸道疾病是影響?zhàn)B豬業(yè)健康發(fā)展的主要因素，而目前已知的該類疾病的細(xì)菌性病原主要為大腸桿菌、C 型魏氏梭菌和沙門氏菌等，耶爾森氏菌等其他腸道病原菌的感染是否在斷奶仔豬腹瀉中發(fā)揮作用尚不明確。我們推測Y.enterocolitica 可能在斷奶仔豬腹瀉發(fā)病中起一定的作用。因此，本研究于2012 年9 月～2013 年2 月，采集黑龍江省哈爾濱和七臺河的4 個(gè)規(guī)?；B(yǎng)豬場的斷奶仔豬腹瀉的糞便樣品進(jìn)行Y.enterocolitica 細(xì)菌分離鑒定，并通過檢測分離菌株毒力基因以及人工感染實(shí)驗(yàn)鼠和斷奶仔豬后對其致病性進(jìn)行研究，為評價(jià)Y.enterocolitica 在斷奶仔豬腹瀉發(fā)病中可能發(fā)揮的作用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 病料樣品、主要試劑及實(shí)驗(yàn)動物 在秋冬兩季于黑龍江省哈爾濱和七臺河地區(qū)4 個(gè)規(guī)模化養(yǎng)豬場采集58 份斷奶仔豬腹瀉糞便樣品，對糞便樣品進(jìn)行記錄編號。實(shí)驗(yàn)中相關(guān)培養(yǎng)基均購自青島海博生物技術(shù)有限公司；生化鑒定試劑購自溫州康泰生物科技有限公司；基因組DNA 提取試劑盒、Ex Taq DNA 聚合酶購自TaKaRa 公司。6 周齡～8 周齡BALB/c 小鼠70 只購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司；28 日齡經(jīng)檢測無耶爾森氏菌病原的斷奶仔豬8 頭購自哈爾濱威爾士牧業(yè)科技發(fā)展有限公司。

1.2 病原分離 將糞便樣品與改良耶爾森氏菌SB增菌液混合，于4 ℃冷增菌14 d。增菌后樣品經(jīng)堿處理液(含0.5 % NaCl 和0.5 % KOH)處理后，先后劃線接種于麥康凱瓊脂培養(yǎng)基和CIN 瓊脂培養(yǎng)基，挑取形態(tài)依次為無色半透明、不粘稠、針尖狀大小和扁平、邊緣明顯中心為深紅色、成“公牛眼”狀的菌落接種于普通肉湯培養(yǎng)基進(jìn)行純培養(yǎng)。

1.3 病原形態(tài)學(xué)觀察及生化鑒定 取上述接種于普通肉湯培養(yǎng)基的純培養(yǎng)物進(jìn)行革蘭氏染色鏡檢后，按照文獻(xiàn)[5]方法進(jìn)行生化鑒定。

1.4 病原分子鑒定 參照基因組DNA 提取試劑盒說明書提取生化試驗(yàn)篩選的耶爾森氏菌陽性分離菌株的基因組，對Y.enterocolitica 保守基因foxA(鐵草胺菌素受體基因)PCR 檢測陽性的分離株進(jìn)行16S rRNA 基因的擴(kuò)增(引物27F：5'-AGAGTTTGA TCATGGCTCAG-3'/1492R：5'-GGTTACCTTGTTACG ACTT-3')，回收PCR 產(chǎn)物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測序。

1.5 毒力基因的檢測 按照文獻(xiàn)[6]PCR 方法對分離菌株的6 種Y.enterocolitica 毒力基因ail、ystA、ystB、virF、yadA 和rbfc 進(jìn)行檢測。

1.6 實(shí)驗(yàn)動物致病性試驗(yàn) 參考文獻(xiàn)[7-11]對分離菌株的致病性作出評估，將70 只6 周齡～8 周齡BALB/c 小鼠分為6 個(gè)實(shí)驗(yàn)組和1 個(gè)對照組，10 只/組，其中5 只口服接種5 只腹腔接種，人工感染不同分離株進(jìn)行致病性試驗(yàn)。將菌液濃度調(diào)整至1×109cfu/mL，采用口服和腹腔接種兩種途徑感染小鼠，接種量為2×108cfu，對照組小鼠灌喂等體積培養(yǎng)基，正常飼養(yǎng)觀察。

1.7 本動物致病性試驗(yàn) 如上述方法對若干實(shí)驗(yàn)組的分離菌株進(jìn)行28 日齡斷奶仔豬的致病性試驗(yàn)，并設(shè)置培養(yǎng)基對照組，每組2 頭豬。感染前12 h 仔豬禁水、食，灌喂62 mL 1.6 % NaHCO330 min 后，對各實(shí)驗(yàn)組仔豬灌喂菌液(含菌量1×1011cfu)，對照組灌喂等體積培養(yǎng)基，灌喂后正常飼養(yǎng)，每日觀察記錄各組仔豬的狀態(tài)。

1.8 細(xì)菌分布的檢測 灌喂菌液后逐日采集各組仔豬的糞便樣品。在實(shí)驗(yàn)組仔豬腹瀉癥狀消失后，迫殺仔豬，采集新鮮肝、肺、心血、腸系膜淋巴結(jié)、后肢關(guān)節(jié)液和小腸內(nèi)容物，采用PCR 方法對所采集的樣品進(jìn)行Y.enterocolitica 檢測。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)菌分離及生化鑒定結(jié)果 58 份糞便樣品經(jīng)過冷增菌和堿處理后，先后接種于麥康凱瓊脂培養(yǎng)基和CIN 瓊脂培養(yǎng)基。結(jié)果顯示，CIN 瓊脂培養(yǎng)基生長的可疑菌落的鏡檢結(jié)果為革蘭氏陰性的桿菌或球桿菌，與Y.enterocolitica 相似，生化試驗(yàn)鑒定結(jié)果顯示有20 株分離菌株對甘露醇、山梨醇、蔗糖、葡萄糖、D-麥芽糖、鳥氨酸脫羧酶、尿素酶、硝酸鹽還原、過氧化氫酶、VP 試驗(yàn)及26 ℃時(shí)的動力試驗(yàn)的反應(yīng)均為陽性；對棉籽糖、鼠李糖、D-木糖、水楊苷及硫化氫生成試驗(yàn)和26 ℃時(shí)的動力試驗(yàn)反應(yīng)均為陰性且生長過程中產(chǎn)氣，符合Y.enterocolitica 生化特征。

2.2 分子鑒定結(jié)果 采用PCR 方法對20 株分離菌株保守基因foxA 進(jìn)行擴(kuò)增，結(jié)果顯示，其中18 株foxA 分子鑒定陽性，初步確定為Y.enterocolitica。隨后對18 株分離菌株的16S rRNA 基因進(jìn)行擴(kuò)增并測序，將測序結(jié)果在GenBank 中進(jìn)行BLAST 比對分析后確定18 株分離菌株均為Y.enterocolitica。哈爾濱地區(qū)和七臺河地區(qū)斷奶仔豬糞變樣品該菌的攜帶率分別為30.3 %和32 %。秋季分離率為28.6 %，冬季分離率為33.3 %(表1)。

表1 Y.enterocolitica 分離情況Table 1 Isolation of Y.enterocolitica

圖1 分離菌株foxA 基因擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 The amplification of foxA gene from the isolate by PCR

2.3 毒力基因的檢測結(jié)果 對18 株分離菌ail、ystA、ystB、virF、yadA 和rbfc 6 種毒力基因進(jìn)行PCR 檢測，結(jié)果顯示，18 株分離菌株分為3 株攜帶ail 基因的菌株(ail+)、10 株攜帶ystB 基因的菌株(ystB+)和5 株無毒力基因菌株。3 種類型所占比例分別為17 %、55 %和28 %。部分分離株毒力基因檢測結(jié)果見圖2。

2.4 致病性試驗(yàn) 分別在3 種類型的分離株中各取2 株，Y7 和Y17(ail+)、Y11 和Y18(ystB+)及Y9 和Y16(無毒力基因)采用不同途徑人工感染實(shí)驗(yàn)組小鼠，評價(jià)各菌株致病性。結(jié)果顯示，口服感染Y7、Y9 和Y16 的小鼠全部產(chǎn)生腹瀉(5/5)，而腹腔接種Y7、Y11 和Y16 菌液則可致死小鼠，死亡比例分別為5/5、4/5 和5/5。而以Y11 口服感染小鼠、Y9 腹腔接種小鼠及將Y17 和Y18 通過上述兩種途徑感染小鼠，均不產(chǎn)生明顯臨床癥狀，對照組小鼠無異常變化(表2)。

圖2 部分分離株的ail 和ystB 基因分布情況Fig.2 The distribution of ail and ystB gene from 6 isolates

表2 分離株的致病性試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Pathogenicity test of isolates

2.5 斷奶仔豬致病性試驗(yàn) 從3 種類型分離菌株中分別選取Y7(ail+)、Y11(ystB+)和Y16(無毒力基因)3 株菌株，對斷奶仔豬進(jìn)行口服感染。結(jié)果顯示，Y7 和Y16 兩組仔豬均在口服菌液2 d 后開始出現(xiàn)腹瀉現(xiàn)象，6 d 和8 d 腹瀉現(xiàn)象有所緩解，分別在9 d和10 d 恢復(fù)正常?？诜11 菌液組和培養(yǎng)基對照組仔豬并未見明顯臨床癥狀，飲食正常。

2.6 斷奶仔豬體內(nèi)細(xì)菌分布的PCR 檢測 實(shí)驗(yàn)組仔豬腹瀉癥狀消失后，迫殺仔豬，采集新鮮肝、肺、心血、腸系膜淋巴結(jié)、后肢關(guān)節(jié)液和小腸內(nèi)容物。并采用PCR 方法對所采集的樣品進(jìn)行Y.enterocolitica 檢測，結(jié)果顯示各組仔豬的肝和心血中均未檢出該菌。Y7 組仔豬灌喂后7 d 的糞便樣品以及肺中檢出該菌；Y16 組仔豬后肢關(guān)節(jié)液、腸系膜淋巴結(jié)、肺、小腸內(nèi)容物及灌喂后8 d 糞便中均分離出該菌；Y11 組仔豬未出現(xiàn)腹瀉癥狀，但該仔豬的關(guān)節(jié)出現(xiàn)明顯腫脹，并且從仔豬的腸系膜淋巴結(jié)、后肢關(guān)節(jié)液及灌喂后8 d 糞便中能夠分離到該菌；對照組仔豬的各種樣本中均未檢出該菌。

3 討論

本研究對采集自黑龍江哈爾濱和七臺河地區(qū)的58 頭斷奶仔豬的腹瀉糞便樣品進(jìn)行Y.enterocolitica的細(xì)菌分離鑒定，通過生化試驗(yàn)和分子鑒定篩選到18 株Y.enterocolitica 分離菌株，兩地區(qū)腹瀉斷奶仔豬糞便帶菌率分別為30.3 %和32 %，冬季分離率33.3 %稍高于秋季28.6 %，其原因可能與Y.enterocolitica 的嗜冷性有關(guān)。以往的研究常通過檢測該菌黏附侵襲位點(diǎn)基因ail、耐熱腸毒素基因ystA 和ystB、粘附素基因yadA 及yops 蛋白相關(guān)的virF 基因和O∶3 血清型特異性基因rfbC 5 種基因的有無來判斷菌株是否具有致病性，典型的致病性菌株攜帶ail、ystA、yadA 和virF 基因，而攜帶ystB 基因的ail 陰性菌株和不攜帶毒力基因的菌株則無致病性[7-9]。Y.enterocolitica 致病性試驗(yàn)多見于小鼠，以口服途徑感染幼齡斷奶仔豬并發(fā)生腹瀉的病例鮮有報(bào)道[10-11]。本研究篩選到的18 株分離菌株可以分為3 株ail+菌株、10 株ystB+菌株和5 株無毒力基因菌株。Y7(ail+)引起小鼠腹瀉和死亡的同時(shí)，Y17(ail+)并未引起小鼠發(fā)病，并且分離株Y11(ystB+)及無毒力基因的Y9 和Y16 也可以引起小鼠的腹瀉和死亡，這與以往研究結(jié)果存在差異[7-9]。在斷奶仔豬本動物致病性試驗(yàn)中，分離株Y7(ail+)和分離株Y16(無毒力基因)均能夠引起仔豬腹瀉，并且從兩組仔豬后肢關(guān)節(jié)液、腸系膜淋巴結(jié)、肺和小腸內(nèi)容物中均可檢出Y.enterocolitica。Y11(ystB+)組仔豬雖未出現(xiàn)腹瀉癥狀，但該仔豬的關(guān)節(jié)腫脹癥狀在以往豬感染病例中并未有報(bào)道，并且仔豬糞便、腸系膜淋巴結(jié)和后肢關(guān)節(jié)液均可檢出該菌，提示Y.enterocolitica 感染斷奶仔豬后產(chǎn)生了新的臨床癥狀并存在隱性感染的現(xiàn)象。

本研究結(jié)果表明利用檢測Y.enterocolitica 毒力基因的方法來判斷其致病性具有局限性，在本實(shí)驗(yàn)中小鼠和斷奶仔豬感染Y.enterocolitica 后的臨床癥狀及臟器帶菌情況與以往的報(bào)道存在差異，其原因可能是該菌存在除外膜蛋白YadA、分泌蛋白YopS和耐熱腸毒素等致病因子以外更加復(fù)雜的致病機(jī)制。本研究初步證實(shí)Y.enterocolitica 在斷奶仔豬腹瀉發(fā)生過程中起到了一定的作用，深入研究該菌在斷奶仔豬腹瀉中的作用、角色以及對人類可能產(chǎn)生的影響具有很高的研究價(jià)值。斷奶仔豬經(jīng)口服感染Y.enterocolitica 后的關(guān)節(jié)病變提示斷奶仔豬可以作為研究該菌引起人類關(guān)節(jié)炎的感染模型。本研究為開展流行病學(xué)調(diào)查和更大規(guī)模臨床病例的分析以及建立豬感染模型的研究奠定基礎(chǔ)。

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