胡桃楸活性成分時空動態(tài)及抗腫瘤活性初步研究

羅 猛 喬 琪 牟璠松 阮 鑫 楊 璇 邢文淼 楊雨春 祁永會 段喜華*

(1.東北林業(yè)大學森林植物生態(tài)學教育部重點實驗室，哈爾濱 150040； 2.吉林省林業(yè)科學研究院，長春 130033； 3.黑龍江省林業(yè)科學研究所，哈爾濱 150081)

胡桃楸活性成分時空動態(tài)及抗腫瘤活性初步研究

羅 猛1喬 琪1牟璠松1阮 鑫1楊 璇1邢文淼1楊雨春2祁永會3段喜華1*

(1.東北林業(yè)大學森林植物生態(tài)學教育部重點實驗室，哈爾濱 150040；2.吉林省林業(yè)科學研究院，長春 130033；3.黑龍江省林業(yè)科學研究所，哈爾濱 150081)

采用超聲波輔助提取方法，以胡桃楸為原料，在單因素實驗的基礎上研究一年內不同月份胡桃楸不同部位總黃酮、總酚的含量變化，同時對胡桃楸提取物體外抗腫瘤活性進行初步評價。結果顯示，乙醇濃度60%，超聲時間40 min，料液比1∶20，提取溫度30℃為最佳提取參數。在此條件下，不同采摘時期胡桃楸不同部位的總黃酮、總酚含量存在顯著差異。5～7月份葉和小枝的總黃酮及總酚含量明顯高于8～10月份，其中7月份葉的總黃酮總酚含量最高，分別為12.56±0.33和76.98±3.73 mg·g-1，然而莖皮總黃酮、總酚含量隨月份增加呈持續(xù)下降趨勢。體外抗腫瘤研究表明胡桃楸葉提取物對人肝癌細胞SMMC-7721、人乳腺癌細胞MCF-7和人口腔表皮樣癌細胞KB的增殖抑制作用，其中7月份胡桃楸葉提取物對人乳腺癌MCF-7細胞增殖抑制作用更明顯，其IC50值為0.24 mg·mL-1。本研究為胡桃楸資源的合理開發(fā)及利用提供一定的理論基礎。

胡桃楸；總黃酮；總酚；季節(jié)動態(tài)；抗腫瘤

胡桃楸(JuglansmandshuricaMaxim)又稱胡桃楸、楸子或山核桃，是胡桃科(Jualandaceae)胡桃屬(JuglansL.)落葉喬木，主要分布于我國黑龍江、吉林、遼寧、河北、山西等地區(qū)[1]，為我國東北著名三大硬闊之一，是珍貴的用材樹種，也是重要的藥用植物，具有很高的開發(fā)價值[2]。胡桃楸的皮、葉和枝均具有消熱、解毒、抗癌、鎮(zhèn)痛等作用[3～4]。近年來的研究證實，胡桃楸中的主要化合物有黃酮類、酚類、鞣質類、二芳基庚烷類和有機酸類等[5～6]，其中黃酮類和酚類化合物具有抗腫瘤、抗菌、抑酶、抗氧化等作用[7]，對泌尿系統(tǒng)結石、慢性氣管炎、皮炎、濕疹及痢疾等疾病具有很好的療效[8～9]。

本文利用單因素實驗對胡桃楸超聲提取過程中影響總黃酮和總酚得率的主要影響因素乙醇濃度、提取時間、料液比、提取溫度進行優(yōu)化。應用優(yōu)化得出的提取條件來研究不同月份胡桃楸葉、莖皮、小枝及外果皮中總黃酮、總酚含量。同時，我們分別選取人肝癌細胞SMMC-7721，人乳腺癌細胞MCF-7和人口腔表皮樣癌細胞KB測定胡桃楸提取物體外抗腫瘤的活性。本文為胡桃楸的種植資源保護及其總黃酮、總酚化合物的開發(fā)利用提供理論依據。

1 實驗材料

原料為胡桃楸葉、莖皮、小枝和外果皮于2015年5～10月采自黑龍江省哈爾濱市東北林業(yè)大學實驗林場。采收到的胡桃楸樣品于恒溫通風干燥箱40℃干燥至恒重后，細粉、過篩至實驗所需粒度。4℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

2 實驗方法

2.1 超聲提取方法

準確稱取胡桃楸樣品10 g，置于錐形瓶中，加入60%的乙醇溶液200 mL，超聲提取3次，每次40 min，超聲功率250 W，溫度35℃。過濾，合并上清液，4℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 單因素實驗

2.2.1 乙醇濃度

準確稱量葉片粉末1.0 g，按照料液比1∶20，依次加入20%、30%、40%、50%、60%、70%的乙醇水溶液中，30℃條件下超聲40 min，將提取液過濾。用分光光度計分別測定在波長500和765 nm處的吸光度值，重復3次。

2.2.2 提取時間

準確稱量葉片粉末1.0 g，按照料液比1∶20，加入60%的乙醇溶液，提取溫度30℃，提取時間10、20、30、40、50和60 min，將提取液過濾。用分光光度計分別測定在波長500和765 nm處的吸光度值，重復3次。

2.2.3 料液比

準確稱量葉片粉末1.0 g，分別按照1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30的料液比，加入60%的乙醇溶液，提取溫度30℃，超聲提取時間40 min，將提取液過濾。用分光光度計分別測定在波長500和765 nm處的吸光度值，重復3次。

2.2.4 提取溫度

準確稱量葉片粉末1.0 g，按照料液比1∶20加入60%的乙醇溶液，提取溫度10、15、20、25、30和35℃，超聲提取時間40 min，將提取液過濾。用分光光度計分別測定在波長500和765 nm處的吸光度值，重復3次。

2.3 胡桃楸總黃酮含量的測定

胡桃楸總黃酮含量測定采用亞硝酸鈉—硝酸鋁—氫氧化鈉比色法測定。1 mL的樣品或蘆丁標準品于10 mL容量瓶中，加入60%乙醇4 mL后，加入5%(W/V)亞硝酸鈉溶液0.5 mL，搖勻，放置6 min后加入10%(W/V)硝酸鋁溶液0.5 mL，搖勻作用6 min，再加入1.0 mL(1 mol·L-1)氫氧化鈉溶液，最后用60%乙醇定容至10 mL。以每克試樣中蘆丁之相對含量(mg·g-1RE)表示總黃酮的含量[10]。

2.4 胡桃楸總酚含量的測定

采用福林酚比色法測定胡桃楸總酚含量。40 μL的樣品或沒食子酸標準品于試管中，加入1.8 mL Folin-Ciocalteu試劑，混合放置5 min，加質量分數7.5% Na2CO3溶液1.2 mL。室溫下靜置2 h，765 nm處測定吸光度。以吸光度為縱坐標，質量濃度為橫坐標繪制標準曲線，得回歸方程：

Y=0.7827X+0.0498(R2=0.99)

(1)

式中：Y表示波長765 nm處的吸光度；X表示沒食子酸的質量濃度。

以每克試樣中沒食子酸之相對含量(mg·g-1RE)表示總酚的含量[11]。

2.5 胡桃楸提取物抗腫瘤活性測定

分別同時培養(yǎng)人肝癌SMMC-7721細胞，人乳腺癌MCF-7細胞和人口腔表皮樣癌KB細胞，取對數生長期的細胞以每孔100 μL接種于96孔板中，37℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，去上清，加入每種細胞的藥物終濃度為0.031 25、0.062 5、0.125、0.25、0.5、1 mg·mL-1，對照組加入100 μL的配藥用培養(yǎng)液。每個濃度設4個平行孔，培養(yǎng)24 h，每孔加入5 mg·mL-1MTT 20 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，吸出培養(yǎng)液，加入100 μL DMSO振蕩10 min混合均勻，在570 nm波長處用酶標儀測定OD值[12]。計算抑制率：

抑制率=(對照孔OD值-實驗組OD值)/對照組OD值×100%

(2)

2.6 數據處理

采用Excel 2010軟件繪圖，SPSS軟件方差分析，運用Duncan T法進行二因素有重復實驗數據分析(P<0.05)。

3 結果與討論

3.1 胡桃楸活性組分提取工藝優(yōu)化

由圖1A可以看出當乙醇濃度為60%時，總黃酮和總酚的得率最高。乙醇濃度再增高，總黃酮和總酚的得率呈現出下降趨勢。原因是水會對物料起到溶脹作用，水含量較小會導致物料溶脹不充分，使得率降低[13]。不同提取時間對總黃酮和總酚得率的影響見圖1B。隨著提取時間的增加，總黃酮和總酚的得率呈上升的趨勢，但當提取時間超過40 min時得率的增長不顯著。因此選擇提取時間為40 min。由圖1C可知，料液比由1∶5到1∶25，總黃酮和總酚得率呈上升的趨勢。料液比超過1∶20時得率增長不顯著。在一定范圍內，增長料液比例會使提取更充分，但料液比達到一定時，提取已經較充分，所以再增大料液比對活性物質得率的影響不大[14]。從圖1D可知，提取溫度由10～30℃，總黃酮和總酚得率呈上升趨勢，提取溫度為35℃時得率反而有所下降，可能是因為溫度升高，導致對熱敏感的化合物降解，使得率降低[15]。

圖1 幾種因素對總酚和總黃酮得率的影響Fig.1 Effect of four factors on the total phenols and flavonoids contents

3.2 胡桃楸各部位不同采收時期總黃酮和總酚含量

從圖2A可以看出，胡桃楸不同部位中總黃酮含量相差較大，胡桃楸葉中總黃酮含量最高，其次是莖皮，小枝和外果皮含量相對較低。胡桃楸葉5月底開始生長至8月開始衰落，在葉生長之初總黃酮含量較低，隨著葉的不斷生長總黃酮的含量逐漸升高，7月底胡桃楸葉最茂盛，故總黃酮的含量達一年中最高值12.56±0.33 mg·g-1。8月份胡桃楸的葉開始變黃并枯萎，此后總黃酮含量逐漸減少，到10月末胡桃楸葉總黃酮含量最低，為6.57±0.28 mg·g-1。胡桃楸小枝中總黃酮含量季節(jié)變化規(guī)律與葉的變化規(guī)律相似，但胡桃楸小枝中總黃酮含量明顯低于葉中總黃酮的含量。7月份小枝總黃酮含量最高為2.28±0.06 mg·g-1，但僅為7月葉中含量的1/5。10月末胡桃楸小枝中總黃酮含量最低，為1.78±0.06 mg·g-1。然而，胡桃楸莖皮總黃酮含量變化規(guī)律呈整體下降趨勢，5月莖皮中總黃酮含量最高為6.24±0.18 mg·g-1，10月末莖皮中總黃酮含量為4.05±0.05 mg·g-1。對于8、9月采收的胡桃楸外果皮樣品，其中8月采收的外果皮中總黃酮的含量約是9月的1.97倍。從圖2B可以看出，不同采收時期胡桃楸各部位總酚含量具有和總黃酮含量相似的變化趨勢。7月葉片中總酚含量最高，為76.98±3.73 mg·g-1，莖皮中總酚含量最高為5月份，小枝和外果皮中總酚含量相對較低。

圖2 胡桃楸總黃酮和總酚含量時空動態(tài)變化Fig.2 Seasonal variations on TFC and TPC in different parts of J.mandshurica

3.3 胡桃楸提取物對腫瘤細胞的抑制作用

將5～10月葉片提取物在濃度為0.031 25、0.062 5、0.125、0.25、0.5、1 mg·mL-1時分別對人乳腺癌MCF-7細胞、人肝癌SMMC-7721細胞和人口腔表皮樣癌細胞KB處理24 h，由圖3可知，隨著加入提取物溶液濃度的增大，3種癌癥細胞的生存率也相應地降低，因此我們可以知道腫瘤細胞的生存率與提取物濃度具有一定的依賴性。

圖3 胡桃楸葉提取物對MCF-7，SMMC-7721和KB細胞生存率的影響Fig.3 The inhibition ratios of J.mandshurica Maxim leaf extract on MCF-7,SMMC-7721 and KB cell

不同月份胡桃楸葉提取物對癌癥細胞的抑制作用也有所差異。在設定濃度范圍內，與其他月葉提取物相比，采自7月葉提取物對3種癌癥細胞的抑制效果較突出，其對MCF-7、SMMC-7721和KB細胞的半數抑制濃度(IC50)分別為0.24、0.33和0.35 mg·mL-1。根據國內的相關文獻研究可知，胡桃楸樹皮提取物對SMMC-7721、MCF-7也具有良好抗腫瘤活性。相比胡桃楸樹皮，胡桃楸葉為可再生資源，容易獲得且總黃酮及總酚含量相對較高，本文研究7月胡桃楸葉提取物對以上兩種腫瘤細胞24 h的抑制作用與文獻中報道的樹皮提取物72 h的抑制作用效果相近[16]。因此，本研究對胡桃楸種植資源的保護以及開發(fā)利用提供一定的幫助。

3.4 胡桃楸提取物對腫瘤細胞形態(tài)的影響

將濃度為0、100、500和1 000 μg·mL-1的提取物分別處理MCF-7(A)、SMMC-7721(B)和KB(C)細胞后，3種腫瘤細胞發(fā)生了一系列形態(tài)改變。倒置顯微鏡下觀察到對照組細胞貼壁狀況良好，細胞生長增殖旺盛、細胞間相互連接，密集成片生長，折光性好。隨著提取物濃度增高，實驗組細胞有部分變圓浮起，細胞間接觸變松，增殖減慢。如圖4所示，100 μg·mL-組細胞的形態(tài)無明顯變化，貼壁狀況良好。當提取物濃度為500 μg·mL-1時，MCF-7和SMMC-7721細胞貼壁狀況不好，大部分細胞漂浮于培養(yǎng)液中，并可見壞死細胞和碎片；KB細胞胞形態(tài)欠規(guī)則，呈梭形或多邊形生長，少許呈圓形。當提取物濃度為1 000 μg·mL-1，3種細胞的折光性差，較暗，壞死細胞和碎片明顯增多。不同濃度的胡桃楸葉提取物對3種腫瘤細胞的增殖抑制作用，隨著藥物濃度增加，抑制作用增強，并呈劑量依賴性。

圖4 胡桃楸葉片不同濃度提取物對MCF-7(A)、SMMC-7721(B)和KB(C)細胞形態(tài)的影響Fig.4 Morphological observation of MCF-7(A),SMMC-7721(B) and KB(C) after the treatment with J.mandshurica leaf extract

3 結論

本實驗首先對超聲提取胡桃楸中總黃酮和總酚的因素進行了優(yōu)化，得到的最佳提取條件為：乙醇濃度60%，超聲時間40 min，料液比1∶20，提取溫度30℃。在此條件下對一年內不同月份胡桃楸不同部位總黃酮、總酚含量的動態(tài)變化進行了研究，研究發(fā)現胡桃楸葉中總黃酮含量最高，其次是莖皮，小枝和外果皮；不同采收時期胡桃楸各部位總酚含量與總黃酮含量具有相似的變化趨勢。此外，體外抗腫瘤活性結果表明，胡桃楸葉提取物抗腫瘤效果最好，在一定濃度范圍內對人乳腺癌MCF-7細胞、人肝癌SMMC-7721細胞和人口腔表皮樣癌KB細胞均有抑制作用。

1.俞文婕,王添敏,翟延君,等.星點設計—效應面法優(yōu)化胡桃楸莖枝中總鞣質提取工藝[J].中成藥,2013,35(7):1419-1424.

Yu W J,Wang T M,Zhai Y J,et al.Optimization of the extraction technology of total tannins from branches ofJuglansmandshuricaby central composite design-response surface method[J].Chinese Traditional Patent Medicine,2013,35(7):1419-1424.

2.汪向升,張詠莉.核桃楸的化學成分分析及其抗腫瘤活性概述[J].熱帶醫(yī)學雜志,2013,13(1):122-125.

Wang X S,Zhang Y L.Analysis of the chemical composition and antitumor activity ofJuglansmandshuricaMaxim[J].Journal of Tropical Medicine,2013,13(1):122-125.

3.Li Z B,Wang J Y,Yang J,et al.Apoptosis of BGC823 cell line induced by p-hydroxymethoxybenzobijuglone,a novel compound fromJuglansmandshurica[J].Phytotherapy Research,2009,23(4):551-557.

4.王秀華.核桃楸雌雄異熟性的初步研究[J].植物研究,2001,21(3):388-391.

Wang X H.Study on the DichogamyofJuglansmandshuricaMaxim[J].Bulletin of Botanical Research,2001,21(3):388-391.

5.Min B S,Lee H K,Lee S M,et al.Anti-human immunodeficiency virus-type 1 activity of constituents fromJuglansmandshurica[J].Archives of Pharmacal Research,2002,25(4):441-445.

6.Lee K S,Li G,Kim S H,et al.Cytotoxic diarylheptanoids from the roots ofJuglansmandshurica[J].Journal of Natural Products,2002,65(11):1707-1708.

7.張春梅,陳朝銀,林玉萍,等.幾種云南核桃內種皮黃酮及多酚含量的測定[J].云南中醫(yī)學院學報,2013,36(2):10-13.

Zhang C M,Chen C Y,Lin Y P,et al.Determination of the content of several yunnan walnut kernel pellicle flavonoids and polyphenols[J].Journal of Yunnan University of Traditional Chinese Medicine,2013,36(2):10-13.

8.翟梅枝,晏婷,王元,等.胡桃屬植物青皮和葉的化學成分及其生物活性研究進展[J].西北植物學報,2011,31(10):2133-2138.

Zhai M Z,Yan T,Wang Y,et al.Research advances on chemical ingredients and biological activity of green husk and leaves fromJuglansL.[J].Acta Botanica Boreali Occidentalia Sinica,2011,31(10):2133-2138.

9.王添敏,徐士釗,張慧,等.胡桃楸莖枝、葉和果實中總鞣質的動態(tài)變化[J].中成藥,2012,34(8):1567-1569.

Wang T M,Xu S Z,Zhang H,et al.Dynamic variation of total tannins content in stems,leaf and fruit ofJuglansmandshurica[J].Chinese Traditional Patent Medicine,2012,34(8):1567-1569.

10.何書美,劉敬蘭.茶葉中總黃酮含量測定方法的研究[J].分析化學,2007,35(9):1365-1368.

He S M,Liu J L.Study on the determination method of flavone content in tea[J].Chinese Journal of Analytical Chemistry,2007,35(9):1365-1368.

11.高暢,程大海,高欣,等.藍莓果渣提取物總酚含量及抗氧化活性研究[J].植物研究,2010,30(2):253-256.

Gao C,Cheng D H,Gao X,et al.Total phenolic content and antioxidant activities of blueberry pomace extracts[J].Bulletin of Botanical Research,2010,30(2):253-256.

12.徐春華.MTT法檢測大豆異黃酮對癌細胞的生長抑制作用[J].中央民族大學學報:自然科學版,2012,21(1):58-62.

Xu C H.The effect of soy isoflavone on mouse erythroleukemia cell line and rat liver cancer cell line by MTT[J].Journal of MUC:Natural Sciences Edition,2012,21(1):58-62.

13.羅猛,宋卓悅,胡嬌陽,等.超聲法提取山里紅葉總黃酮及其抗氧化活性研究[J].植物研究,2015,35(4):632-637.

Luo M,Song Z Y,Hu J Y,et al.Optimization of ultrasonic-assisted extraction of total flavonoids fromCrataeguspinnatifidaleaves and its antioxidant activities[J].Bulletin of Botanical Research,2015,35(4):632-637.

14.趙連飛,陳鳳麗,孫曦曉,等.牡丹種殼中丹皮酚和芍藥苷的微波提取及含量測定[J].植物研究,2014,34(4):561-566.

Zhao L F,Chen F L,Sun X X,et al.microwave-assisted extraction of Paeoniflorin and Paeonolfrom tree peony seed coat and content determination[J].Bulletin of Botanical Research,2014,34(4):561-566.

15.彭霄,段明慧,潘有智,等.微波輔助提取木豆根中染料木素工藝[J].植物研究,2012,32(6):756-759.

Peng X,Duan M H,Pan Y Z,et al.Microwave-assisted extraction of genisteinfrom pigeon pea(Cajanuscajan(L.) Millsp.) roots[J].Bulletin of Botanical Research,2012,32(6):756-759.

16.潘麗艷,郭喜平,李淑紅,等.胡桃楸樹皮提取物對SMMC-7721、MCF-7和A549腫瘤細胞的抑制作用及其機制[J].吉林大學學報:醫(yī)學版,2009,35(1):124-127.

Pan L Y,Guo X P,Li S H,et al.Inhibitory effects ofJuglansmandshuricaMaxim stem-bark extract on SMMC-7721,MCF-7 and A549 in vitro and mechanisms[J].Journal of Jilin University:Medicine Edition,2009,35(1):124-127.

National Key Research & Development Program of China(2017YFD0600605)；Heilongjiang Postdoctoral Funds for Scientific Research Initiation(LBH-Q13003)；Youth Fund of National Natural Science Foundation of China(21403032)

introduction：LUO Meng(1979—),male,Doctor,mainly engaged in plant active ingredient research.

date:2016-09-02

TemporalandSpatialVariationsofActiveIngredientsinJuglansmandshuricaMaximandTheirAnti-tumorActivity

LUO Meng1QIAO Qi1MU Fan-Song1RUAN Xin1YANG Xuan1XING Wen-Miao1YANG Yu-Chun2QI Yong-Hui3DUAN Xi-Hua1*

(1.Key Laboratory of Forest Plant Ecology,Ministry of Education,Northeast Forestry University,Harbin 150040； 2.Forestry Academy of Jinlin Province,Changchun 130033； 3.Heilongjiang Forestry Research Institute,Harbin 150081)

We used ultrasonic-assisted extractioncombined with single factor experiment to determine the dynamic changes of total phenolic and total flavonoid content from different parts ofJuglansmandshuricaMaxim,and measurethe inhibitive effect of extract fromJ.mandshuricaon tumors. The optimum extraction conditions were ethanol extract fraction of 60%, extract time of 40 min, solid-liquid ratio of 1∶20 and extraction temeperature of 30℃. According to the optimized extraction condition parameters,total flavonoid content, total phenolic content inJ.mandshuricawere significantly different during growth.Total flavonoid and phenolic contentextracted from leaves and sprig from May to Julyare higher than that from August to October. Total flavonoid and phenolic content inJ.mandshuricaleaves from July were the highest(12.56±0.33 and 76.98±3.73 mg·g-1).However,total flavonoid and phenolic content in the bark were decreased with the growth ofJ.mandshurica.Invitroanti-tumor studies show extracts fromJ.mandshuricaleaves can inhibit the growth of SMMC-7721, MCF-7 and KB cells.Extracts from the leaves ofJ.mandshuricain July significantly can inhibit the growth of MCF-7 human breast cancer cells, and the IC50is 0.24 mg·mL-1.

JuglansmandshuricaMaxim;total flavonoid;total phenolic;seasonal dynamic;antitumor activities

國家重點研發(fā)計劃項目(2017YFD0600605)；黑龍江省博士后科研啟動金(LBH-Q13003)；國家自然科學基金(21403032)

羅猛(1979—)，男，博士，主要從事植物活性成分研究。

* 通信作者：E-mail:duanxihua828@163.com

2016-09-02

* Corresponding author：E-mail:duanxihua828@163.com

S792.132

A

10.7525/j.issn.1673-5102.2017.06.019