外源NO對(duì)轉(zhuǎn)基因白樺外源基因表達(dá)及DNA甲基化的影響

孫豐坤 李思達(dá) 李吉祥 陳曉慧 曾凡鎖,2*

(1.東北林業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，哈爾濱 150040； 2.林木遺傳育種國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱 150040)

外源NO對(duì)轉(zhuǎn)基因白樺外源基因表達(dá)及DNA甲基化的影響

孫豐坤1李思達(dá)1李吉祥1陳曉慧1曾凡鎖1,2*

(1.東北林業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，哈爾濱 150040；2.林木遺傳育種國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱 150040)

為探討外源NO誘導(dǎo)轉(zhuǎn)基因白樺外源基因表達(dá)與基因組DNA甲基化之間的關(guān)系，本研究分析了NO供體硝普鈉(sodium nitroprusside,SNP)對(duì)轉(zhuǎn)基因白樺愈傷組織中外源基因BGT轉(zhuǎn)錄的影響，并對(duì)此過(guò)程中基因組DNA甲基化水平、甲基轉(zhuǎn)移酶基因DRM、MET表達(dá)量及生理生化指標(biāo)進(jìn)行研究。結(jié)果表明：2 mmol·L-1SNP處理后，轉(zhuǎn)基因白樺防御酶活性、丙二醛(MDA)含量顯著升高，表明高濃度NO對(duì)白樺細(xì)胞正常生命活動(dòng)產(chǎn)生了傷害；甲基轉(zhuǎn)移酶DRM和MET基因上調(diào)表達(dá)，基因組DNA甲基化水平由10.6%增加到16.5%，外源基因BGT表達(dá)量在6 h時(shí)顯著增加，3 d時(shí)僅為對(duì)照的0.46倍，說(shuō)明轉(zhuǎn)基因白樺外源BGT基因的表達(dá)對(duì)高濃度NO響應(yīng)明顯且受基因組甲基化水平的影響。本研究揭示了轉(zhuǎn)基因白樺外源BGT基因和甲基轉(zhuǎn)移酶MET、DRM基因?qū)Ω邼舛萅O的響應(yīng)模式，分析了基因組甲基化水平及生理生化特征的變化，為轉(zhuǎn)基因植物生長(zhǎng)發(fā)育的表觀遺傳調(diào)控和外源基因表達(dá)影響機(jī)制的研究奠定基礎(chǔ)。

NO；轉(zhuǎn)基因白樺；基因表達(dá)；甲基化

從NO(1992年)被Science評(píng)為“年度明星分子”以來(lái)，對(duì)其功能的研究逐漸成為植物學(xué)領(lǐng)域的熱點(diǎn)，NO對(duì)植物的影響具有濃度效應(yīng)[1]，低濃度NO能夠增強(qiáng)植物抗逆性[2～4]，調(diào)節(jié)植物的生長(zhǎng)發(fā)育[5～6]，特異性誘導(dǎo)植物發(fā)生去甲基化[7～8]，但當(dāng)NO濃度高于0.05 mmol·L-1則會(huì)對(duì)植物基因組造成損傷，抑制植物生長(zhǎng)甚至死亡。近年來(lái)NO的過(guò)量污染正在加劇，主要有臭氧層空洞、酸雨、汽車(chē)尾氣、水體污染、光化學(xué)煙霧等，正在威脅著植物生長(zhǎng)和人類(lèi)生產(chǎn)勞作，外源高濃度NO對(duì)植物基因組甲基化水平的影響研究較少，特別在木本植物中還未見(jiàn)報(bào)道。因此對(duì)高濃度NO環(huán)境下植物生理生化特征及基因組遺傳穩(wěn)定性的研究成為本研究的主要目標(biāo)。

DNA甲基化是轉(zhuǎn)基因植物中外源基因沉默的主要原因，轉(zhuǎn)入的外源基因或其整合位點(diǎn)通常會(huì)受到植物本身的排斥而發(fā)生甲基化，影響基因正常表達(dá)[9～10]。同時(shí)，轉(zhuǎn)基因植物在長(zhǎng)期生長(zhǎng)過(guò)程中，環(huán)境脅迫和信號(hào)產(chǎn)生的表觀變異對(duì)外源基因的表達(dá)的至關(guān)重要[11]。因此，外界高濃度NO對(duì)轉(zhuǎn)基因植物基因組DNA甲基化水平、外源基因的表達(dá)水平及此過(guò)程中植物防御酶系統(tǒng)的影響成為本研究的主要目的。本研究通過(guò)2 mmol·L-1SNP處理轉(zhuǎn)基因白樺愈傷組織，檢測(cè)了外源基因BGT、甲基化轉(zhuǎn)移酶基因MET、DRM表達(dá)量及生理生化特征的變化情況，并分析白樺基因組DNA甲基化水平及模式，揭示了白樺基因組DNA甲基化、甲基轉(zhuǎn)移酶MET、DRM對(duì)NO響應(yīng)模式、NO對(duì)白樺外源基因BGT表達(dá)的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

轉(zhuǎn)基因白樺材料為詹亞光等(2001)獲得的轉(zhuǎn)BGT抗蟲(chóng)基因單拷貝高表達(dá)的無(wú)性系TP46實(shí)生苗。利用WPM培養(yǎng)基(附加12 mg·L-1BA，20 g·L-1蔗糖，5.3 g·L-1瓊脂)，pH為5.5～6.0，誘導(dǎo)轉(zhuǎn)基因白樺實(shí)生苗腋芽長(zhǎng)出白樺組培苗，切取轉(zhuǎn)基因白樺組培苗莖段，利用NT培養(yǎng)基(附加0.1 mg·L-1BA+0.01 mg·L-1TDZ，20 g·L-1蔗糖，5.3 g·L-1瓊脂)，pH為5.5～6.0，誘導(dǎo)獲得轉(zhuǎn)基因白樺愈傷組織，每隔20 d繼代1次，培養(yǎng)溫度為25～27℃，光照強(qiáng)度為150 μmol·m-2·s-1，光照16 h·d-1。

將NO供體SNP添加到轉(zhuǎn)基因白樺愈傷組織培養(yǎng)體系中(50 mL培養(yǎng)基接種4 g(FW)愈傷組織)，使SNP終濃度為2 mmol·L-1，對(duì)照組加入等體積無(wú)菌水，分別在6 h、12 h、3 d、5 d、7 d取材，每個(gè)處理重復(fù)3次。

1.2 方法

1.2.1 生理指標(biāo)測(cè)定

稱(chēng)取0.3 g(FW)白樺愈傷組織，測(cè)定超氧化物歧化酶(SOD)[12]、過(guò)氧化物酶(POD)[13]、過(guò)氧化氫酶(CAT)[13]、苯丙氨酸解氨酶(PAL)[14]的活性及丙二醛(MDA)[14]含量。

1.2.2 基因表達(dá)量檢測(cè)

采用CTAB法提取白樺愈傷組織總RNA，利用TOYOBO反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄1 μg RNA成cDNA作為模板，模板稀釋10倍后使用Applied Biosystems 7500進(jìn)行qRT-PCR，引物見(jiàn)表1,實(shí)驗(yàn)方法參照TOYOBO熒光定量試劑盒說(shuō)明書(shū)，每個(gè)樣品重復(fù)3次，采用2-△△CT法進(jìn)行結(jié)果分析。

表1 qRT-PCR引物序列

1.2.3隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA標(biāo)記技術(shù)(RandomAmplifiedPolymorphicDNA，RAPD)檢測(cè)表觀遺傳變異

采用CTAB法提取白樺愈傷組織基因組DNA，用HpaⅡ、MspⅠ內(nèi)切酶分別對(duì)DNA進(jìn)行酶切，PCR篩選得到20對(duì)可產(chǎn)生多態(tài)性片段的引物(表2)，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后依據(jù)條帶變化進(jìn)行胞嘧啶甲基化分析，原則如下：若MspⅠ酶切后擴(kuò)增有條帶而對(duì)應(yīng)的HpaⅡ沒(méi)有帶，其后發(fā)生變化的，為內(nèi)側(cè)胞嘧啶完全甲基化位點(diǎn)；若HpaⅡ酶切后擴(kuò)增有條帶而對(duì)應(yīng)的MspⅠ沒(méi)有帶，其后發(fā)生變化的，為外側(cè)胞嘧啶半甲基化位點(diǎn)；若HpaⅡ和MspⅠ酶切后擴(kuò)增均有條帶，其后發(fā)生變化的，為未甲基化位點(diǎn)。

表2 RAPD引物名稱(chēng)及序列

2 結(jié)果與分析

2.1 2 mmol·L-1SNP處理下轉(zhuǎn)基因白樺甲基轉(zhuǎn)移酶基因DRM、MET及外源基因BGT表達(dá)分析

2 mmol·L-1SNP處理下轉(zhuǎn)基因白樺無(wú)性系TP46甲基轉(zhuǎn)移酶基因MET、DRM(圖1A)均上調(diào)表達(dá)。MET基因轉(zhuǎn)錄水平呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，3 d時(shí)表達(dá)量達(dá)到最大值，為對(duì)照組的51.1倍；DRM基因響應(yīng)時(shí)間較早，12 h時(shí)達(dá)到最大值，為對(duì)照組的38.1倍，之后表達(dá)量開(kāi)始下降但仍高于對(duì)照組。外源基因BGT(圖1B)響應(yīng)明顯，6 h前BGT基因上調(diào)表達(dá)，12 h表達(dá)量下降，僅為對(duì)照組的0.46倍，之后轉(zhuǎn)錄水平升高且均大于對(duì)照組，3 d時(shí)出現(xiàn)最大值，為對(duì)照組的16.9倍。

2.2 2 mmol·L-1SNP處理下轉(zhuǎn)基因白樺生理指標(biāo)分析

植物依靠體內(nèi)SOD、POD、CAT的酶促反應(yīng)清除過(guò)量的氧活性自由基，從而維持細(xì)胞內(nèi)活性氧的平衡。2 mmol·L-1SNP處理后，SOD、POD、CAT活性均顯著升高。SOD活性先上升后下降再上升，6 h、12 h時(shí)SOD活性顯著高于對(duì)照；POD、CAT活性呈逐漸升高的趨勢(shì)，分別在3 d后和7 d時(shí)顯著高于對(duì)照組。PAL作為催化苯丙烷類(lèi)代謝反應(yīng)的限速酶，在植物生長(zhǎng)發(fā)育、抗病抗逆境中起重要作用，2 mmol·L-1SNP處理后，PAL活性呈現(xiàn)逐漸升高的趨勢(shì)，5 d時(shí)酶活性最高，為對(duì)照組的1.03倍。

圖1 2 mmol·L-1SNP處理下DRM、MET及BGT基因相對(duì)表達(dá)量Fig.1 Relative expression of DRM,MET and BGT genes in birch under 2 mmol·L-1 SNP treatment

RAPD總位點(diǎn)數(shù)TotalnumberofRAPDsites未甲基化CCGG位點(diǎn)數(shù)NonmethylatedCCGGsites(%)甲基化CCGG位點(diǎn)數(shù)MethylatedCCGGsites(%)內(nèi)側(cè)全甲基化位點(diǎn)數(shù)Numberofinnermethylationsites(%)外側(cè)胞嘧啶半甲基化Numberofoutermethylationsites(%)對(duì)照Control198177(89.39)21(10.6)13(61.91)8(38.09)6h195174(89.23)31(15.9)18(54.55)13(39.39)12h210180(85.71)30(14.29)14(46.67)16(53.33)24h185157(84.86)28(15.14)16(57.14)12(42.86)3d200167(83.50)33(16.50)11(48.65)12(51.35)5d230194(84.35)36(15.65)20(55.56)16(44.44)7d208178(85.58)30(14.42)17(56.67)13(43.33)

圖2 2 mmol·L-1SNP處理后轉(zhuǎn)基因白樺防御酶活性及MDA含量Fig.2 Defense enzyme activity and MDA content of birch treated with 2 mmol·L-1 SNP

MDA是植物細(xì)胞膜膜脂氧化的產(chǎn)物，其含量在一定程度上可反應(yīng)植物損傷程度。2 mmol·L-1SNP處理后，白樺組織內(nèi)MDA含量顯著增加，在24 h時(shí)MDA含量達(dá)到對(duì)照的4.65倍，之后MDA含量一直維持較高水平且差異顯著。

2.3 2 mmol·L-1SNP處理下轉(zhuǎn)基因白樺DNA甲基化水平分析

利用甲基化敏感不同的MspⅠ和HpaⅡ結(jié)合RAPD分子標(biāo)記技術(shù)，檢測(cè)了2 mmol·L-1SNP處理后轉(zhuǎn)基因白樺愈傷組織DNA甲基化水平及模式的改變。通過(guò)對(duì)20對(duì)引物產(chǎn)生多態(tài)性片段(圖3)及DNA甲基化模式、水平(表3)進(jìn)行差異統(tǒng)計(jì)，20對(duì)引物21個(gè)模板共得到575條條帶，SNP處理使轉(zhuǎn)基因白樺基因組DNA甲基化水平明顯升高，3 d時(shí)達(dá)到最大值，占全部RAPD位點(diǎn)數(shù)的16.5%，TP46白樺甲基化位點(diǎn)數(shù)平均值達(dá)到14.8%，主要以?xún)?nèi)側(cè)胞嘧啶甲基化為主，占整體甲基化水平的54.45%。

圖3 S29號(hào)引物多態(tài)性擴(kuò)增結(jié)果 M. MspⅠ；H. HpaⅡ；A-D.差異條帶位置Fig.3 The polymorphism amplification results of S29 primer M. MspⅠ；H. HpaⅡ；A-D.The position of the difference strips

3 討論

NO作為激活植物過(guò)敏性反應(yīng)和系統(tǒng)獲得性抗性的內(nèi)源信號(hào)分子廣泛存在于植物體內(nèi)，不但能夠調(diào)節(jié)植物生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程，還在非生物脅迫中發(fā)揮重要作用[2～6,15]，其通過(guò)復(fù)雜的信號(hào)通路一方面減少活性氧ROS的生成，另一方面可以誘導(dǎo)抗氧化酶活性的升高來(lái)減輕氧化脅迫傷害[16]。但高濃度NO卻會(huì)對(duì)植物的生長(zhǎng)產(chǎn)生毒害作用[1]。

本研究發(fā)現(xiàn)，2 mmol·L-1SNP處理的白樺愈傷組織中，活性氧自由基清除酶SOD、POD、CAT在不同時(shí)間達(dá)到其活性最大值且與對(duì)照組差異顯著，PAL活性顯著增強(qiáng)，說(shuō)明白樺通過(guò)防御酶活性的升高來(lái)減輕外界SNP對(duì)細(xì)胞的傷害，維持正常生命活動(dòng)；同時(shí)MDA含量的降低也可以看出隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，白樺膜系統(tǒng)的傷害程度逐漸降低，但直至7 d，MDA含量仍高于對(duì)照組，再次證明了高濃度NO會(huì)對(duì)植物產(chǎn)生毒害作用。NO提高防御酶活性的主要原因是其對(duì)含鐵相關(guān)酶類(lèi)有很高親和性[17],本研究中NO對(duì)植物防御酶活性誘導(dǎo)效果不同的原因可能與NO在相關(guān)酶信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中的位置有關(guān)，也可能與外界高濃度SNP脅迫下防御酶在膜脂過(guò)氧化中的位置和調(diào)節(jié)機(jī)制有關(guān)。

NO不但參與了植物的生長(zhǎng)發(fā)育和對(duì)外界脅迫應(yīng)答等生理過(guò)程[5,15]，還會(huì)對(duì)植物基因組的表觀遺傳穩(wěn)定性產(chǎn)生影響，誘導(dǎo)DNA甲基化的變異[18]。植物中MET基因具有維持CpG位點(diǎn)甲基化功能，能夠維持植物體內(nèi)的甲基化水平[19]，DRM具有催化DNA從頭甲基化的活性，在響應(yīng)相應(yīng)信號(hào)和建立甲基化印記中發(fā)揮重要作用。本研究中高濃度SNP處理下，白樺基因組DNA甲基化水平顯著升高，甲基化位點(diǎn)總數(shù)由10.6%增加到了16.5%，這與高粱中的研究結(jié)果一致[9]，表明高濃度NO使白樺DNA甲基化水平顯著升高。白樺DRM基因表達(dá)量對(duì)高濃度NO響應(yīng)明顯，在12 h時(shí)達(dá)到最高，說(shuō)明白樺基因組內(nèi)發(fā)生了從頭甲基化，白樺MET基因同樣表現(xiàn)為上調(diào)表達(dá)，在3 d時(shí)表達(dá)量達(dá)到最高，推測(cè)原因是此時(shí)白樺基因組內(nèi)的高甲基化水平的維持需要MET的參與，總之，白樺甲基轉(zhuǎn)移酶DRM和MET的上調(diào)表達(dá)在基因組DNA甲基化水平升高過(guò)程中起著重要作用，白樺基因組甲基化水平的增加可能是為了抵御外界高濃度NO對(duì)白樺的損傷。

眾所周知，DNA甲基化是轉(zhuǎn)基因植物外源基因沉默的主要原因，本研究材料為轉(zhuǎn)BGT抗蟲(chóng)基因單拷貝且高表達(dá)的無(wú)性系TP46白樺，2 mmol·L-1SNP處理6 h時(shí)，外源基因BGT基因上調(diào)表達(dá)，表明外源基因BGT對(duì)外界高濃度NO響應(yīng)明顯；6 h后，白樺甲基轉(zhuǎn)移酶DRM基因表達(dá)量逐漸升高，基因組DNA甲基化水平顯著增加，外源BGT基因的表達(dá)量開(kāi)始下降，12 h時(shí)，白樺DRM基因表達(dá)量達(dá)到最高，此時(shí)外源BGT基因表達(dá)量?jī)H為對(duì)照組的0.46倍，可以看出，6 h后白樺DRM基因表達(dá)量的升高及基因組甲基化水平的增加使得外源BGT基因的表達(dá)受到抑制。有意思的是，6 h后雖然白樺MET基因轉(zhuǎn)錄及基因組DNA甲基化維持在一個(gè)較高水平，但BGT基因表達(dá)量卻在24 h后開(kāi)始升高且在3 d時(shí)達(dá)到最大值，推測(cè)原因是在白樺基因組DNA甲基化水平不變的情況下，外源基因BGT相關(guān)表達(dá)核酸序列發(fā)生了去甲基化，轉(zhuǎn)錄水平逐漸升高直，同樣Boyko等在研究LRR轉(zhuǎn)基因煙草時(shí)發(fā)現(xiàn)，煙草花葉病毒侵染煙草后導(dǎo)致基因組DNA甲基化水平升高，但抗病基因LRR結(jié)構(gòu)域編碼區(qū)段甲基化水平卻在降低[20]。本研究中對(duì)于外源基因BGT相關(guān)核酸序列是否發(fā)生了去甲基化還需進(jìn)一步研究。

綜上所述，本研究分析了外源高濃度NO對(duì)轉(zhuǎn)基因白樺外源基因BGT表達(dá)量的影響，明確了基因組DNA甲基化水平及模式、生理生化特征的變化情況，為進(jìn)一步研究外界高濃度NO對(duì)植物生長(zhǎng)發(fā)育的調(diào)控機(jī)制提供理論依據(jù)，同時(shí)為以后的林木遺傳育種及生產(chǎn)實(shí)踐提供理論依據(jù)及方法參考。

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The central university basic research business expenses special fund project(2572014DA04)；National Natural Science Foundation of China(J1210053,31200463)

introduction：SUN Feng-Kun(1989—),male,master,the main research direction: plant genetic engineering.

date:2017-03-16

EffectsofExogenousNitricOxideonExogenousGeneExpressionandDNAMethylationinTransgenicBirch

SUN Feng-Kun1LI Si-Da1LI Ji-Xiang1CHEN Xiao-Hui1ZENG Fan-Suo1,2*

(1.College of Life science,Northeast Forestry University,Harbin 150040； 2.Key Laboratory of Forest Tree Genetic Improvement and Biotechnology of Nation,Northeast Forestry University,Harbin 150040)

In order to investigate the relationship between transgene expression and the methylation of genomic DNA induced by 2 mmol·L-1SNP in Transgenic birch, the effect of SNP(sodium nitroprusside) on the expression of exogenousBGT, methyltransferase geneDRM,METand the level of DNA methylation were determined in transgenic birch callus. The activities of defense enzymes and the MDA(malondialdehyde) content in transgenic birch were increased significantly, which indicated high concentration of NO had harm on the normal life of birch cells. The methyltransferaseDRMand MET genes were up-regulated and the methylation level of genomic DNA was increased from 10.6% to 16.5%. The transcription level ofBGTwas improved at 6 h and only 0.46 folds of the control at 3 d, which suggested the expression of exogenousBGTgene in transgenic brich was affected by high concentration of NO and the level of genomic methylation. The results revealed the response patterns of exogenous gene and methyltransferase gene and determined the genomic methylation level and physiological and biochemical characteristics to the high concentration of NO in birch, which will provide some references for further study of epigenetic regulation and regulation of exogenous gene expression in transgenic plants.

NO;transgenic birch;gene expression;methylation

中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費(fèi)專(zhuān)項(xiàng)資金項(xiàng)目(2572014DA04)；國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(J1210053,31200463)

孫豐坤(1989—)，男，碩士研究生，主要從事植物基因工程方面的研究。

* 通信作者：E-mail：zeng@nefu.edu.cn

2017-03-16

* Corresponding author：E-mail：zeng@nefu.edu.cn

S792.153

A

10.7525/j.issn.1673-5102.2017.06.010