萱草花瓣中類胡蘿卜素分析樣品的制備及UPCC-MS檢測(cè)方法研究

趙薪鑫 焦 芳 孫國峰 張金政*

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué)風(fēng)景園林藝術(shù)學(xué)院，楊凌 712100； 2.中國科學(xué)院植物研究所北方資源植物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100093； 3.北京市花木有限公司，北京 100044)

萱草花瓣中類胡蘿卜素分析樣品的制備及UPCC-MS檢測(cè)方法研究

趙薪鑫1,2焦 芳2,3孫國峰2張金政1,2*

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué)風(fēng)景園林藝術(shù)學(xué)院，楊凌 712100；2.中國科學(xué)院植物研究所北方資源植物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100093；3.北京市花木有限公司，北京 100044)

以大苞萱草(HemerocallismiddendorfiiTrautv.et Mey.)和‘原諒’萱草(H.‘Pardon Me’)為研究對(duì)象，對(duì)萱草屬植物花瓣中類胡蘿卜素的樣品制備方法以及UPCC-MS定性和定量檢測(cè)方法進(jìn)行了研究。結(jié)果表明：(1)萱草花瓣類胡蘿卜素樣品制備過程中，不同的提取試劑、振蕩方法及皂化方法對(duì)類胡蘿卜素的提取效率均有顯著影響，經(jīng)過對(duì)提取結(jié)果的方差分析，確定最佳的樣品制備方案為：提取試劑B丙酮∶正己烷(3∶5/V∶V)、溫控?fù)u床振蕩提取，常溫皂化16 h；(2)UPCC-MS技術(shù)能在10 min內(nèi)高效分離萱草花瓣中的類胡蘿卜素，且使用的有毒化學(xué)試劑少，是檢測(cè)類胡蘿卜素的較好選擇；(3)大苞萱草和原諒萱草花瓣中共含有20種類胡蘿卜素物質(zhì)，兩者顏色不同，類胡蘿卜素的組成和含量也存在差異。

萱草；類胡蘿卜素；樣品制備方法；UPCC-MS

萱草屬(Hemerocallis)植物是百合科(Liliaceae)多年生宿根草本花卉，具有適應(yīng)性強(qiáng)、姿態(tài)優(yōu)美、花色及花形豐富、花期長(zhǎng)等特點(diǎn)，是庭園、花壇及街道綠化的理想花卉[1]。經(jīng)過多年的雜交育種，現(xiàn)代萱草幾乎具有除藍(lán)色和黑色以外的全部顏色，但對(duì)其花色素的研究還較少[2～3]，對(duì)萱草花瓣中類胡蘿卜素的研究有利于揭示萱草屬植物花色的形成原因。

類胡蘿卜素是由植物和一些微生物合成的脂溶性的天然色素[4]，廣泛存在于植物的葉綠體和有色體膜上，絕大多數(shù)呈黃色、橙色和紅色[5]。許多高等植物的果實(shí)和花瓣呈現(xiàn)出的黃色或橙色均源于存在于其細(xì)胞中的類胡蘿卜素化合物[6]。同時(shí)，作為一種食用性色素，類胡蘿卜素不僅具有很好的著色功能，在抗衰老、增強(qiáng)人體免疫力、防癌和抗癌、防輻射和預(yù)防心血管疾病等方面同樣具有顯著的生理活性[7～12]。而萱草屬的很多種類如黃花菜(H.citrinaBaroni)、小黃花菜(H.minorMill.)、北黃花菜(H.lilioasphodelusL.)等可以作為食用蔬菜。因此，對(duì)萱草花中類胡蘿卜素提取和檢測(cè)方法的開發(fā)有利于對(duì)食用萱草的營養(yǎng)價(jià)值做更全面的評(píng)價(jià)。

天然類胡蘿卜素的提取和檢測(cè)方法的研究一直是類胡蘿卜素研究的熱點(diǎn)。同時(shí)，由于類胡蘿卜素結(jié)構(gòu)特殊、同分異構(gòu)體較多，對(duì)其進(jìn)行準(zhǔn)確的檢測(cè)也是研究難點(diǎn)。目前，檢測(cè)類胡蘿卜素最為常用的方法是高效液相色譜—質(zhì)譜聯(lián)用法(High performance liquid chromatography-Mass Spectrum，HPLC-MS)和超高效液相色譜—質(zhì)譜聯(lián)用法(Ultra performance liquid chromatography-Mass Spectrum，UPLC-MS)[13～17]，但這兩種方法洗脫程序復(fù)雜，耗時(shí)較長(zhǎng)，極易引起類胡蘿卜素在分析過程中的降解，且洗脫過程需要消耗大量有機(jī)試劑，對(duì)環(huán)境污染較大。超高效合相色譜(Ultra performance convergence chromatography，UPCC)是一種融合了超臨界流體色譜(Supercritical fluid chromatography，SFC)和UPLC優(yōu)勢(shì)的新的分離技術(shù)，使用UPCC分析類胡蘿卜素具有如下優(yōu)點(diǎn)：(1)UPCC所用流動(dòng)相主要為超臨界CO2，大大減少有毒試劑使用，綠色環(huán)保；(2)UPCC分析類胡蘿卜素，大大減少了分析時(shí)間，從而減少樣品在分析過程中的降解，使分析結(jié)果更加可靠；(3)UPCC對(duì)類胡蘿卜素同分異構(gòu)體有很好的分離效果；(4)UPCC檢測(cè)提高了分辨率和檢測(cè)的靈敏度，對(duì)于含量較低的類胡蘿卜素也能檢出。

目前，尚未有報(bào)道用UPCC的方法對(duì)萱草中類胡蘿卜素進(jìn)行檢測(cè)分析。本研究以大苞萱草的花瓣為實(shí)驗(yàn)材料，采用UPCC-MS的方法進(jìn)行檢測(cè)，探究不同的提取試劑、振蕩方法以及皂化方法對(duì)萱草花瓣中類胡蘿卜素提取效果的影響，并獲得從萱草花瓣中制備類胡蘿卜素樣品的最佳方法。再以大苞萱草和‘原諒’萱草花瓣作為橙黃色和紅色兩種花色的代表，分析不同顏色萱草花瓣中類胡蘿卜素組成和含量的差別，為探究萱草屬植物花色成因和全面評(píng)價(jià)萱草屬植物的食用價(jià)值提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 試驗(yàn)材料與分析方法

1.1 試材與取樣

植物材料為新鮮的大苞萱草和‘原諒’萱草花瓣。試驗(yàn)所用大苞萱草和‘原諒’萱草均種植于中國科學(xué)院植物研究所萱草種質(zhì)資源圃，以同樣的栽培措施進(jìn)行管理。在兩種萱草開花盛期，于晴朗的早晨摘取完全開放的萱草花，將花瓣分離，洗凈，然后放入-40℃冰箱中進(jìn)行預(yù)凍。預(yù)凍后經(jīng)真空冷凍干燥機(jī)干燥，加液氮研磨至均勻細(xì)粉，并放入干燥器中備用。

1.2 試驗(yàn)儀器與試劑

儀器包括：分光光度計(jì)(Metash UV-8000S)，超高效合相色譜—串聯(lián)四級(jí)桿質(zhì)譜聯(lián)用儀(Waters ACQUITYTMUPCC-PDA，Xevo TQ MS)；氮吹儀(海能HN200)；磨樣機(jī)(IKA A11 basic)、溫控?fù)u床(HS-200B)、低速離心機(jī)(京立，LD 4-1.8)。

試劑包括：色譜級(jí)β-胡蘿卜素(β-carotene)標(biāo)準(zhǔn)品、色譜級(jí)葉黃素(lutein)標(biāo)準(zhǔn)品、色譜級(jí)玉米黃質(zhì)(zeaxanthin)標(biāo)準(zhǔn)品；色譜級(jí)乙醇(ethanol)、色譜級(jí)叔丁基甲醚(MTBE)、色譜級(jí)2,6-二叔丁基對(duì)甲苯酚(BHT)、超純水、分析純正己烷(n-hexane)、分析純丙酮(acetone)、分析純乙醚(diethyl ether)、分析純氯化鈉(NaCl)、分析純氫氧化鉀(KOH)。

1.3 類胡蘿卜素的樣品制備方法探究

1.3.1 類胡蘿卜素樣品制備步驟

根據(jù)相關(guān)參考文獻(xiàn)[15,18～20]，對(duì)樣品制備方法設(shè)置提取試劑、振蕩方法和皂化方法三個(gè)因子。提取試劑有5種，分別為：A乙醇∶正己烷(4∶3/V∶V)；B丙酮∶正己烷(3∶5/V∶V)；C乙醇∶丙酮∶正己烷(2∶1∶3/V∶V)；D乙酸乙酯∶正己烷(1∶1/V∶V)；E丙酮∶乙醇(1∶1/V∶V)。振蕩方法有兩種，分別為：A溫控?fù)u床震蕩提取超聲提?。籅超聲提取。皂化方法有兩種，分別為：A室溫下(20±5℃)溫控?fù)u床中皂化16 h；B溫控?fù)u床中55℃皂化1 h。樣品制備方法探究一共20個(gè)組合，每個(gè)組合3次重復(fù)。整個(gè)制備過程在弱光環(huán)境中進(jìn)行，具體步驟如下：

稱取0.02 g研磨好的的大苞萱草花瓣細(xì)粉放入玻璃試管中，并加入適量的BHT作為抗氧化劑，防止類胡蘿卜素在提取過程中被氧化，然后分別加入4 mL上述的提取劑，超聲或溫控?fù)u床振蕩提取10 min，之后再加入4 mL正己烷，同樣超聲或溫控?fù)u床振蕩提取10 min。加入2 mL 10%的NaCl溶液后，在4℃條件下靜置15 min，4 000 r·min-1離心10 min，收集溶液的上層有機(jī)相，下層水相加入正己烷：乙醚(3∶1/V∶V)溶液2 mL，超聲或溫控?fù)u床振蕩提取10 min后，4 000 r·min-1離心10 min，收集溶液的上層有機(jī)相。重復(fù)加入正己烷∶乙醚(3∶1/V∶V)溶液2 mL提取，至下層溶液無色，并合并收集的所有有機(jī)相。有機(jī)相用氮吹儀吹干，準(zhǔn)備進(jìn)行皂化反應(yīng)。

皂化反應(yīng)所用溶液為6%的KOH-甲醇溶液，分別用以上所述兩種皂化方法進(jìn)行皂化。皂化反應(yīng)完成后，在皂化液中加入2 mL 10%的NaCl溶液，在4℃條件下靜置15 min，再用正己烷∶乙醚(3∶1/V∶V)溶液重復(fù)超聲或溫控?fù)u床振蕩提取至下層溶液無色，得到最終的提取液，用氮吹儀吹干后用于儀器檢測(cè)。

1.3.2 不同樣品制備方法的提取效率比較

提取效率通過提取的類胡蘿卜素總量來衡量。上述得到的干燥殘?jiān)? mL色譜級(jí)的正己烷溶解后，用Metash UV-8000S型分光光度計(jì)進(jìn)行吸光度測(cè)試，以β-胡蘿卜素標(biāo)準(zhǔn)品的濃度表示類胡蘿卜素的總含量。

1.4 UPCC-PDA-TQ-MS法檢測(cè)類胡蘿卜素

利用分光光度計(jì)法選出來的最佳樣品制備方法，按照1.3.1所述制備步驟提取類胡蘿卜素用于UPCC-PDA-TQ-MS法的檢測(cè)。進(jìn)樣前，干燥濃縮好的樣品用2 mL的色譜級(jí)MTBE溶解，并過0.22 μm有機(jī)濾膜。通過對(duì)流動(dòng)相種類和流動(dòng)相梯度的優(yōu)化，確定最終的色譜條件為：流動(dòng)相A相為色譜級(jí)乙醇，B相為超臨界CO2，檢測(cè)時(shí)，流動(dòng)相的流速為1.5 mL·min-1，選用色譜柱為ACQUITYTMUPCC HSS C18 SB柱(1.8 μm,3.0 nm×100 nm)，柱溫為35℃，檢測(cè)波長(zhǎng)為440 nm，進(jìn)樣量1 μL，流動(dòng)相梯度如下：0 min，5%B；5 min，20%B；7 min，20%B；8 min，5%B；10 min，5%B。質(zhì)譜電離模式為APCI模式，質(zhì)譜參數(shù)如下：錐孔電壓4.0 kV，離子源溫度150℃，探針溫度450℃，氮?dú)饬魉?50 L·h-1，碰撞氣體氬氣的流速為0.15 mL·min-1，補(bǔ)償液為0.1%甲酸—甲醇溶液，流速0.4 mL·min-1；數(shù)據(jù)的采集軟件為MassLynx 4.1。

1.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線制作及回收率試驗(yàn)

標(biāo)準(zhǔn)曲線制作時(shí)，β-carotene母液濃度為0.5 mg·mL-1，分別取母液4、8、12、16和20 μL，均稀釋至200 μL；lutein母液濃度為1 mg·mL-1，分別取10、20、30、40和50 μL，稀釋至100μL；zeaxanthin的母液濃度為1 mg·mL-1，分別取4、8、12、16和20 μL，然后稀釋至200 μL。梯度溶液配置好后，依次進(jìn)樣，得到不同濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液的色譜峰面積，再以標(biāo)準(zhǔn)品濃度為x軸，色譜峰面積為y軸建立擬合曲線，得到的線性方程即為各標(biāo)準(zhǔn)品的標(biāo)準(zhǔn)曲線(表1)。由于有些標(biāo)準(zhǔn)品無法從市場(chǎng)購得，所以沒有標(biāo)準(zhǔn)品的物質(zhì)通過結(jié)構(gòu)類似物做半定量。此外，通過向樣品中添加標(biāo)準(zhǔn)品(β-carotene、lutein和zeaxanthin，1 mg·mL-1，10 μL)的方法檢驗(yàn)樣品制備方法的回收率。

表1標(biāo)準(zhǔn)曲線方程、相關(guān)系數(shù)及回收率

Table1Standardcurveequation,correlationcoefficientandrecovery

標(biāo)準(zhǔn)品Standards標(biāo)準(zhǔn)曲線Standardcurveequationa相關(guān)系數(shù)R2b回收率Recoveryc(%)β-caroteney=189.79x-130110.991091.39luteiny=2463.9x-295290.995392.18zeaxanthiny=2800.3x-1937410.994893.20

注：a.回歸方程y=kx+m；y. HPLC色譜峰面積；x.樣品濃度(μg·mL-1)；b.R2表示回歸方程的相關(guān)系數(shù)；c.回收率通過樣品加標(biāo)回收方法得到；回收率=(加標(biāo)樣品中物質(zhì)的濃度—樣品中物質(zhì)的濃度)/所加標(biāo)準(zhǔn)品的濃度×100%

Notes：a.In standard curve equationy=kx+m；y.Represent peak area；x.Represent concentration of standards；b.Correlation coefficient of standard curve equation；c.Recovery=(concentration of sample with added standards-concentration of sample)/concentration of standard added

1.6 數(shù)據(jù)分析

對(duì)不同提取試劑、振蕩方法和皂化方法對(duì)提取的類胡蘿卜素總量進(jìn)行方差分析，由Excel和SPSS軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同樣品制備方法的提取效率比較

(1)不同提取試劑的提取效率：對(duì)不同的提取試劑提取的類胡蘿卜素總量做鄧肯檢測(cè)(Duncan Test)，結(jié)果表明：提取試劑B丙酮∶正己烷(3∶5/V∶V)和D乙酸乙酯∶正己烷(1∶1/V∶V)提取的類胡蘿卜素總量較高，分別為56.37±1.90和53.92±1.90 mg·g-1，兩者之間沒有顯著差異(在P<0.05水平上差異不顯著)；其次為提取試劑C乙醇∶丙酮∶正己烷(2∶1∶3/V∶V)和A乙醇∶正己烷(4∶3/V∶V)，提取的類胡蘿卜素總量分別為50.91±1.90和48.18±1.90 mg·g-1，兩者之間沒有顯著差異；而提取試劑E丙酮∶乙醇(1∶1/V∶V)的提取效率最低，僅為43.40±1.90 mg·g-1。因此，若只考慮提取試劑這一因素對(duì)提取效果的影響，可優(yōu)先選擇丙酮∶正己烷(3∶5/V∶V)或乙酸乙酯∶正己烷(1∶1/V∶V)。

(2)不同振蕩方法對(duì)提取效果的影響：結(jié)果顯示，溫控?fù)u床振蕩的方法提取的類胡蘿卜素總量為56.43±1.20 mg·g-1，顯著高于用超聲振蕩提取的44.68±1.20 mg·g-1。這種差異產(chǎn)生的原因可能是盡管在超聲過程中往水中加入了冰塊，但超聲振蕩能量太高，造成局部溫度過高，而類胡蘿卜素結(jié)構(gòu)很容易受高溫的影響[20]，造成原有類胡蘿卜素的解體，從而使樣品中的類胡蘿卜素含量顯著減少。所以在類胡蘿卜素樣品制備過程中，應(yīng)盡量避免使用超聲振蕩的方式進(jìn)行提取。

(3)不同皂化方法對(duì)提取效果的影響：盡管常溫皂化和高溫皂化都是文獻(xiàn)報(bào)道中常用的兩種方法[15,19]，但是，本試驗(yàn)的研究結(jié)果表明，常溫皂化更有利于類胡蘿卜素的提取。常溫下皂化16 h，提取的類胡蘿卜素總量為53.73±1.20 mg·g-1，而55℃條件下高溫皂化1 h，提取的類胡蘿卜素總量為47.38±1.20 mg·g-1，僅為前者的88.18%，這也是由于高溫容易使類胡蘿卜素降解。

(4)提取試劑和振蕩方法交互作用對(duì)類胡蘿卜素提取效果的影響：在類胡蘿卜素提取過程中，提取試劑和振蕩方法會(huì)對(duì)提取效果產(chǎn)生相互影響。表2列出了兩個(gè)因素交互作用下提取的類胡蘿卜素總量均值及其標(biāo)準(zhǔn)差。選取提取試劑B和振蕩方法A時(shí)，提取的類胡蘿卜素總量最高，達(dá)到67.318±2.68 mg·g-1，比提取總量第二的組合高出10.161 mg·g-1，而提取的類胡蘿卜素總量最低組合為選用提取試劑E和振蕩方法B，僅為36.014±2.68 mg·g-1，僅為最佳組合的53.50%。由此可知，在確定最后的樣品制備方法時(shí)，應(yīng)選取提取試劑B和振蕩方法A組合，以提高類胡蘿卜素提取效率。

表2提取試劑和振蕩方法共同作用對(duì)類胡蘿卜素提取效果的影響

Table2Theinfluenceofinteractionbetweenextractionsolventsandshakingmethodsonextractionresult

振蕩方法Shakingmethod提取試劑ExtractionsolventsABCDEA53.265±2.6867.318±2.6853.609±2.6857.157±2.6850.682±2.68B43.098±2.6845.414±2.6848.209±2.6850.781±2.6836.014±2.68

(5)不同樣品制備方法提取類胡蘿卜素總量的多因素方差分析：通過對(duì)不同樣品制備方法提取的類胡蘿卜素總量進(jìn)行多因素方差分析，得到的結(jié)果如表3。試驗(yàn)設(shè)置的三個(gè)因素：5種提取試劑、兩種振蕩方法和兩種皂化方法對(duì)類胡蘿卜素總量提取效率均有極顯著影響(在P<0.01水平上差異顯著)；提取試劑和振蕩方法的交互作用對(duì)類胡蘿卜素總量的提取效率有顯著影響(在P<0.05水平上差異顯著)。

表3樣品制備方法各因素對(duì)提取效果的影響

Table3Influenceofvariousfactorsofsamplepreparationonextractionresult

方差來源aSourceofvariance自由度DegreeoffreedomF值Fvalue顯著性Significance提取試劑Extractionsolvent47.0680.000**振蕩方法Shakingmethod147.7420.000**皂化方法Saponificationmethod114.0040.001**提取試劑×振蕩方法Extractionsolvent×Shakingmethod43.1660.024*提取試劑×皂化方法Extractionsolvent×Saponificationmethod42.5060.057振蕩方法×皂化方法Shakingmethod×Saponificationmethod12.3680.132提取試劑×振蕩方法×皂化方法Extractionsolvent×Shakingmethod×Saponificationmethod40.2350.917

注：a.“×”表示兩個(gè)或三個(gè)因素的共同作用對(duì)提取效率的影響；**.P<0.01水平上差異顯著；*.P<0.05水平上差異顯著

Note: a.“×” represent that the interaction between two or three factors;**.Represent significant differences at the level ofP<0.01;*. Represent significant differences at the level ofP<0.05

從以上分析中可以知道，提取試劑、振蕩方法和皂化方法這三個(gè)因素只考慮單因素時(shí)，分別需要選擇提取試劑只考慮提取試劑B丙酮∶正己烷(3∶5/V∶V)和D乙酸乙酯∶正己烷(1∶1/V∶V)、溫控?fù)u床振蕩和室溫皂化16 h這三個(gè)梯度；但由于提取試劑和振蕩方法的交互作用也對(duì)類胡蘿卜素總量的提取效率有顯著影響，所以在選擇時(shí)需要綜合考慮這兩個(gè)因素交互作用對(duì)類胡蘿卜素提取效率的影響。雖然這三個(gè)因素的交互作用對(duì)類胡蘿卜素的提取效率沒有顯著影響，但鑒于類胡蘿卜素對(duì)高溫敏感，還是采取常溫皂化的方法為宜。因此本研究最終確定的最佳提取方案為提取試劑B丙酮∶正己烷(3∶5/V∶V)、溫控?fù)u床振蕩提取，常溫皂化16 h。

2.2 類胡蘿卜素的鑒定

由于所購得的標(biāo)準(zhǔn)品種類有限，沒有標(biāo)準(zhǔn)品作為對(duì)照的類胡蘿卜素我們通過幾種途徑進(jìn)行鑒定。首先依據(jù)的是其質(zhì)譜信息；但由于類胡蘿卜素存在諸多順反異構(gòu)體，無法完全通過質(zhì)譜信息進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定，需要通過紫外光譜特征進(jìn)行鑒定。紫外光譜主要有2個(gè)參數(shù)作為定性依據(jù)：最大吸收波長(zhǎng)(λmax)和Q-ratio[15,21～22]。大多數(shù)類胡蘿卜素結(jié)構(gòu)中存在順式(cis)鍵時(shí)，最大吸收波長(zhǎng)有藍(lán)移效應(yīng)(hypsochromic shift)，即最大吸收波長(zhǎng)相對(duì)于全反式結(jié)構(gòu)(all-trans)要?。?Q-ratio是光譜吸收峰中，順式峰(cis-peak)的高度與最大吸收峰峰高的比值(圖1)，是類胡蘿卜素順反異構(gòu)體鑒定的重要依據(jù)。通過比較試驗(yàn)得到的λmax、Q-ratio和參考文獻(xiàn)中報(bào)道的這三個(gè)值，可以基本確定不同種類類胡蘿卜素的順反異構(gòu)體(表4)。

圖1 全反式番茄紅素(--)和15-順式番茄紅素()的紫外吸收光譜圖[4]Fig.1 Photodiode array spectra of all-trans-lycopene(--) and 15-cis-lycopene()

Table4IdentificationofcarotenoidsandthecompositionandcontentofcarotenoidsintwodifferentcolorsofHemerocallispetals

保留時(shí)間Retentiontime物質(zhì)名稱Compoundsname最大吸收波長(zhǎng)λmaxQ-ratio質(zhì)譜信息MSdata含量干重Content(mg·g-1DW)大苞萱草H.middendorfiiTrautv.etMey.‘原諒’萱草H.‘PardonMe’參考文獻(xiàn)References2.57all-trans-β-Carotene436、462、488—536[M]+34.2442.372.78β-caroteneisomer328、434、4580.50536[M]+6.016.0021、233.35β-caroteneisomer371、437、463—536[M]+、467[M-69]+12.037.263.50aluteinisomer262、427、4560.24569[M+H]+、551[M+H-18]+16.031.1618、163.635,6-epoxy-β-Carotene437、462、4850.14553[M+H]+、535[M+H-18]+、461[M+H-92]+—7.17243.73aluteinisomer262、456、4890.21569[M+H]+、551[M+H-18]+—2.573.91bα-cryptoxanthin434、463、489—552[M]+、460[M-92]+3.833.9325、244.039or9'-cis-lutein371、437、4630.15569[M+H]+、551[M+H-18]+2.374.3426、21、234.29β-cryptoxanthin437、463—553[M+H]+、461[M+H-92]+6.866.22224.41aDihydrolutein264、433、4580.17570[M]+、552[M-18]+0.861.104.5cis-β-cryptoxanthin266、437、4630.14553[M+H]+、461[M+H-92]+4.814.244.56luteinisomer270、437、4630.15569[M+H]+2.912.5618、164.84luteinisomer263、433、4580.18569[M+H]+2.041.735.07aviolaxanthin428、4570.21624[M+Na]+、601[M]+、583[M-18]+—5.86235.23lutein438,463—592[M+Na]+、569[M+H]+、551[M+H-18]+2.671.105.28antheraxanthin263、433、4590.13585[M+H]+、493[M+H-92]+4.277.46155.37bzeaxanthinisomer266、437、4630.15569[M+H]+4.83—5.40aall-trans-neoxanthin413、438、462—624[M+Na]+、601[M]+、583[M-18]+—3.78155.52zeaxanthin438、4640.15568[M]+、477[M+H-92]+18.376.535.89bzeaxanthinisomer328、434、4580.38569[M+H]+、551[M+H-18]+、477[M+H-92]+4.25—總量Total126.38115.36

圖2 UPCC方法優(yōu)化前后效果對(duì)比圖 A.梯度優(yōu)化前；B.流動(dòng)相優(yōu)化前；C.流動(dòng)相和梯度優(yōu)化后Fig.2 Optimization of UPCC analysis A.Before gradient optimization; B.Before mobile phase optimization; C.After gradient and mobile phase optimization

2.3 類胡蘿卜素UPCC-MS檢測(cè)方法優(yōu)化

UPCC方法的流動(dòng)相B相固定為超臨界CO2，A相可變，因此，在探究UPCC分析方法時(shí)，改變流動(dòng)相A相的種類來探究較優(yōu)方法。通過比較甲醇和乙醇的洗脫效果(圖2)，最終選定流動(dòng)相A相為乙醇。為探究流動(dòng)相梯度是否對(duì)洗脫效果有影響，選定流動(dòng)相A相后又改變了原定的流動(dòng)相梯度，前后效果如圖(圖2)。結(jié)果表明，流動(dòng)相梯度的變化對(duì)洗脫效果有很明顯的影響。最終選定梯度如1.4所述。質(zhì)譜參數(shù)通過標(biāo)準(zhǔn)品調(diào)諧獲得。

2.4 兩種不同顏色萱草花瓣中的類胡蘿卜素種類及含量

大苞萱草(顏色為RHSCC Yellow Orange 23A)和‘原諒’萱草(RHSCC顏色為Red 47A)花瓣中類胡蘿卜素種類和含量如表4所示。大苞萱草花瓣中含有16種類胡蘿卜素物質(zhì)，總含量為126.38 mg·g-1(DW)，其中含量最高的是all-trans-β-carotene，含量為34.24 mg·g-1(DW)，含量最低的為dihydrolutein，含量為0.86 mg·g-1(DW)。‘原諒’萱草花瓣中含有18種類胡蘿卜素，總含量為115.36 mg·g-1(DW)，含量最高的也是all-trans-β-carotene，為42.37 mg·g-1(DW)，dihydrolutein和lutein的含量均最低，為1.10 mg·g-1(DW)。比較兩種不同顏色的萱草花瓣中類胡蘿卜素的組成和含量可知，兩種花瓣中所含類胡蘿卜素種類有所差別，差異最大的是‘原諒’萱草花瓣中含有violaxanthin、all-trans-neoxanthin和5,6-epoxy-β-Carotene這三種物質(zhì)而大苞萱草花瓣中沒有；大苞萱草花瓣中含有cis zeaxanthin但‘原諒’萱草花瓣中不含有。兩者的類胡蘿卜素總量相差不大。

3 討論

UPCC作為一種新型的色譜分離技術(shù)，對(duì)分析像類胡蘿卜素這樣極性小的物質(zhì)具有極大的便捷之處。在本研究中，只需10 min便可分析一個(gè)樣品，極大提高了分離的效率，也減少了化學(xué)試劑的消耗；設(shè)置的梯度洗脫程序?qū)悠分械念惡}卜素有很高的分離度，共分離出20種類胡蘿卜素物質(zhì)；UPCC技術(shù)采用超臨界CO2作為流動(dòng)相之一，另一流動(dòng)相為乙醇，減少了有毒化學(xué)試劑的使用，更符合綠色化學(xué)的理念。因此，本研究開發(fā)的UPCC-MS檢測(cè)類胡蘿卜素的方法具有很強(qiáng)的使用價(jià)值和廣闊的應(yīng)用性。

萱草作為一種重要的觀賞植物，構(gòu)成其花瓣色彩豐富的化學(xué)物質(zhì)基礎(chǔ)和花色形成機(jī)制尚未完全研究清楚。開展萱草花瓣中類胡蘿卜素的研究，結(jié)合本研究組之前已對(duì)萱草花瓣中類黃酮化合物(包括花青素)的研究，更有利于系統(tǒng)地揭示萱草花色的成因。而且，黃花菜作為中國的傳統(tǒng)蔬菜，早在2000多年前就被人食用，基于類胡蘿卜素多樣的保健作用，可以推測(cè)，我國古代勞動(dòng)人民將黃花菜作為蔬菜食用或許正是因?yàn)槠渲泻胸S富的類胡蘿卜素物質(zhì)。因此，本試驗(yàn)開發(fā)的萱草花瓣中類胡蘿卜素的樣品制備方法和檢測(cè)方法對(duì)萱草屬和其他屬植物一些食用品種食用品質(zhì)的評(píng)價(jià)具有很好的借鑒作用和實(shí)際的應(yīng)用價(jià)值。

1.李秀華,杜貞,武銀玉,等.大花萱草組培快繁體系的研究[J].植物研究,2009,29(6):757-762.

Li X H,Du Z,Wu Y Y,et al.Research on tissue culture regeneration ofHemerocallismiddendorfii[J].Bulletin of Botanical Research,2009,29(6):757-762.

2.焦芳.萱草屬植物花香揮發(fā)性成分及類黃酮色素分析[D].北京:中國科學(xué)院大學(xué),2016.

Jiao F.Analysis of the volatile components of floral fragrances and flavonoids in the genusHemerocallis[D].Beijing:University of Chinese Academy of Sciences,2016.

3.Griesbach R J,Batdorf L.Flower pigments withinHemerocallisfulvaL.fm.fulva,fm.rosea,and fm.disticha[J].Hortscience April,1995,30(2):353-354.

4.Rodriguez-amaya D B.A guide to carotenoid analysis in foods[M].Washington,D.C.:International Life Sciences Institute,2001.

5.戴雄澤,王利群,陳文超,等.辣椒果實(shí)發(fā)育過程中果色與類胡蘿卜素的變化[J].中國農(nóng)業(yè)科學(xué),2009,42(11):4004-4011.

Dai X Z,Wang L Q,Chen W C,et al.Changes of fruit colors and carotenoid contents during the development of pepper fruit[J].Scientia Agricultura Sinica,2009,42(11):4004-4011.

6.李福枝,劉飛,曾曉希,等.天然類胡蘿卜素的研究進(jìn)展[J].食品工業(yè)科技,2007,28(9):227-232.

Li F Z,Liu F,Zeng X X,et al.The research progress of natural carotenoid[J].Science and Technology of Food Industry,2007,28(9):227-232.

7.Semba R D,Lauretani F,Ferrucci L.Carotenoids as protection against sarcopenia in older adults[J].Archives of Biochemistry and Biophysics,2007,458(2):141-145.

8.Rao A V,Rao L G.Carotenoids and human health[J].Pharmacological Research,2007,55(3):207-216.

9.Tanaka T,Shnimizu M,Moriwaki S.Cancer chemoprevention by carotenoids[J].Molecules,2012,17(3):3202-3242.

10.Bolhassani A,Khavari A,Bathaie S Z.Saffron and natural carotenoids:biochemical activities and anti-tumor effects[J].Biochimica et Biophysica Acta(BBA)-Reviews on Cancer,2014,1845(1):20-30.

11.Srinivasan M,Kalpana K B,Devipriya N,et al.Protective effect of lycopene on whole body irradiation induced liver damage of Swiss albino mice:pathological evaluation[J].Biomedicine & Preventive Nutrition,2014,4(2):87-94.

12.Gammone M A,Pluchinotta F R,Bergante S,et al.Prevention of cardiovascular diseases with carotenoids[J].Frontiers in Bioscience,2017,9(1):165-171.

13.嚴(yán)娟,蔡志翔,沈志軍,等.黃肉桃果實(shí)中類胡蘿卜素提取和測(cè)定方法研究[J].果樹學(xué)報(bào),2015,32(6):1267-1274.

Yan J,Cai Z X,Shen Z J,et al.Extraction and analytical methods of carotenoids in fruit of yellow flesh peach[J].Journal of Fruit Science,2015,32(6):1267-1274.

14.Kurz C,Carle R,Schieber A.HPLC-DAD-MSn characterisation of carotenoids from apricots and pumpkins for the evaluation of fruit product authenticity[J].Food Chemistry,2008,110(2):522-530.

15.Delpino-rius A,Eras J,Marsol-vall A,et al.Ultra performance liquid chromatography analysis to study the changes in the carotenoid profile of commercial monovarietal fruit juices[J].Journal of Chromatography A,2014,1331:90-99.

16.Li H Y,Deng Z Y,Liu R H,et al.Ultra-performance liquid chromatographic separation of geometric isomers of carotenoids and antioxidant activities of 20 tomato cultivars and breeding lines[J].Food Chemistry,2012,132(1):508-517.

17.陳敏氡,朱海生,溫慶放,等.UPLC測(cè)定草莓果實(shí)中類胡蘿卜素含量[J].果樹學(xué)報(bào),2013,30(4):706-711.

Chen M D,Zhu H S,Wen Q F,et al.Determination of carotenoids in strawberry by UPLC[J].Journal of Fruit Science,2013,30(4):706-711.

18.Lin C H,Chen B H.Determination of carotenoids in tomato juice by liquid Chromatography[J].Journal of Chromatography A,2003,1012(1):103-109.

19.Liu S C,Lin J T,Yang D J.Determination of cis- and trans- α- and β-carotenoids in Taiwanese sweet potatoes(Ipomoeabatatas(L.) Lam.) harvested at various times[J].Food Chemistry,2009,116(3):605-610.

20.De Quirós A R B,COSTA H S.Analysis of carotenoids in vegetable and plasma samples:A review[J].Journal of Food Composition and Analysis,2006,19(2-3):97-111.

21.Chen J P,Tai C Y,Chen B H.Improved liquid chromatographic method for determination of carotenoids in Taiwanese mango(MangiferaindicaL.)[J].Journal of Chromatography A,2004,1054(1-2):261-268.

22.Lacker T,Strohschein S,Albert K.Separation and identification of various carotenoids by C30reversed-phase high-performance liquid chromatography coupled to UV and atmospheric pressure chemical ionization mass spectrometric detection[J].Journal of Chromatography A,1999,854(1-2):37-44.

23.Inbaraj B S,Chien J T,Chen B H.Improved high performance liquid chromatographic method for determination of carotenoids in the microalgaChlorellapyrenoidosa[J].Journal of Chromatography A,2006,1102(1-2):193-199.

24.Rivera S M,Christou P,Canela-garayoa R.Identification of carotenoids using mass spectrometry[J].Mass Spectrometry Reviews,2014,33(5):353-372.

25.Rivera S,Vilaró F,Canela R.Determination of carotenoids by liquid chromatography/mass spectrometry:effect of several dopants[J].Analytical and Bioanalytical Chemistry,2011,400(5):1339-1346.

26.Liu H L,Kao T H,Chen B H.Determination of carotenoids in the Chinese medical herb Jiao-Gu-Lan(GynostemmapentaphyllumMAKINO) by liquid chromatography[J].Chromatographia,2004,60(7-8):411-417.

Beijing municipal science and technology commission project(D161100001916001)

introduction：ZHAO Xin-Xin(1992—),female,master,specializing in cultivation and application of garden plants.

date:2017-02-16

SamplePreparationandUPCC-MSDeterminationMethodofCarotenoidsinPetalsofHemerocallis

ZHAO Xin-Xin1,2JIAO Fang2,3SUN Guo-Feng2ZHANG Jin-Zheng1,2*

(1.College of Landscape Architecture and Arts,Northwest Agriculture and Forestry University,Yangling 712100； 2.Key Laboratory of Plant Resources,Institute of Botany,Chinese Academy of Sciences,Beijing 100093； 3.Beijing Florascape Company,Beijing 100044)

The petals ofHemerocallismiddendorfiiTrautv. et Mey. andH. ‘Pardon Me’ were used to study the sample preparation method of carotenoids, and the samples were qualitatively and quantitatively analyzed by UPCC-MS. Results showed that: (1)In the process of carotenoids sample preparation, different extraction solvents, shaking methods and saponification methods have significant influence on the extraction efficiency of carotenoids, and by multi-factor analysis of variance, the optimal extraction method was determined as follows: B acetone:hexane(3:5/V:V) as extraction solvents, extracted in a shaking incubator and saponification 16 h at room temperature; (2)UPCC-MS technology can separate the carotenoids in samples efficiently in 10 min, and with lesser use of toxic chemicals, UPCC-MS can considered to be a good choice for analyzing carotenoids; (3)There are 20 kinds of carotenoids inH.middendorfiiandH. ‘Pardon Me’ petals, and these two kinds of materials with different colors had different composition and content of carotenoids.

Hemerocallis;carotenoids;sample preparation;UPCC-MS

北京市科學(xué)技術(shù)委員會(huì)項(xiàng)目(D161100001916001)

趙薪鑫(1992—)，女，碩士研究生，主要從事園林植物培育與應(yīng)用方面的研究。

* 通信作者：E-mail：caohua@ibcas.ac.cn

2017-02-16

* Corresponding author：E-mail：caohua@ibcas.ac.cn

Q949.71+8.23

A

10.7525/j.issn.1673-5102.2017.06.016