基于轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的杜仲紅葉性狀SSR分子標(biāo)記分析

苗作云 楊 赟 劉攀峰 鄭新芳 杜紅巖 朱景樂*

(1.中國林業(yè)科學(xué)研究院經(jīng)濟(jì)林研究開發(fā)中心，鄭州 450003； 2.黃河科技學(xué)院，鄭州 450063； 3.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)，鄭州 450002； 4.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)，廣州 510642)

基于轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的杜仲紅葉性狀SSR分子標(biāo)記分析

苗作云1,2楊 赟3劉攀峰1鄭新芳4杜紅巖1朱景樂1*

(1.中國林業(yè)科學(xué)研究院經(jīng)濟(jì)林研究開發(fā)中心，鄭州 450003；2.黃河科技學(xué)院，鄭州 450063；3.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)，鄭州 450002；4.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)，廣州 510642)

對‘華仲12號’杜仲的幼嫩葉片(綠色)和成熟葉片(紅色)及‘華仲11號’杜仲成熟葉片(綠色)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序，進(jìn)行測序數(shù)據(jù)的拼接和組裝，且對轉(zhuǎn)錄組獲得的基因(Unigenes)進(jìn)行SSR分析。研究得到54 517條平均長度為806.90 bp的Unigenes，其中25 993條Unigenes在Nr、Swiss-Prot、KEGG和COG蛋白數(shù)據(jù)庫獲得功能注釋，占所有Unigenes的47.68%。參照KEGG數(shù)據(jù)庫，可將注釋到的6 910條Unigenes劃分到122個(gè)代謝途徑分支，其中花色苷代謝途徑相關(guān)酶基因39個(gè)，類黃酮代謝途徑38個(gè)，類胡蘿卜素合成途徑34個(gè)。54 517條Unigenes中共包含17 010個(gè)完整型SSR位點(diǎn)，占總SSR位點(diǎn)的96.28%。完整型SSR位點(diǎn)共包含67種重復(fù)基元，其中出現(xiàn)頻率最高的重復(fù)基元類型為單核苷酸重復(fù)中的A/T(7 747個(gè))，其次是AG/CT(5 039個(gè))和AT/AT(850個(gè))從花色苷代謝途徑、類黃酮代謝途徑及類胡蘿卜素代謝途徑中共找到13個(gè)SSR位點(diǎn)。為今后杜仲遺傳多樣性分析、遺傳圖譜構(gòu)建及杜仲紅葉性狀分子標(biāo)記開發(fā)等方面奠定了分子基礎(chǔ)。

杜仲；紅葉；微衛(wèi)星；轉(zhuǎn)錄組；高通量測序

杜仲(EucommiaulmoidesOliv.)屬杜仲科(Eucommiaceae)，單科單屬單種，是中國重要的名貴經(jīng)濟(jì)樹種，雌雄異株，風(fēng)媒花。其在我國27個(gè)省(區(qū)、市)均有分布，不但是中國分布最廣的膠源植物和名貴中藥材[1]，還是一種理想的城市綠化和庭院觀賞樹種[2]。‘華仲12號’杜仲是中國林科院經(jīng)濟(jì)林中心審定的觀賞與藥用價(jià)值兼?zhèn)涞亩胖倭挤N，雄株，花量大，葉片呈紫紅色[3～4]。除了‘華仲12號’杜仲外，尚有一些關(guān)于紅(紫)葉性狀的報(bào)道[5～6]，且這些報(bào)道稱發(fā)現(xiàn)紅葉性狀單株的位置距離很遠(yuǎn)，陜西和湖南都有發(fā)現(xiàn)[7～8]，隨著對杜仲紅葉性狀的關(guān)注，不斷有新的具有該性狀的杜仲單株被發(fā)現(xiàn)。但所報(bào)道的具備紅葉性狀的資源親緣關(guān)系如何，其是在各自群體發(fā)生基因突變？亦或通過種子異地調(diào)運(yùn)等方式將攜帶的遺傳信息帶到其他省份等原因尚未可知，目前尚無關(guān)于如何鑒定這些紅葉單株親緣關(guān)系的報(bào)道，亦未見關(guān)于紅葉性狀分子標(biāo)記開發(fā)的報(bào)道。

微衛(wèi)星分子標(biāo)記又稱 SSR 分子標(biāo)記技術(shù)，因其具備多態(tài)性高、共顯性和特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，在遺傳多樣性分析、DNA指紋圖譜的構(gòu)建、基因定位、分子標(biāo)記輔助育種等方面得到廣泛應(yīng)用[9～10]。隨著轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)的成熟及成本降低，根據(jù)生物的轉(zhuǎn)錄組序列開發(fā)SSR標(biāo)記日益受到研究者青睞，其不但具有時(shí)空特異性，且開發(fā)的分子標(biāo)記與某一性狀連鎖性強(qiáng)，從而使其在用于植物遺傳多樣性和分子標(biāo)記輔助育種研究的準(zhǔn)確性更高[11]。

本研究擬在‘華仲12號’杜仲的幼嫩葉片和成熟葉片及‘華仲11號’杜仲成熟葉片6個(gè)樣品轉(zhuǎn)錄組測序的基礎(chǔ)上，采用生物信息學(xué)方法對拼接組裝后的微衛(wèi)星特征分析等，為開發(fā)杜仲葉片的紅葉性狀分子標(biāo)記奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 研究材料

本研究以1年生‘華仲12號’杜仲和‘華仲11號’杜仲嫁接苗為對象，從中選擇‘華仲12號’杜仲幼嫩葉片(呈綠色，編號H1)，‘華仲12號’杜仲成熟葉片(呈紅色，編號H3)及‘華仲11號’杜仲成熟葉片(呈綠色，編號L4)，將3個(gè)葉片混合成一個(gè)樣品，生物學(xué)重復(fù)2次，共計(jì)6個(gè)樣品，樣品編號方法為取樣狀態(tài)—重復(fù)號，如H1-1即為‘華仲12號’杜仲幼嫩葉片的第一個(gè)生物學(xué)重復(fù)，依次類推。

1.2 總RNA提取

6個(gè)樣品分別提取總RNA，使用Trizol Kit(Promega,USA)試劑盒提取RNA，并對通過Agilent 2100 Bioanalyzer檢測RNA濃度及峰值，判斷所得RNA是否達(dá)到RNA-Seq的試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)(總量≥20 ng、質(zhì)量濃度≥400 ng·μL-1、OD260/280為1.8～2.2、RNA integrity number值≥8、28S/18S>1.0)。

1.3 cDNA文庫的構(gòu)建

各樣品分別構(gòu)建cDNA文庫，通過Agilent 2100儀器檢測文庫的長度，并用熒光定量PCR儀測定文庫的濃度，合格的文庫用Illumina HiSeq2000分別進(jìn)行測序。

1.4 原始數(shù)據(jù)處理及序列組裝

對原始測序數(shù)據(jù)進(jìn)行過濾后(去除含adaptor的reads、N的比例大于10%的reads及低質(zhì)量reads(質(zhì)量值Q≤5的堿基數(shù)占整個(gè)read的50%以上))，采用Trinity(20140717)軟件對所得數(shù)據(jù)進(jìn)行混合從頭組裝，得到杜仲葉片的Unigenes序列。

1.5 Unigenes的功能注釋、功能分類和代謝通路分析

通過blastx(2.2.29+)將Unigenes序列比對到蛋白數(shù)據(jù)庫Nr、Swiss-Prot、KEGG和COG(E-value<0.000 01)，獲得Unigenes在4大數(shù)據(jù)庫中的功能注釋。根據(jù)Nr注釋信息，使用Blast2GO(2.3.5)軟件得到Unigenes的GO注釋信息[12]。然后用WEGO軟件對所有Unigenes做GO功能分類統(tǒng)計(jì)[13]。根據(jù)Unigenes的kegg功能注釋結(jié)果，對所有的Unigenes進(jìn)行代謝通路分析[14]。

1.6 SSR位點(diǎn)分析

采用MISA(version 1.0)軟件(Microsatellite identificantion tool,http://pgrc. ipk-gatersleben .de /misa)搜索杜仲葉片轉(zhuǎn)錄組中Unigenes的簡單重復(fù)序列SSR[15]，并對SSR重復(fù)基元類型進(jìn)行特征分析。查找標(biāo)準(zhǔn)為單核苷酸基元最少重復(fù)10次，而二、三、四、五和六核苷酸基元?jiǎng)t最少重復(fù)6、5、4、4和4次。

2 結(jié)果與分析

2.1 RNA質(zhì)量檢驗(yàn)

RNA濃度及峰值的Agilent 2100檢測結(jié)果見圖1，所提RNA條帶清晰，濃度、RIN值及RNA總量均達(dá)到測序標(biāo)準(zhǔn)，具有明顯的檢測峰，符合RNA測序的需求，可直接進(jìn)行下一步測序。

2.2 測序結(jié)果與組裝

對杜仲葉片RNA測序后共得到331 016 720條clean reads，GC含量為50.68%，Q20值為96.03%，各項(xiàng)指標(biāo)均符合轉(zhuǎn)錄組測序的要求。利用Trinity軟件[16]對樣品數(shù)據(jù)進(jìn)行組裝共得到54 517條Unigenes，組裝的N50為1 377 nt，平均長度為806.90 nt，組裝效果較好。其中GC含量為42.17%，長度為200～300 nt的序列最多，有15 902條，其次為300～400和400～500 nt的序列，具體的Unigenes的長度分布見圖2。

圖2 杜仲葉片的Unigene長度分布圖Fig.2 Unigene length distribution of E.ulmoides ‘Hongye’

圖3 四大數(shù)據(jù)庫注釋維恩圖Fig.3 Four database notes Venn diagram

2.3 Unigenes功能注釋

利用BLAST軟件[17]將Unigenes序列分別與NR、GO、COG和KEGG數(shù)據(jù)庫比對分析，后統(tǒng)計(jì)每個(gè)庫上注釋到的Unigenes數(shù)目。統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示共有25 993條Unigenes得到注釋，28 524條Unigenes未得到注釋，注釋比例僅為47.68%，其中Nr數(shù)據(jù)庫中注釋的有25 929條，在Swissprot數(shù)據(jù)庫中注釋到的有18 070，在COG數(shù)據(jù)庫中注釋到的有8 674條，在KEGG數(shù)據(jù)庫中注釋到的有6 910條。上述基因中有27 732條基因能編碼蛋白序列，占總Unigenes數(shù)量的50.87%。

將所有Unigenes在Nr、Swiss-Prot、KEGG和COG四大數(shù)據(jù)庫中的最佳比對結(jié)果的比對E值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，將其分為6個(gè)范圍，并統(tǒng)計(jì)每個(gè)范圍內(nèi)的基因個(gè)數(shù)比對E值(Unigenes與數(shù)據(jù)庫中匹配序列為同源序列的假陽性概率)，具體信息見圖4，從中可知Nr數(shù)據(jù)庫中信息更加可靠。

圖4 Unigene注釋結(jié)果分別在4大數(shù)據(jù)庫中的E值分布圖Fig.4 The distribution of the E values in the 4 databases

圖5 物種分布統(tǒng)計(jì)圖(只展示前十種)Fig.5 Species distribution map (showing only the first ten)

利用blastx將組裝出來的Unigenes序列與Nr數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對后，取每個(gè)Unigenes在Nr庫中比對結(jié)果最好(E值最低)的那一條序列為對應(yīng)同源序列(如有并列，取第一條)，確定同源序列所屬物種，統(tǒng)計(jì)比對到各個(gè)物種的同源序列數(shù)量見圖5，同源基因比對得到杜仲中有6 032條Unigenes與葡萄(Vitisvinifera)數(shù)據(jù)庫中信息接近，其Unigenes數(shù)量占Nr數(shù)據(jù)庫注釋的總Unigenes數(shù)量的23.26%，說明與葡萄屬的親緣關(guān)系更近，其次是可可樹(Theobromacacao)和番茄(Solanumlycopersicum)，接近的Unigenes數(shù)量分別為4 535條和3 638條，所占的比例分別是17.49%和14.03%。在后期的研究中可優(yōu)先參考這幾個(gè)物種的遺傳信息。

2.4 Unigenes功能分類

2.4.1 Unigenes的GO分類

為了進(jìn)一步研究Unigenes的功能，將所得Unigenes向GO數(shù)據(jù)庫的各個(gè)term進(jìn)行映射，發(fā)現(xiàn)共有12 421個(gè)Unigenes在生物過程(biologicalprocess)、細(xì)胞組分(cellularcomponent)和分子功能(molecularfunction)分類中得到了GO注釋。其中，在生物過程中，涉及代謝過程(metabolic process)、細(xì)胞過程(cellular process)和刺激響應(yīng)(response to stimulus)的Unigenes數(shù)較多，分別占GO注釋Unigenes數(shù)的52.20%(6484 Unigenes)、48.59%(6 035 Unigenes)和19.31%(2 399 Unigenes)；在細(xì)胞組分中，涉及細(xì)胞(cell)、細(xì)胞部分(cell part)和細(xì)胞器(organelle)的Unigenes較多，分別占GO注釋Unigenes的55.29%(6 868 Unigenes)、55.29%(6 868 Unigenes)和38.63%(4 799 Unigenes)；在分子功能中，涉及催化活性(catalytic activity)和結(jié)合(binding)的Unigenes較多，分別占GO注釋Unigenes的52.17% (6480 Unigenes)和47.37%(5 884 Unigenes)。

2.4.2 Unigenes的COG分類

利用COG數(shù)據(jù)庫比對分析共得到13434條杜仲Unigenes的同源序列，它們分為25個(gè)類別(圖7)，其中復(fù)制、重組和修飾(1 342，9.99%)、轉(zhuǎn)錄(1 238，9.22%)和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)(1 077，8.02%)等與生物過程相關(guān)的Unigenes數(shù)量最多；其次是與功能預(yù)測類別相關(guān)的Unigenes基因(2 438，18.15%)；此外，與代謝相關(guān)的Unigenes基因數(shù)量為2 931條，占總Unigenes數(shù)量的21.82%。

圖6 GO功能顯著性富集分析Fig.6 Enrichment analysis of GO function

圖7 COG功能分類圖Fig.7 COG function classification

2.4.3 KEGG pathways分析

根據(jù)KEGG數(shù)據(jù)庫注釋信息及對非冗余Unigenes的pathway進(jìn)行富集性分析，共識別出6 910條Unigenes，可歸為122個(gè)信號途徑。與植物葉片顏色及葉片生長直接相關(guān)的代謝途徑(注釋的Unigenes數(shù)量)分別有類黃酮代謝途徑(38條)、光合作用途徑(97條)、光合生物中的碳固定途徑(89條)、葉綠素代謝途徑(53條)、光合作用—天線蛋白合成途徑(43條)、花色苷代謝途徑(39條)及類胡蘿卜素的生物合成途徑(34條)等。

表1 杜仲轉(zhuǎn)錄組的KEGG代謝途徑分類圖(部分)

2.5 微衛(wèi)星特征分析

2.5.1 微衛(wèi)星的種類和數(shù)量分布

利用MISA軟件對杜仲轉(zhuǎn)錄組的54 517條Unigenes(總長度為43 989 941 bp)進(jìn)行SSR搜索，在54 517條Unigenes中共發(fā)現(xiàn)17 667個(gè)SSR位點(diǎn)(其中包含657個(gè)混合型的SSR和17 010個(gè)完整型SSR位點(diǎn))，其中包含2個(gè)及以上SSR位點(diǎn)的Unigenes共有3 121條。其發(fā)生頻率(即含SSR位點(diǎn)的Unigenes占總Unigenes的百分比)為23.64%，平均每2.5 kB就出現(xiàn)一個(gè)SSR位點(diǎn)，其出現(xiàn)頻率(即檢測出的SSR位點(diǎn)個(gè)數(shù)占總Unigenes的百分比)為32.41%。

完整型SSR位點(diǎn)共有17 010個(gè)，占總SSR位點(diǎn)的96.28%(圖8)。完整型SSR位點(diǎn)共包含67種重復(fù)基元，二核苷酸至六核苷酸分別有4、10、14、16、21種(表2)。其中，完整型SSR重復(fù)基元的重復(fù)次數(shù)均在4～27次，其中以重復(fù)10次(3 685個(gè))的最多，占總SSR的20.86%；其次為重復(fù)次數(shù)6、7、11、5和8次，其SSR位點(diǎn)個(gè)數(shù)分別為3 115、1 864、1 766、1 412和1 198。重復(fù)5～10次的SSR位點(diǎn)有12 144個(gè)，占總SSR的68.74%；重復(fù)11次以上的SSR位點(diǎn)有4 866個(gè)，占27.54%。

表2杜仲SSR中6種重復(fù)基元的類型及頻率

Table2SixtypesofSSRrepeatmotifsandtheirfrequencyinE.ulmoides

重復(fù)基元類型Repeatmotif重復(fù)次數(shù)Repeatnumber567891011>11總計(jì)Total頻率Frequency(%)A/T311116143022774745.54C/G6843711821.07AC/GT34518412281712938354.91AG/CT18271175908691369672503929.62AT/AT32321513895661218505CG/CG2194340.2AAC/GTT812810111210.71AAG/CTT42420897217324.3AAT/ATT83442531550.91ACC/GGT153844142821.66ACG/CGT561562790.46ACT/AGT3094430.25AGC/CTG1013315111510.89AGG/CCT1637941712911.71ATC/ATG100441841660.98CCG/CGG12233181731.02AAAC/GTTT82100.06AAAG/CTTT92110.06AAAT/ATTT214250.15AACC/GGTT220.01AAGG/CCTT1120.01AATC/ATTG2130.02AATG/ATTC110.01AATT/AATT110.01ACAT/ATGT92110.06ACCG/CGGT110.01ACTC/AGTG1120.01AGAT/ATCT741120.07AGCG/CGCT330.02AGGG/CCCT8190.05AAAAC/GTTTT110.01AAACC/GGTTT110.01AAAGG/CCTTT110.01AAAGT/ACTTT110.01AAATT/AATTT110.01AACCT/AGGTT110.01AAGAC/CTTGT110.01AAGAT/ATCTT110.01AAGTG/ACTTC110.01ACCCC/GGGGT110.01ACCCT/AGGGT110.01ACCTC/AGGTG110.01AGCAT/ATGCT110.01AGGAT/ATCCT110.01AGGCG/CCTCG110.01AGGGG/CCCCT110.01AAAAAC/GTTTTT110.01AAAACG/CGTTTT110.01AAAGTG/ACTTTC110.01AAATTG/AATTTC110.01AACAGC/CTGTTG110.01AACCCT/AGGGTT110.01AACTTC/AAGTTG110.01AAGCAC/CTTGTG110.01AAGGGC/CCCTTG110.01AAGTAG/ACTTCT110.01AAGTGG/ACTTCC110.01AATCAC/ATTGTG110.01ACACCG/CGGTGT110.01ACACGC/CGTGTG110.01ACCAGC/CTGGTG110.01ACCATC/ATGGTG110.01ACCTCC/AGGTGG110.01AGAGGC/CCTCTG110.01AGAGGG/CCCTCT110.01AGCATC/ATGCTG110.01AGGGCG/CCCTCG110.01總計(jì)Total141231151864119887036851766310017010100頻率Frequency(%)8.318.3110.967.045.1121.6610.3818.22100

圖8 杜仲完整型SSR種類和數(shù)量分布圖Fig.8 Types and numbers of complete SSR in E.ulmoides

2.5.2 微衛(wèi)星不同重復(fù)基序的頻率

杜仲葉片轉(zhuǎn)錄組中完整型SSR種類豐富(圖8)，單核苷酸到六核苷酸的重復(fù)類型都存在，但其出現(xiàn)頻率差異較大。其中以A/T類型為主的單核苷酸重復(fù)所占的比例最高(7 747個(gè)，45.54%)；其次是以AG/CT類型為主的二核苷酸重復(fù)(5 039個(gè)，29.62%)；再次是以AAG/CTT類型為主的三核苷酸重復(fù)(732個(gè)，4.3%)，四核苷酸重復(fù)類型為93個(gè)，以AAAT/ATTT類型為主；五和六核苷酸重復(fù)基元的類型較多，但數(shù)量都很少，出現(xiàn)頻率均較低。對檢測到的SSR位點(diǎn)分析顯示，出現(xiàn)頻率最高的5類基序依次為：A/T(4 597個(gè)，47.78%)、AG/CT(5 039個(gè)，29.62%)、AT/AT(850個(gè)，5.00%)、AC/GT(835個(gè)，4.91%)和AAG/CTT(732個(gè)，4.30%)(表2)。

杜仲2種單堿基微衛(wèi)星重復(fù)基元的統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示：A/T為主要的重復(fù)基元，共有7 747個(gè)，占45.54%，C/G僅占1.07%(圖9A)。二堿基重復(fù)基元有4種(AC/GT、AG/CT、AT/AT、CG/CG)，其中AG/CT的重復(fù)基元數(shù)量最多(5 039個(gè))，占總體的29.62%；其次是AT/AT(850個(gè))和AC/GT(835個(gè))，分別占5.00%和4.91%。最少的是CG/CG(34個(gè)，0.2%)(圖9(B))。三堿基重復(fù)類型共有10個(gè)，AAG/CTT的數(shù)量最多，共732個(gè)，占總體的4.30%；其次是AGG/CTT(291個(gè))和ACC/GGT(282個(gè))，分別占1.71%和1.66%；再次是CCG/CGG(173個(gè)，1.02%)、ATC/ATG(166個(gè)，0.98%)，其他重復(fù)類型則相對較少(表2)。在14種四堿基重復(fù)類型中，AAAT/ATTT的數(shù)量最多(25個(gè))，占總體的0.15%；其次是AGAT/ATCT(12個(gè)，0.07%)；再次是AAAG/CTTT、ACAT/ATGT，均占0.06%。五堿基和六堿基重復(fù)類型分別有16和21種，但每種類型均只有1個(gè)。

表3是杜仲葉片顏色形成相關(guān)基因的SSR重復(fù)基元信息，我們從所有的SSR重復(fù)信息中找出來與類黃酮代謝途徑有關(guān)的2條，與花色苷合成途徑有關(guān)的Unigenes 2條，與類胡蘿卜素合成的Unigenes 8條，并從中找到13個(gè)SSR位點(diǎn)。利用找出來的這13個(gè)位點(diǎn)可以為進(jìn)一步開發(fā)杜仲葉片紅色性狀的分子標(biāo)記做準(zhǔn)備。

表3 杜仲葉片顏色形成相關(guān)基因的SSR重復(fù)基元信息

圖9 單堿基和二堿基微衛(wèi)星的頻率Fig.9 Frequency of mononucleotide and dinucleotide repeat SSRs

3 討論

轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)(RNA-seq)是近期興起的一種新技術(shù)，其靈敏度高，且利用其研究轉(zhuǎn)錄組時(shí)對材料的遺傳背景要求低，較常規(guī)方法具有明顯的優(yōu)勢[18]。由于杜仲是單科單屬單種，關(guān)于杜仲轉(zhuǎn)錄組測序方面的研究報(bào)道較少。李鐵柱、趙德剛、馮延芝等分別構(gòu)建了杜仲葉片、果實(shí)、芽及樹皮等器官在不同發(fā)育時(shí)期的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫，并對杜仲轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中相關(guān)基因功能、代謝通路等進(jìn)行了初步研究[19～22]。相比前人的研究，本次轉(zhuǎn)錄組測序得到54 517條Unigenes。由于本研究僅選用‘華仲12號’品種不同時(shí)期及‘華仲11號’的葉片，而前人的研究均為多器官的混合樣品，所以得到的Unigenes數(shù)量雖少，但組裝Unigenes的N50為1 377 nt，平均長度806.90 nt，堿基Q20均在95%以上，組裝效果更好，后期的分析也更加可靠。

隨著轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)的成熟，通過其開發(fā)分子標(biāo)記及后期基因功能研究也成為一種主要的方式。黃海燕、吳敏等在轉(zhuǎn)錄組測序的基礎(chǔ)上進(jìn)行相關(guān)SSR分子標(biāo)記的開發(fā)，并對其遺傳多樣性、親緣關(guān)系、群體遺傳學(xué)、性別鑒定等方面開展了系統(tǒng)研究[11,23～24]。林開勤、申響寶及馮延芝等通過MISA軟件對杜仲轉(zhuǎn)錄組測序所得Unigenes進(jìn)行微衛(wèi)星特征分析，并開發(fā)系列引物，為杜仲不同種群間的遺傳結(jié)構(gòu)和遺傳多樣性分析研究提供了依據(jù)[22,25～26]。本研究共得到17 010個(gè)完整型SSR位點(diǎn)，占總SSR的96.28%，其出現(xiàn)頻率為32.41%，高于紅豆杉(2.24%)[27]，楠木(13.97%)[28]〗和刺梨(20.37%)[29]等，低于芙蓉李(54.51%)等[30]，其原因可能是基因庫中不同植物的數(shù)據(jù)有所差異或者計(jì)算的方法有很大不同。此外，本研究發(fā)現(xiàn)杜仲SSR序列重復(fù)基元類型存在比較嚴(yán)重的偏倚性，這與馮延芝在杜仲果實(shí)轉(zhuǎn)錄組SSR分子標(biāo)記研究中所得結(jié)論相同，原因可能是由于這些基元本身組成的SSR單位長度的限制。

葉片顏色是一個(gè)復(fù)合性狀，其最終由葉綠素、類胡蘿卜素及花色苷等植物色素的含量和比例所決定[31]。研究控制這些色素合成的關(guān)鍵基因及相關(guān)的SSR位點(diǎn)信息，可針對此開發(fā)相應(yīng)引物，開展紅葉性狀的分子標(biāo)記，不但可以進(jìn)行種質(zhì)資源的早期選擇，還可以結(jié)合紅葉性狀是形態(tài)標(biāo)記的特點(diǎn)，對開發(fā)的分子標(biāo)記進(jìn)行驗(yàn)證。本研究利用高通量測序技術(shù)建立了杜仲葉片紅葉性狀的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫，經(jīng)代謝通路分析和SSR位點(diǎn)分析，找與葉片顏色形成相關(guān)的12個(gè)基因和13個(gè)SSR，為下一步開發(fā)杜仲紅葉性狀SSR分子標(biāo)記提供參考，在分子基礎(chǔ)上鑒定杜仲葉片的呈色性狀上邁進(jìn)一步。

致謝感謝廣州基迪奧生物科技有限公司對文章的測序工作和生物信息分析工作的協(xié)助。

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State Key Laboratory of Forest Genetics and Breeding(Chinese Academy of Forestry)(TGB2015002);Special Fund for Basic Business Expenses of the Central Level Public Welfare Research Institutes of the Chinese Academy of forestry(CAFYBB2014QA037);The forest tree germplasm resources SURVEY of henan province

introduction：MIAO Zuo-Yun(1976—),female,Master,lecturer,mainly engaged in the breeding and cultivation ofEucommiaulmoides.

date:2017-04-02

AnalysisofRedLeafColorSSRMolecularMarkersbyTranscriptomeSequencingofEucommiaulmoides

MIAO Zuo-Yun1,2YANG Yun3LIU Pan-Feng1ZHENG Xin-Fang4DU Hong-Yan1ZHU Jing-Le1*

(1.Non-timber Forest Research and Development Center of Chinese Academy of Forestry,Zhengzhou 450003； 2.Huanghe Science and Technology College，Zhengzhou 450063； 3.Henan Agricultural University，Zhengzhou 450002； 4.South China Agricultural University，Guangzhou 510642)

The transcriptomes ofEucommiaulmoides‘Huazhong 12’ young and mature leaves and ‘Huazhong 11’ mature leaves were sequenced. The transcriptome data was assembled and classified by function, and microsatellites characteristics from obtained Unigenes and analyzed. The Unigenes were assembly generated a total of 54 517 Unigenes with an average length of 806.90 bp. Among them, 25 993 Unigenes accounted for 47.68% were annotated by comparing the assembled Unigenes with the Nr, Swiss-Prot, KEGG, and COG protein databases. KEGG pathway analysis presented that 6 910 annotated Unigenes divided into 122 classes according to its function. Among them, the Unigenes of ascorbate and aldarate metabolism was 39, flavonoid biosynthesis was 38, carotenoid biosynthesis was 34. There were 17 010 complete SSR located in 54 517 Unigenes accounted for 96.28% of the total SSR. The complete SSR included 67 frequent motifs, and the highest repeat of complete SSR type was A/T(7 747), following by AG/CT(5 039), AT/AT(850). There were 13 SSR located in ascorbate and aldarate metabolism, flavonoid biosynthesis and carotenoid biosynthesis. Our study would provide the molecular basis for genetic diversity analysis, genetic map construction and red leaf molecular marker development ofE.ulmoides.

Eucommiaulmoides;red leaf;microsatellites;transcriptome;high-throughput sequencing

林木遺傳育種國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(中國林業(yè)科學(xué)研究院)開放課題(TGB2015002)；中國林科院中央級公益性科研院所基本業(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)資金(CAFYBB2014QA037)；河南省林木種質(zhì)資源普查

苗作云(1976—)，女，碩士，講師，主要從事杜仲育種與栽培。

* 通信作者：E-mail:zhujingle1982@126.com

2017-04-02

* Corresponding author：E-mail:zhujingle1982@126.com

S727.3

A

10.7525/j.issn.1673-5102.2017.06.013