庫(kù)爾勒香梨PsLOX基因克隆及生物信息學(xué)分析

張 軍 劉旭新 徐立生 吐?tīng)栠d娜依 李 疆

(1.新疆農(nóng)業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院園林科技學(xué)院，昌吉 831100； 2.新疆喀什質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局，喀什 844000； 3.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)與園藝學(xué)院，烏魯木齊 830052)

庫(kù)爾勒香梨PsLOX基因克隆及生物信息學(xué)分析

張 軍1劉旭新1徐立生2吐?tīng)栠d娜依1李 疆3*

(1.新疆農(nóng)業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院園林科技學(xué)院，昌吉 831100；2.新疆喀什質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局，喀什 844000；3.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)與園藝學(xué)院，烏魯木齊 830052)

克隆了庫(kù)爾勒香梨(PyrussinkiangensisYü)脂氧合酶(lipoxygenase,LOX)基因PsLOX，了解其在香梨果實(shí)不同發(fā)育時(shí)期的表達(dá)差異，為香梨果實(shí)香氣代謝機(jī)理研究提供理論依據(jù)。以庫(kù)爾勒香梨嫩葉及不同時(shí)期果實(shí)表皮為試材，利用兩種不同的方法提取總RNA，通過(guò)RT-PCR技術(shù)得到目的基因PsLOX的cDNA序列，以生物信息學(xué)方法對(duì)其進(jìn)行分析和功能預(yù)測(cè)。運(yùn)用半定量RT-PCR(SqRT-PCR)技術(shù)，分析PsLOX基因在香梨嫩葉及果實(shí)生長(zhǎng)發(fā)育及貨架期的表達(dá)特性和差異。結(jié)果：試劑盒提取總RNA質(zhì)量較高，PsLOX基因CDS序列為912 bp，編碼303個(gè)氨基酸，屬于脂氧合酶家族基因，與其他植物L(fēng)OX基因編碼的氨基酸序列有較高的同源性，與南果梨相似性最高，達(dá)到99%；PsLOX基因在香梨果實(shí)中發(fā)育過(guò)程中表達(dá)差異明顯，即生長(zhǎng)發(fā)育前期表達(dá)量很低，成熟至完熟時(shí)期表達(dá)量最高，然后開(kāi)始減少。推測(cè)克隆獲得PsLOX基因在香梨果實(shí)香氣代謝過(guò)程中起到重要作用。

庫(kù)爾勒香梨；PsLOX基因；半定量RT-PCR；香氣

果實(shí)香氣是一類(lèi)由大量揮發(fā)性芳香物質(zhì)組成的復(fù)雜混合物，能夠反映出果實(shí)的風(fēng)味特點(diǎn)，是評(píng)價(jià)果實(shí)品質(zhì)的重要指標(biāo)[1～2]。庫(kù)爾勒香梨(PyrussinkiangensisYü. cv.‘Kuerle xiangli’)屬于新疆特有梨種，果實(shí)以獨(dú)特而濃郁的芳香氣味而著稱(chēng)[3]。栽培區(qū)域僅限新疆巴州和阿克蘇地區(qū)，正常年份總產(chǎn)量約7.0×105噸[4]，其規(guī)模效益和特色優(yōu)勢(shì)效益日益顯著。隨著產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，香梨品質(zhì)提升日益凸顯。果實(shí)香氣是構(gòu)成和影響果實(shí)品質(zhì)以及經(jīng)濟(jì)價(jià)值的重要因素之一[5]。怡人的果實(shí)香氣可以吸引消費(fèi)者并增強(qiáng)果品的市場(chǎng)競(jìng)爭(zhēng)力。目前，香梨由于栽培管理不當(dāng)、采摘期過(guò)早等原因致使其濃郁的香氣在貯藏、運(yùn)輸及銷(xiāo)售過(guò)程中喪失程度明顯，這一問(wèn)題降低了其商品價(jià)值和市場(chǎng)競(jìng)爭(zhēng)力。研究香梨果實(shí)發(fā)育成熟過(guò)程中香氣動(dòng)態(tài)變化和代謝機(jī)理，對(duì)確定庫(kù)爾勒香梨商品果的適貯采收時(shí)間和品質(zhì)評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，厘清果實(shí)香氣變化規(guī)律與調(diào)控的途徑，研究果實(shí)香氣調(diào)控應(yīng)用技術(shù)等具有重要的理論和實(shí)踐意義。

在蘋(píng)果、桃等果實(shí)中直鏈芳香物質(zhì)的生物合成物質(zhì)己經(jīng)被證實(shí)主要源于以亞油酸(linoleic acid,LA)和亞麻酸(linolenic acid，LeA)等為前體的脂氧合酶(lipoxygenase,LOX)途徑[6]。目前，普遍認(rèn)為脂氧合酶LOXs作為L(zhǎng)OX途徑的初始關(guān)鍵酶，通過(guò)斷裂多不飽和脂肪酸(PUFAs)來(lái)形成C6醛類(lèi)物質(zhì)，然后通過(guò)醇脫氫酶將醛類(lèi)物質(zhì)轉(zhuǎn)化成醇，繼而通過(guò)醇?；D(zhuǎn)移酶生成脂類(lèi)物質(zhì)[7]。研究表明，在成熟的蘋(píng)果、草莓、甜瓜、番茄等果實(shí)香氣中超過(guò)80%以上的成分都是脂類(lèi)物質(zhì)[8～9]。目前已在桃[10～12]、梨[13～15]中克隆得到了LOX基因并且進(jìn)行了序列分析和表達(dá)特性的研究，盡管已有學(xué)者開(kāi)始關(guān)注香梨的香氣，但主要集中在果實(shí)香氣成分等次生代謝產(chǎn)物分析方面[16～18]，在調(diào)控香梨果實(shí)香氣的分子機(jī)制，尤其是主效基因方面卻從未涉及。本研究以庫(kù)爾勒香梨為試材，通過(guò)RNA提取、RT-PCR等，獲得一個(gè)完整的LOX基因cDNA的CDS序列，通過(guò)生物信息學(xué)技術(shù)對(duì)該基因CDS進(jìn)行了序列和結(jié)構(gòu)分析。并利用半定量PCR方法分析香梨在不同時(shí)期特異LOX基因的表達(dá)情況，以期為香梨LOX基因鑒定、調(diào)控方式、功能分析等提供基礎(chǔ)信息，并為揭示庫(kù)爾勒香梨香氣代謝分子機(jī)制的提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

供試材料為庫(kù)爾勒市沙依東園藝場(chǎng)梨園健康植株(樹(shù)齡15年左右)，采集嫩葉、果實(shí)等組織后立即進(jìn)行液氮處理，運(yùn)至實(shí)驗(yàn)室放置-80℃冰箱超低溫保存?zhèn)溆谩Ｒ镂猩ど锕こ?上海)股份有限公司合成。

DEPC、Pfu DNA聚合酶、dNTPs、ddH2O、10×PCR buffer(含Mg2+)，日本Takara生物公司；RNAprep Pure植物總RNA提取試劑盒(DP441 TIANGEN)，感受態(tài)大腸桿菌DH5α菌株，零背景PLB-Vector載體等，北京天根生物科技公司；DNA Marker DL5000、Gelview、6×Loading Buffer，北京百泰克生物技術(shù)有限公司；AP-MN-P-250質(zhì)粒小量DNA提取試劑盒，北京科恩堡生物科技有限公司；K1622反轉(zhuǎn)錄試劑盒，賽默飛世爾科技(Thermo)公司；MEGA-bead?DNA凝膠回收試劑盒，美國(guó)Invitrogen公司；TRIzol試劑，美國(guó)Life Technologies公司；瓊脂糖，Biowest Agarose西班牙公司；其余試劑為國(guó)產(chǎn)分析純或化學(xué)純。

1.2 儀器與設(shè)備

5417R臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)，BioSpectrometer微量紫外可見(jiàn)光度計(jì)等德國(guó)Eppendorf有限公司；BioDoc-It凝膠成像系統(tǒng)，美國(guó)UVP公司；ABI2720型PCR擴(kuò)增儀，美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司；Cubis?MSA225P-100-DI天平德國(guó)賽多利斯公司等。

1.3 方法

1.3.1 庫(kù)爾勒香梨總RNA提取及cDNA的合成

試驗(yàn)按照TRIzol Reagent(Ambion)提供方法提取庫(kù)爾勒香梨嫩葉、嫩枝等總RNA，選擇植物總RNA提取試劑盒(DP441)提供的方法對(duì)比，用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)總RNA濃度，電泳檢測(cè)總RNA的完整性。提取較好的總RNA用K1622反轉(zhuǎn)錄試劑盒指導(dǎo)手冊(cè)進(jìn)行RT-PCR，反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA用于下列試驗(yàn)，其余放置-25℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2庫(kù)爾勒香梨PsLOX基因引物設(shè)計(jì)和PCR擴(kuò)增

根據(jù)NCBI(www.ncbi.nlm.nih.gov)的GenBank核酸庫(kù)根據(jù)已公布的砂梨LOX基因片段(Ge Bank Accession No.EF215448.1)，經(jīng)Blast比對(duì)后在脂氧合酶基因(LOX)mRNA序列同源性較高的區(qū)域，采用Primer Premier 6.0軟件設(shè)計(jì)引物，引物序列為F：5′ACGATGAATGCAAACGCAT3′，R：5′TTAGATGTTGATACTGGTGGGAACT3′。該引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

PCR總反應(yīng)體系為20 μL，其中DNA模板2 μL、引物2 μL、Pfu DNA聚合酶0.3 μL、dNTPs 2 μL、10×PCR buffer(含Mg2+)4 μL ddH2O 17.7 μL混勻后于96℃的條件下預(yù)變性5 min，96℃的條件下變性30 s，56℃條件下復(fù)性30 s，72℃的條件下延伸1 min，PCR反應(yīng)共設(shè)置30個(gè)循環(huán)，最后在72℃的條件下延伸7 min，反應(yīng)終止于14℃。

1.3.3 PCR產(chǎn)物回收、克隆及測(cè)序

PCR產(chǎn)物經(jīng)過(guò)1.0%的瓊脂糖電泳之后，檢測(cè)到一條在1 kB大小的條帶，用凝膠回收試劑盒純化回收，克隆至無(wú)背景PLB-Vector載體，42℃條件下90 s熱擊轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌DH5α后，在羧芐青霉素抗性篩選條件下，挑取單菌落經(jīng)PCR鑒定后于LB培養(yǎng)基中搖菌12 h培養(yǎng)，用試劑盒提取質(zhì)粒，送生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行測(cè)序。

1.3.4 目的片段的序列比對(duì)、分析

測(cè)序結(jié)果使用Mega 6.0進(jìn)行拼接對(duì)照，通過(guò)GENEDOC軟件對(duì)部分已經(jīng)公布的LOX開(kāi)放閱讀框進(jìn)行比較，與植物L(fēng)OX基因序列進(jìn)行Blast比對(duì)，檢測(cè)所克隆的片斷是否為L(zhǎng)OX基因序列，確認(rèn)測(cè)序結(jié)果的正確性。

1.3.5 庫(kù)爾勒香梨psLOX基因生物信息學(xué)分析

對(duì)擴(kuò)增得到的基因序列使用Lasergene 7.1的EditSeq軟件將PsLOX基因翻譯成氨基酸序列，并與NCBI的Nr數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行BLASTp分析，獲得相似度最高的序列，預(yù)測(cè)編碼蛋白質(zhì)；使用GENEDOC軟件對(duì)預(yù)測(cè)的氨基酸序列與相似度最高的5條序列進(jìn)行保守序列分析；使用MEGA 6.0軟件將預(yù)測(cè)的氨基酸序列與GenBank上的其他序列進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析，構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)；ExPASy在線服務(wù)器的ProtParam(http://web.expasy.org/protparam/)預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)的基本理化性質(zhì)；PSORT服務(wù)器http://wolfpsort.org/)預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)的亞細(xì)胞定位；SOPMA軟件http://npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page]=/NPSA/npsa_sopma.html)進(jìn)行蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)分析；使用SWISS-MODEL(http://swissmodel.expasy.org/)進(jìn)行三維結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)。

1.3.6半定量RT-PCR檢測(cè)庫(kù)爾勒香梨psLOX基因表達(dá)

對(duì)香梨嫩葉(4月中旬)、不同時(shí)期果實(shí)的果皮(5月15日、6月16日、7月18日、8月20日，9月16日、10月17日、11月21日)進(jìn)行RNA提取以及cDNA第一鏈反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA用內(nèi)標(biāo)基因Actin-7進(jìn)行擴(kuò)增驗(yàn)證，內(nèi)標(biāo)引物序列為Actin-7F：5′TGGTGTCATGGTTGGTATGG3′，Actin-7R：5′CAGGAGCAACACGAAGTTCA3′。擴(kuò)增表達(dá)引物分別為F：5′CTATCTCGGACAGCGTGACA3′，R：5′TACTGGTGGGAACTCCCTTG3′。

半定量RT-PCR之前，使用紫外檢測(cè)儀檢測(cè)RNA濃度，將其調(diào)成一致?？偡磻?yīng)體系為20 μL，其中cDNA模板2 μL、引物2 μL、DNA聚合酶0.3 μL、dNTPs 2 μL、10×PCR buffer(含Mg2+)4 μL ddH2O 17.7 μL混勻后于96℃的條件下預(yù)變性5 min，96℃的條件下變性30 s，56℃條件下復(fù)性30 s，72℃的條件下延伸0.5 min，PCR反應(yīng)共設(shè)置30個(gè)循環(huán)，最后在72℃的條件下延伸7 min，反應(yīng)終止于14℃。產(chǎn)物取5 μL與緩沖液經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，Gelview染色，紫外觀察照相。

2 結(jié)果與分析

2.1 試劑盒法提取庫(kù)爾勒香梨總RNA質(zhì)量較好

傳統(tǒng)TRIzol法獲得香梨組織總RNA溶液呈棕褐色并有粘稠狀不溶物存在，試劑盒法獲得的RNA溶液呈現(xiàn)乳白色。用兩種方法提取香梨組織的總RNA，其BioSpectrometer紫外檢測(cè)濃度和純度結(jié)果差異較大：用傳統(tǒng)TRIzol法提取香梨幼嫩組織的總RNA的到濃度185.1 μg·mL-1，純度A260/A280為1.04，用RNAprep Pure試劑盒提取得在總RNA濃度為1 245 μg·mL-1，純度A260/A280為1.96，A260/A230值為2.213，說(shuō)明RNA純度較高，質(zhì)量較好，可滿(mǎn)足后續(xù)工作的需要(圖1)。

圖1 紫外檢測(cè)總RNA質(zhì)量A.試劑盒法；B.傳統(tǒng)TRIzol法Fig.1 Total RNA quality by UV detectionA. Kit method; B. Traditional TRIzol method

由于果樹(shù)幼嫩組織中富含多糖、多酚[19]，由圖1可見(jiàn)，傳統(tǒng)TRIzol法不適合該種類(lèi)型。造成RNA提取質(zhì)量較差的原因是果樹(shù)幼嫩組織中的多糖理化性質(zhì)與RNA相似，用乙醇或異丙醇沉淀RNA時(shí)，往往產(chǎn)生多糖的凝膠狀沉淀，這種沉淀難溶于水[20]，造成包裹部分RNA使其很難分離，多酚化合物與RNA形成不溶性復(fù)合物，造成提取總RNA的丟失[21]。A260/A280是核酸純度的指示值，一般RNA樣品的A260/A280的比值應(yīng)為1.8～2.0。當(dāng)A260/A280小于1.8時(shí)，表明有蛋白質(zhì)、酚類(lèi)等污染；當(dāng)A260/A230值小于2.0時(shí)表明樣品被糖類(lèi)、鹽類(lèi)或者有機(jī)溶劑污染，RNA質(zhì)量較差[22]。傳統(tǒng)TRIzol法獲得香梨組織總RNA溶液A260/A230值為0.465，小于2.0說(shuō)明RNA被污染。

瓊脂糖凝膠電泳檢驗(yàn)總RNA完整性圖譜由圖2顯示，試劑盒法提取的總RNA質(zhì)量較好，呈現(xiàn)典型的28S、18S、5S三種帶型，其條帶清晰明亮、穩(wěn)定，并且沒(méi)有降解，基本可以滿(mǎn)足實(shí)驗(yàn)的要求。而傳統(tǒng)TRIzol法提取的總RNA沒(méi)有任何條帶顯示，只是在5S條帶下有模糊的核苷二聚體。

2.2 庫(kù)爾勒香梨PsLOX基因的獲得與序列分析

采用特異引物PCR擴(kuò)增獲得了與預(yù)期大小相符的特異條帶，約為1 000 bp(圖3A)。將PCR產(chǎn)物過(guò)大孔瓊脂糖電泳，然后切膠用試劑盒處理得到濃度相對(duì)較高的目的基因(圖3B)。將目的基因連接導(dǎo)入PLB-Vector載體，將轉(zhuǎn)化的DH5α大腸桿菌平皿培養(yǎng)后，選擇平板培養(yǎng)基上的24個(gè)單克隆菌落，利用特異引物對(duì)菌落進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

結(jié)果表明，菌落單克隆2和8中的目標(biāo)片段已經(jīng)插入(圖3C)，將2和8單克隆菌落用液態(tài)LB培養(yǎng)過(guò)夜，提取重組質(zhì)粒PCR鑒定電泳結(jié)果(圖3D)。

質(zhì)粒提取的結(jié)果符合預(yù)期，測(cè)序結(jié)果顯示PsLOX基因區(qū)域全長(zhǎng)1 256 bp，測(cè)序如圖4。

測(cè)序結(jié)果使用primer premier 6.0進(jìn)行拼接對(duì)照，結(jié)果顯示該基因有912 bp的開(kāi)放閱讀框ORF(CDS)，編碼303個(gè)氨基酸，該基因開(kāi)放閱讀框序列如下圖5所示。DNAman9.0預(yù)測(cè)結(jié)果為，分子重量34.446 8 kDa，等電點(diǎn)PI為4.83。

圖2 電泳檢測(cè)總RNA質(zhì)量A.試劑盒法；B.傳統(tǒng)TRIzol法Fig.2 Gel electrophoresis of Total RNAA. Kit method; B. Traditional TRIzol method

圖3 庫(kù)爾勒香梨PsLOX基因電泳 M. DNA Marker DL5000；2,8. 目標(biāo)片段已經(jīng)插入的單克隆菌落Fig.3 Electrophoresis to PsLOX gene of Korla pear M. DNA Marker DL5000；2, 8. Target fragments inserted into the monoclonal colonies

2.3 庫(kù)爾勒香梨PsLOX基因氨基酸序列相似性與同源性分析

通過(guò)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)BlasntX比對(duì)，該基因核苷酸與砂梨LOX基因的相似性為99%，且在LOX基因的CDS區(qū)段，有5個(gè)單核苷酸多態(tài)性(Single Nucleotide Polymorphisms SNP)位點(diǎn)，這為以后利用分子手段鑒定庫(kù)爾勒香梨的提供重要依據(jù)。與南果梨、蘋(píng)果、桃等LOX基因有較高的一致性，同源性80%～98%，因此認(rèn)定該基因?yàn)閹?kù)爾勒香梨特有LOX基因，命名為PsLOX基因。PsLOX基因核苷酸CDS序列對(duì)應(yīng)氨基酸與其他植物L(fēng)OX基因?qū)?yīng)的氨基酸序列同源比對(duì)(圖6)。

圖4 庫(kù)爾勒香梨PsLOX基因測(cè)序Fig.4 Sequencing to Korla pear PsLOX gene

圖5 庫(kù)爾勒香梨PsLOX基因CDS序列Fig.5 CDS sequence of Korla pear PsLOX gene

圖6 庫(kù)爾勒香梨PyLOX氨基酸序列與其它植物L(fēng)OX氨基酸序列同源比對(duì) 庫(kù)爾勒香梨PyLOX；梨XP009376684，XP018507432.1，XP009376681.1[Pyrus×bretschneideri]；南果梨AJD18612.1[Pyrus ussuriensis]；蘋(píng)果AGI16416.1，GI16415.1，AGI16414.1，AGI16413.1[Malus domestica]；杏ABZ05753.1[Prunus armeniaca]；桃EMJ09301.1，ABV32552.1，ACH91370.1，[Prunus persica]；扁桃CAB94852.1[Prunus dulcis]；草莓CAE17327.1[Fragaria×ananassa]；酸梅XP008246451.1，XP008245950.1[Prunus mume]；獼猴桃ABF60001.1[Actinidia deliciosa]；葡萄AGU28274.1[Vitis vinifera]Fig.6 homologous sequences comparison of Korla pear PsLOX amino acid and other plant’s Korla pear PyLOX ;pear XP009376684，XP018507432.1，XP009376681.1[Pyrus×bretschneideri];Nanguo Pear AJD18612.1[Pyrus ussuriensis];Apple AGI16416.1，GI16415.1，AGI16414.1，AGI16413.1[Malus domestica];Apricot ABZ05753.1[Prunus armeniaca];Peach EMJ09301.1，ABV32552.1，ACH91370.1，[Prunus persica];Almond CAB94852.1[Prunus dulcis];Strawberry CAE17327.1[Fragaria×ananassa];Dark plum XP008246451.1，XP008245950.1[Prunus mume];Kiwifruit ABF60001.1[Actinidia deliciosa];Grape AGU28274.1[Vitis vinifera]

利用MEGA6.0軟件的最大似然法，將PyLOX基因氨基酸序列與GenBank上登錄的不同物種的LOX酶氨基酸序列進(jìn)行分子進(jìn)化樹(shù)分析，結(jié)果(圖7)表明，庫(kù)爾勒香梨PyLOX基因氨基酸序列與沙梨、南果梨親緣關(guān)系相對(duì)最近，聚為一類(lèi)，與蘋(píng)果親緣關(guān)系bootstrap值能到達(dá)100，單獨(dú)聚為一簇。由此推測(cè)，PyLOX在表達(dá)、功能等方面與砂梨、南國(guó)梨等LOX家族成員類(lèi)似。

2.4 庫(kù)爾勒香梨PsLOX蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能預(yù)測(cè)

通過(guò)ExPASy平臺(tái)http://web.expasy.org/protparam/對(duì)PsLOX基因編碼蛋白質(zhì)進(jìn)行理化性質(zhì)分析，蛋白質(zhì)分子式C1545H2366N406O469S10，氨基酸構(gòu)成及其含量見(jiàn)下表1。

圖7 庫(kù)爾勒香梨PyLOX氨基酸序列與其它植物L(fēng)OX氨基酸序列系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)Fig.7 Phylogenetic trees on LOX amino acids of Korla pear PsLOX and other plant’s

表1 PsLOX蛋白質(zhì)氨基酸構(gòu)成

該蛋白質(zhì)總負(fù)電荷殘基數(shù)(D+E)為45，總正電荷殘基數(shù)(R+K)為33，PI為4.83，因此，為PsLOX基因編碼蛋白質(zhì)酸性蛋白質(zhì)。估計(jì)半衰期在體外哺乳動(dòng)物網(wǎng)織紅細(xì)胞為30 h，在酵母體內(nèi)大于20 h，在大腸桿菌體內(nèi)大于10 h。不穩(wěn)定系數(shù)為52.14，為不穩(wěn)定蛋白。

氨基酸序列決定了蛋白質(zhì)的立體結(jié)構(gòu)，即肽鏈的折疊方式，因此研究肽鏈的構(gòu)象有利于探索蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)和功能。利用C.Geourjon，G.Deléage已經(jīng)發(fā)表的蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)方法SOPMA[23]，在線(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/secpred_sopm.pl)對(duì)PsLOX編碼的蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，結(jié)果如下圖，該二級(jí)結(jié)構(gòu)主要由4種形式組成，其中α-螺旋(Alpha-helix)占38.61%，無(wú)規(guī)則卷曲(Random coil)占37.62%，延伸鏈(Extended strand)占11.88%，β-轉(zhuǎn)角(β-turn)占11.88%，α-螺旋和延伸鏈分別分布于蛋白的N端和C端各一個(gè)，N末端以α-螺旋的形式存在，C-末端以延伸鏈形式存在(圖8)。

疏水/親水平衡特征是維持蛋白質(zhì)立體結(jié)構(gòu)的重要因素，影響著蛋白質(zhì)的諸多功能。因此，參照Kyte J.,Doolittle R.F.方法[24]，利用ProtScale在線http://web.expasy.org/cgi-bin/protscale/protscale.pl對(duì)PsLOX進(jìn)行了親水性/疏水性分析，如圖3所示，橫坐標(biāo)表示氨基酸殘基的序號(hào)，縱坐標(biāo)表示殘基的疏水、親水特性，正直為疏水，負(fù)值為親水。發(fā)現(xiàn)PsLOX編碼的氨基酸序列中，具有多個(gè)明顯的親水區(qū)域，其中269位親水值為最大，達(dá)到3，而214，215位疏水性達(dá)到最大，均為1.711。大部分屬于親水性氨基酸，占整個(gè)比例的71.28%。因此，PsLOX基因翻譯產(chǎn)物屬于親水性蛋白。

圖8 庫(kù)爾勒香梨PsLOX編碼蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè) MNA等是氨基酸縮寫(xiě)；h.螺旋；e.延伸鏈；t.轉(zhuǎn)角；c.卷曲Fig.8 The predicated secondary structure of Korla pear PyLOX encoding protein MNA etc. is the abbreviation for amino acids; hetc. Helix; e. Extended strand; t. Turn; c. Coil

圖9 PsLOX氨基酸親水性/疏水性分析Fig.9 Distributing in hydropathy of the PsLOX amino acid

圖10 PsLOX蛋白信號(hào)肽預(yù)測(cè)圖Fig.10 Prediction to signal peptide of PsLOX protein

利用SignalP 4.1 Server軟件，Petersen TN.等的方法[25]在線對(duì)PsLOX的蛋白質(zhì)信號(hào)肽進(jìn)行預(yù)測(cè)(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP)，選擇神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)法NN和隱馬可夫模型HMM兩種方式聯(lián)合，可預(yù)測(cè)是否含有信號(hào)肽以及信號(hào)肽位點(diǎn)。信號(hào)肽辨別率D-score是S-mean和Y-max的平均值，是區(qū)分是否含有信號(hào)肽的重要指標(biāo)。由圖所示，D-score為0.109，小于臨界值0.45，所以沒(méi)有信號(hào)肽存在(圖10)。

通過(guò)TMHMM Server2.0在線軟件http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM分析(圖11)，曲線的縱坐標(biāo)是概率，橫坐標(biāo)是序列，一共203個(gè)氨基酸,紅色表示跨膜區(qū),幾乎都在5%概率下，藍(lán)色在膜內(nèi)部，概率極低，相反紫色細(xì)線表示在膜外的概率，幾乎100%。在線給出結(jié)論是：1到203氨基酸全部位于膜外，該蛋白質(zhì)無(wú)跨膜區(qū)域，說(shuō)明它可能位于胞質(zhì)或核(胞漿)中。又通過(guò)http://www.csbio.sjtu.edu.cn/cgi-bin/PlantPLoc.cgi在線軟件亞細(xì)胞定位[26]，結(jié)果顯示該蛋白在細(xì)胞質(zhì)中(Cytoplasm)。

利用https://swissmodel.expasy.org/interactive/z6yrUY/models/同源建模得出PsLOX基因編碼蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖12。

圖11 PyLOX蛋白的跨膜區(qū)分析Fig.11 Transmembrane analysis of PyLOX protein

圖12 PyLOX蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)Fig.12 The model of tertiary structure by PyLOX protein

2.5 庫(kù)爾勒香梨PsLOX基因表達(dá)

以庫(kù)爾勒香梨嫩葉、花后30天的果實(shí)8個(gè)時(shí)期的cDNA為模板，利用Actin-7基因?yàn)榈囊镞M(jìn)行半定量RT-PCR檢測(cè)，瓊脂糖電泳均能檢測(cè)到符合預(yù)期大小的Actin-7基因片段，亮度基本一致，條帶清晰，無(wú)非特異性擴(kuò)增帶出現(xiàn)(圖13)。說(shuō)明RT-PCR得到的模板cDNA濃度基本一致。從圖13中可以看出，香梨PsLOX基因在庫(kù)爾勒香梨成熟期(條帶5～7)表現(xiàn)為的表達(dá)量大于成長(zhǎng)期(條帶2～4)，而當(dāng)香梨摘后常溫貯藏至第二個(gè)月(條帶8)，psLOX表達(dá)明顯減弱，條帶變得模糊，由于PsLOX基因是脂類(lèi)等次生代謝物的一個(gè)主要調(diào)控基因，故可初步得出：香梨PsLOX基因可能在成熟期時(shí)香梨香氣合成代謝起到非常重要的作用。

圖13 PsLOX基因在不同時(shí)期的半定量RT-PCR表達(dá) 條帶上方為試驗(yàn)材料序號(hào)：1.香梨果樹(shù)嫩葉(4月中旬)；2～8.香梨果實(shí)不同時(shí)期的果實(shí)(5月15日，6月16日，7月18日，8月20日，9月16日，10月17日，11月21日)Fig.13 Expression on semi-quantitative RT-PCR of PsLOX gene in different periods The test data number is above the strip: 1. Above as experimental materials for pear fruit leaves(mid April); 2-8. Fruit of Korla pear in different periods(May 15th,June 16th,July 18th,August 20th,September 16th,October 17th,November 21st)

3 討論

提取得到純度高、完整性好總RNA是進(jìn)行RT-PCR分析和構(gòu)建cDNA的決定性因素。目前，提取植物總RNA經(jīng)典的方法有報(bào)道的多見(jiàn)于CTAB法、SDS-苯酚法、異硫氫酸胍法等，TRIzol法由于具有步驟簡(jiǎn)單、配制試劑少等優(yōu)點(diǎn)[27]使用日益廣泛，本文證明TRIzol法不適合提取庫(kù)爾勒香梨材料總RNA，這與王其海[28]、尹珍珍[29]等對(duì)果樹(shù)組織提取總RNA結(jié)論結(jié)果一致。

脂氧合酶(lipoxygenase,LOX)不但參與果實(shí)發(fā)育成熟，也是果實(shí)香氣合成過(guò)程中關(guān)鍵酶，是果實(shí)香氣(脂香型)代謝第一步，決定著果實(shí)香型和香氣的質(zhì)量。研究表明在草莓[30]、葡萄[31]、蘋(píng)果[32]、桃[12]上都有LOX基因家族成員的報(bào)道，然而在中國(guó)特色水果庫(kù)爾勒香梨果實(shí)上LOX基因卻鮮有報(bào)道，只有李萌(音譯)等[15]一篇關(guān)于白梨LOX基因家族與其他5種薔薇科基因家族的對(duì)比，至于在龐大的LOX基因家族中哪個(gè)是和香氣有直接關(guān)系的即主效基因未見(jiàn)報(bào)道。所以鑒于前人的研究成果，利用生物信息學(xué)對(duì)PyLOX對(duì)應(yīng)的編碼蛋白進(jìn)行序列分析，與蘋(píng)果、梨、桃等多個(gè)物種的LOX轉(zhuǎn)錄因子的保守結(jié)構(gòu)域相似性較高，與已知功能的LOX轉(zhuǎn)錄因子聚在同類(lèi)，據(jù)此推測(cè)它與該類(lèi)基因可能具有相似的功能，即和果實(shí)香氣代謝有關(guān)。

單核苷酸多態(tài)性(SNP)作為一種能夠提供豐富信息的具有高穩(wěn)定性的分子標(biāo)記，已開(kāi)始被應(yīng)用于農(nóng)作物育種領(lǐng)域研究[33]。通過(guò)PyLOX基因的同源性分析發(fā)現(xiàn)，在該基因的CDS區(qū)段，有5個(gè)SNP位點(diǎn)，這為以后利用分子手段鑒定庫(kù)爾勒香梨的種資資源、性狀關(guān)聯(lián)等提供重要依據(jù)。

利用半定量RT-PCR技術(shù)分析基因的表達(dá)量，進(jìn)而推斷基因在不同生育時(shí)期的作用，已在很多研究上應(yīng)用。由于不同組織或細(xì)胞等來(lái)源的目的基因表達(dá)量不同，在同一個(gè)PCR體系條件下擴(kuò)增得到的產(chǎn)物(目的基因和管家基因)不同，而管家基因的表達(dá)則相同[33]。本試驗(yàn)采用Actin-7作為內(nèi)參基因，研究香梨香氣次生代謝物合成關(guān)鍵酶LOX基因，結(jié)果證明確實(shí)可行。同時(shí)，條帶對(duì)比說(shuō)明，LOX基因作為脂類(lèi)次生代謝物的調(diào)控基因與庫(kù)爾勒香梨香氣代謝關(guān)系緊密。

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Xinjiang Uygur Autonomous Region Natural Science Foundation(2016D01A053)

introduction：ZHANG Jun(1978—),Male,associate professor,Ph.D.Candidate,research on germplasm resources of fruit trees.

date:2017-05-08

CloningandBioinformaticsAnalysisofPsLOXGeneinPyrussinkiangensisYü. ‘Korlaxiangli’

ZHANG Jun1LIU Xu-Xin1XU Li-Sheng2Tuerxunayi1LI Jiang3*

(1.Garden Science & Technology College,Xinjiang Agricultural Vocational Technical College,Changji 831100； 2.Xinjiang Kashgar Supervisory Bureau for Quality and Technology,Kashgar 844000； 3.College of Forestry and Horticulture,Xinjiang Agricultural University,Urumqi 830088)

In order to provide a rationale and study for the aroma metabolism mechanism of pear fruit, which wasPsLOX, the lipoxygenase gene of Korla pear(PyrussinkiangensisYü. ‘Korla xiangli’) was cloned, the expression profiles ofPsLOXwere monitored in different periods of fruit development. As materials in leaves and fruit of Korla pear at different periods, total RNA was extracted by using the reagent kit, cDNA sequence of target genePsLOXwas obtained by RT-PCR. The function ofPsLOXwas predicted by bioinformatics, the expression characteristics and differences of this gene were analyzed using semi quantitative RT-PCR(SqRT-PCR) technology with leaves and peel of Korla pear in period of growth and shelf-life. The CDS sequence ofPsLOXgene was 912 bp length, coded a predicted protein of 303 amino acids. By bioinformatics,PsLOXgene belongs to the lipoxygenase family. We compared with other plant LOX genes, the amino acid sequence had high homology, and the highest homology with Nanguo pear reached 99%. There was significant difference in the expression ofPsLOXgene in development period of pear fruit, which was very low level in the expression quantity at growth development prophase of young fruit, and was the highest value in mature to ripe period, then expression quantity began to decrease. ThePsLOXgene was homologously cloned, which were speculated to play a crucial role in aroma metabolism process of Korla pear fruit.

PyrussinkiangensisYü. ‘Korla xiangli’;PsLOXgene;semi quantitative RT-PCR;aroma

新疆維吾爾自治區(qū)自然科學(xué)基金項(xiàng)目(2016D01A053)

張軍(1978—)，男，副教授，博士研究生，主要從事果樹(shù)種質(zhì)資源方面的研究。

* 通信作者：E-mail:lijiangxj@163.com

2017-05-08

* Corresponding author：E-mail:lijiangxj@163.com

S661.2

A

10.7525/j.issn.1673-5102.2017.06.011