• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    miRNA-101-3p靶向調(diào)控EZH2蛋白抑制胃癌細(xì)胞增殖和遷移*

    2017-12-22 09:09:25張笑添張曉延黃賽亞
    中國(guó)病理生理雜志 2017年12期
    關(guān)鍵詞:結(jié)果顯示細(xì)胞周期空白對(duì)照

    張笑添, 張曉延, 黃賽亞, 王 倩, 劉 威

    (1山西醫(yī)科大學(xué)汾陽(yáng)學(xué)院醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)系, 山西 汾陽(yáng) 032200; 2山西醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)影像學(xué)系, 山西 太原 030001)

    miRNA-101-3p靶向調(diào)控EZH2蛋白抑制胃癌細(xì)胞增殖和遷移*

    張笑添1△, 張曉延1, 黃賽亞1, 王 倩2, 劉 威1

    (1山西醫(yī)科大學(xué)汾陽(yáng)學(xué)院醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)系, 山西 汾陽(yáng) 032200;2山西醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)影像學(xué)系, 山西 太原 030001)

    目的研究微小RNA-101-3p (miRNA-101-3p) 對(duì)人胃癌細(xì)胞增殖、凋亡和遷移的影響及其可能的調(diào)控機(jī)制。方法Real-time PCR檢測(cè)2種人胃癌細(xì)胞和1種胃黏膜細(xì)胞中miRNA-101-3p和zeste增強(qiáng)子同源物2 (EZH2) 的表達(dá)水平;采用脂質(zhì)體瞬時(shí)轉(zhuǎn)染技術(shù)過(guò)表達(dá)miRNA-101-3p;流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)miRNA-101-3p對(duì)胃癌細(xì)胞周期和凋亡的影響;Transwell實(shí)驗(yàn)、CCK-8法和臺(tái)盼藍(lán)染色法檢測(cè)miRNA-101-3p對(duì)胃癌細(xì)胞遷移和增殖能力的影響;Western blot法檢測(cè)EZH2的表達(dá)。結(jié)果miRNA-101-3p在胃癌細(xì)胞的表達(dá)水平顯著低于胃黏膜細(xì)胞(P<0.05);過(guò)表達(dá)miRNA-101-3p后,流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示胃癌細(xì)胞的S期比例減少,G0/G1期比例增加,早期凋亡率增加(P<0.05);CCK-8法、臺(tái)盼藍(lán)染色法及Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示胃癌細(xì)胞的增殖和遷移能力顯著降低(P<0.05);Western blot結(jié)果顯示胃癌細(xì)胞中EZH2蛋白的表達(dá)明顯下降(P<0.05)。結(jié)論miRNA-101-3p可能通過(guò)靶向負(fù)調(diào)控EZH2蛋白的表達(dá)抑制胃癌細(xì)胞的增殖和遷移,進(jìn)而促進(jìn)胃癌細(xì)胞凋亡。

    胃癌; 微小RNA; 細(xì)胞增殖; 細(xì)胞遷移; 細(xì)胞凋亡; Zeste增強(qiáng)子同源物2

    胃癌是最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一,是腫瘤死亡的第2常見(jiàn)的原因,其生存期和預(yù)后較差[1-2]。微小RNA (microRNA, miRNA) 作為一種高度保守的小分子內(nèi)源性的非編碼RNA,可以靶向結(jié)合mRNA 3’-UTR進(jìn)而調(diào)控靶基因的表達(dá)。已有研究發(fā)現(xiàn),miRNA-101-3p在結(jié)腸癌[3]、膀胱移行細(xì)胞癌[4]、肝癌[5]和乳腺癌[6]等發(fā)揮著抑癌的作用。近期研究發(fā)現(xiàn),miRNA-101-3p在胃癌中表達(dá)下降[7],但是其對(duì)胃癌細(xì)胞周期及凋亡的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。

    Zeste增強(qiáng)子同源物2(enhancer of zeste homolog 2,EZH2)是多梳家族(Polycomb group,PcG)的重要成員之一,在胚胎發(fā)育、細(xì)胞增殖和細(xì)胞周期調(diào)控中起著重要的作用。有研究發(fā)現(xiàn),EZH2與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展、轉(zhuǎn)移和侵襲都密切相關(guān)[8-9]。基于此,本研究將探討EZH2在胃癌中與miRNA-101-3p的相關(guān)性,以及miRNA-101-3p對(duì)胃癌細(xì)胞增殖、遷移以及凋亡的影響。

    材 料 和 方 法

    1 主要試劑

    miRNA反轉(zhuǎn)錄以及熒光定量試劑盒購(gòu)于北京天根生化有限公司;miRNA-101-3p mimics以及miRNA陰性對(duì)照(negative control, NC)購(gòu)于廣州銳博生物有限公司;Lipofectamine 2000購(gòu)自Invitrogen;抗EZH2單克隆抗體購(gòu)于Abcam;抗GAPDH多克隆抗體購(gòu)于Bioworld;Transwell小室購(gòu)自康寧公司;CCK-8以及細(xì)胞周期試劑盒購(gòu)自碧云天生物有限公司;Annexin V-FITC/PI凋亡試劑盒購(gòu)于聯(lián)科生物有限公司;RIPA裂解液以及BCA定量試劑盒購(gòu)自武漢博士德生物有限公司。

    2 主要方法

    2.1細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染 胃癌細(xì)胞MGC-803和HGC-27的培養(yǎng)條件分別是RPMI-1640加10%胎牛血清(fetal bovine serum,F(xiàn)BS)和DMEM加10% FBS,胃黏膜細(xì)胞GES-1的培養(yǎng)條件是DMEM加10% FBS,于37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng),0.25%胰蛋白酶消化傳代。轉(zhuǎn)染前1 d取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的細(xì)胞接種于6孔板中,每孔細(xì)胞數(shù)大約為3×105,次日細(xì)胞密度達(dá)到60%時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn),使用Lipofectamine 2000將miRNA-101-3p mimics或miRNA mimics NC轉(zhuǎn)入胃癌細(xì)胞MGC-803中,相應(yīng)分為miRNA-101-3p mimics組、miRNA NC組及空白(blank)組,轉(zhuǎn)染8 h后,將無(wú)血清培養(yǎng)基更換為含10% FBS培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng),24 h后用流式細(xì)胞術(shù)觀察轉(zhuǎn)染效率,48 h后用熒光定量PCR檢測(cè)各組胃癌細(xì)胞中miRNA-101-3p和EZH2的表達(dá)水平。

    2.2Real-time PCR 胰酶消化各組細(xì)胞后使用TRIzol試劑提取細(xì)胞中的RNA。應(yīng)用miRNA熒光定量PCR試劑盒檢測(cè)miRNA-101-3p的表達(dá),以U6為內(nèi)參照。擴(kuò)增條件是: 94 ℃ 2 min; 94 ℃ 20 s, 60 ℃ 34 s, 40個(gè)循環(huán)。使用SYBR Premix Ex Taq試劑盒檢測(cè)EZH2的表達(dá),以GAPDH為內(nèi)參照。EZH2上游引物序列為5’-AAAGAAAGCCGCCCACCT-3’,下游引物序列為5’-GGTCCATCTATGTTGGGGGTA-3’; GAPDH的上游引物序列為5’-GGATTTGGTGTCGTATTGGGC-3’,下游引物序列為5’-CGCTCCTGGAAGATGGTGAT-3’。擴(kuò)增條件是: 95 ℃ 3 min; 95 ℃ 30 s, 56 ℃ 30 s, 72 ℃ 30 s, 40個(gè)循環(huán)。擴(kuò)增結(jié)束后均進(jìn)行熔解曲線分析,miRNA-101-3p和EZH2的相對(duì)表達(dá)水平采用2-ΔΔCt法計(jì)算。

    2.3CCK-8比色法和臺(tái)盼藍(lán)染色法檢測(cè)細(xì)胞增殖 將轉(zhuǎn)染了miRNA-101-3p mimics或miRNA NC的胃癌細(xì)胞經(jīng)胰酶消化后重新接種于96孔板中,每孔中的細(xì)胞約為3×105個(gè),于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24、48和72 h后,加入CCK-8試劑10 μL,混勻后繼續(xù)置于培養(yǎng)箱中1 h,使用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀測(cè)定450 nm處的吸光度(A)值,繪制生長(zhǎng)曲線,每組設(shè)定3個(gè)復(fù)孔。采用臺(tái)盼藍(lán)染色進(jìn)行活細(xì)胞計(jì)數(shù)時(shí),轉(zhuǎn)染前一天將細(xì)胞按3×108/L接種于6孔板中,轉(zhuǎn)染48 h后收集細(xì)胞,使用臺(tái)盼藍(lán)染色后直接計(jì)數(shù)活細(xì)胞。

    2.4流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期和凋亡 轉(zhuǎn)染48 h后,收集miRNA-101-3p mimics、miRNA NC及空白對(duì)照組的細(xì)胞,細(xì)胞數(shù)大約為1×106個(gè),使用預(yù)冷的PBS清洗2次,用70%的乙醇固定后置于4 ℃冰箱中過(guò)夜,再用預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞2次,每管分別加入PI染色液(20×)和RNase A(50×),于37 ℃避光溫浴0.5 h后,使用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期。

    轉(zhuǎn)染48 h后使用不含EDTA的胰酶消化各組細(xì)胞,用上清培養(yǎng)液終止消化,1 000 r/min離心5 min收集細(xì)胞,PBS清洗細(xì)胞2次,收集大約(1~5)×105個(gè)細(xì)胞,使用500 μL 1×Binding Buffer重懸細(xì)胞,相繼加入5 μL Annexin V-FITC和10 μL PI,室溫避光5 min后使用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組的凋亡率。

    2.5Transwell細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn) 轉(zhuǎn)染24 h后,胰酶消化各組細(xì)胞并使用無(wú)血清培養(yǎng)基重懸細(xì)胞,調(diào)整細(xì)胞密度為2×108/L,取細(xì)胞懸液100 μL加在Transwell小室的上層,Transwell小室下層加入500 μL含10%血清培養(yǎng)基,置于37 ℃、5% CO2孵箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h后取出小室,PBS清洗后使用濕棉簽輕輕拭去上室中未遷移的細(xì)胞, 4%多聚甲醛固定20 min,PBS清洗3次后使用0.1%結(jié)晶紫染色10 min,PBS清洗后隨機(jī)選取5個(gè)視野,計(jì)數(shù)下室染色細(xì)胞。

    2.6Western blot實(shí)驗(yàn) 收集細(xì)胞后,使用RIPA裂解液(含1% PMSF)提取細(xì)胞中的蛋白質(zhì),使用BCA法測(cè)定蛋白濃度。取大約30 μg蛋白行10% SDS-PAGE分離蛋白,使用濕轉(zhuǎn)法電轉(zhuǎn)至NC膜上,5%脫脂奶粉室溫封閉2 h,抗EZH2(1∶2 000)和GAPDH(1∶5 000)抗體4 ℃孵育過(guò)夜,TBST洗3次后,加入HRP標(biāo)記 II 抗(1∶8 000)室溫孵育1 h,TBST清洗3次后,ECL發(fā)光法顯影曝光,灰度值采用ImageJ軟件掃描并記錄,并分析目的蛋白與內(nèi)參照蛋白灰度的比值作為目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

    3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

    用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示,多組間比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA),組間兩兩比較采用Bonferroni校正的t檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    結(jié) 果

    1 PCR檢測(cè)結(jié)果

    PCR結(jié)果顯示,miRNA-101-3p在胃癌細(xì)胞MGC-803和HGC-27中的表達(dá)量顯著低于胃黏膜細(xì)胞GES-1(P<0.05),其中胃癌細(xì)胞MGC-803中miRNA-101-3p的表達(dá)水平最低,故以胃癌細(xì)胞MGC-803作為后續(xù)的研究對(duì)象,見(jiàn)圖1。轉(zhuǎn)染48 h后,與miRNA NC組相比,miRNA-101-3p mimics組的miRNA-101-3p表達(dá)水平顯著上調(diào)(P<0.05),而miRNA NC組與空白組之間的差異沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性,說(shuō)明轉(zhuǎn)染成功; EZH2在miRNA-101-3p mimics組的水平顯著低于miRNA NC組和空白組(P<0.05),見(jiàn)圖2。

    Figure 1. The expression of miRNA-101-3p in gastric mucosal cells and gastric cancer cells detected by real-time PCR. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsGES-1.

    圖1Real-timePCR檢測(cè)胃黏膜細(xì)胞和胃癌細(xì)胞中mi-RNA-101-3p的表達(dá)水平

    Figure 2. The expression levels of miRNA-101-3p and EZH2 mRNA in MGC-803 cells after transfected with miRNA-101-3p mimics for 48 h were detected by real-time PCR. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsmiRNA-101-3p mimics group.

    圖2Real-timePCR檢測(cè)轉(zhuǎn)染48h后miRNA-101-3p和EZH2mRNA的表達(dá)水平

    2 轉(zhuǎn)染效率的評(píng)價(jià)

    轉(zhuǎn)染24 h后,使用熒光顯微鏡觀察,結(jié)果顯示大約90%以上的細(xì)胞均呈紅色熒光蛋白Cy3陽(yáng)性,并進(jìn)一步使用流式細(xì)胞儀進(jìn)行分選,結(jié)果說(shuō)明轉(zhuǎn)染成功,見(jiàn)圖3。

    3 miRNA-101-3p對(duì)胃癌細(xì)胞增殖能力的影響

    轉(zhuǎn)染后使用CCK-8法測(cè)定各組細(xì)胞的吸光度(A)值,結(jié)果顯示,miRNA-101-3p mimics組在48和72 h時(shí)其吸光度值明顯低于miRNA NC組和空白對(duì)照組(P<0.05),而miRNA NC組和空白對(duì)照組之間的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性,見(jiàn)圖4A;同時(shí)采用臺(tái)盼藍(lán)染色法計(jì)數(shù)轉(zhuǎn)染后活細(xì)胞數(shù)量,結(jié)果顯示,miRNA-101-3p mimics組的活細(xì)胞數(shù)量顯著低于miRNA NC組和空白對(duì)照組(P<0.05),而miRNA NC組和空白對(duì)照組之間的活細(xì)胞數(shù)量沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性,見(jiàn)圖4B。此結(jié)果說(shuō)明過(guò)表達(dá)miRNA-101-3p后胃癌細(xì)胞MGC-803的生長(zhǎng)受到抑制,細(xì)胞活力明顯降低。

    Figure 3. The transfection efficiency after transfected with miRNA-101-3p mimics for 24 h (×200). A: the MGC-803 cells under phase-contrast microscope; B: the image of Cy3 positive staining of MGC-803 cells under fluorescence microscope; C: the intensity of red fluorescence in MGC-803 cells analyzed by flow cytometry.

    圖3脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染24h細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率

    Figure 4. The effect of miRNA-101-3p overexpression on the proliferation of gastric cancer cells. A: the viability of gastric cancer MGC-803 cells was dectected by CCK-8 assay; B: the number of gastric cancer cells was counted by trypan blue staining. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsmiRNA-101-3p mimics.

    圖4過(guò)表達(dá)miRNA-101-3p對(duì)胃癌細(xì)胞MGC-803增殖的影響

    4 miRNA-101-3p對(duì)胃癌細(xì)胞周期的影響

    過(guò)表達(dá)miRNA-101-3p 48 h后,胃癌細(xì)胞的S期比例為(27.39±0.66)%,顯著低于NC組和空白對(duì)照組,而細(xì)胞分裂處于G0/G1期的胃癌細(xì)胞明顯增多(P<0.05),說(shuō)明過(guò)表達(dá)miRNA-101-3p可以導(dǎo)致胃癌細(xì)胞出現(xiàn)G1期阻滯,進(jìn)而抑制細(xì)胞的增殖,見(jiàn)圖5。

    5 miRNA-101-3p對(duì)胃癌細(xì)胞凋亡的影響

    流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示,過(guò)表達(dá)miRNA-101-3p 48 h后,胃癌細(xì)胞早期凋亡率為(15.62±1.26)%,明顯高于NC組(6.20±1.07)%和空白對(duì)照組(4.54±1.32)%(P<0.05),說(shuō)明miRNA-101-3p過(guò)表達(dá)可以促進(jìn)胃癌細(xì)胞出現(xiàn)凋亡,見(jiàn)圖6。

    6 miRNA-101-3p對(duì)胃癌細(xì)胞遷移能力的影響

    Transwell細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示,過(guò)表達(dá)miRNA-101-3p后,胃癌細(xì)胞的遷移能力顯著降低,遷移的細(xì)胞數(shù)明顯低于miRNA NC組和空白對(duì)照組(P<0.05),說(shuō)明過(guò)表達(dá)miRNA-101-3p可以抑制胃癌細(xì)胞遷移,見(jiàn)圖7。

    7 miRNA-101-3p對(duì)EZH2的影響

    利用在線軟件TargetScan進(jìn)行生物信息學(xué)分析,預(yù)測(cè)結(jié)果顯示,EZH2是miRNA-101-3p的潛在靶基因。為了進(jìn)一步確認(rèn)miRNA-101-3p對(duì)EZH2基因的調(diào)控,Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,過(guò)表達(dá)miRNA-101-3p后,EZH2的表達(dá)明顯低于NC組和空白對(duì)照組(P<0.05),而NC組和空白對(duì)照組之間EZH2的表達(dá)沒(méi)有顯著變化,說(shuō)明miRNA-101-3p可以抑制胃癌細(xì)胞MGC803中EZH2蛋白的表達(dá);而胃癌細(xì)胞MGC-803和HGC-27中EZH2的水平顯著高于胃黏膜細(xì)胞GES-1(P<0.05),見(jiàn)圖8。

    Figure 5. The effect of miRNA-101-3p overexpression on the cell cycle distribution of gastric cancer cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsmiRNA-101-3p mimics.

    圖5過(guò)表達(dá)miRNA-101-3p對(duì)胃癌細(xì)胞周期的影響

    Figure 6. The effect of miRNA-101-3p overexpression on the apoptosis of gastric cancer cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsmiRNA-101-3p mimics.

    圖6過(guò)表達(dá)miRNA-101-3p對(duì)胃癌細(xì)胞凋亡的影響

    Figure 7. The effect of miRNA-101-3p on the migration ability of gastric cancer cells detected by Transwell assay (×200). Mean±SD.n=3.*P<0.05vsmiRNA-101-3p mimics.

    圖7Transwell遷移實(shí)驗(yàn)檢測(cè)miRNA-101-3p對(duì)胃癌細(xì)胞遷移能力的影響

    Figure 8. The protein expression of EZH2 in gastric cancer cells and gastric mucosal cells was detected by Western blot. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsmiRNA-101-3p mimics;#P<0.05vsGES-1.

    圖8Westernblot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)胃癌細(xì)胞和胃黏膜細(xì)胞中EZH2的蛋白表達(dá)

    討 論

    miRNA做為一種非編碼RNA,可以調(diào)控機(jī)體許多生理和病理過(guò)程,大約30%的編碼蛋白基因被miRNA所調(diào)控[10]。miRNA-101-3p在多種腫瘤中表達(dá)下調(diào),研究發(fā)現(xiàn),在肝癌中下調(diào)的miRNA-101-3p可以靶向調(diào)控髓細(xì)胞白血病基因1 (myeloid cell leukemia-1,Mcl-1)促進(jìn)肝癌細(xì)胞凋亡,抑制肝癌細(xì)胞增殖[5];在乳腺癌中,miRNA-101-3p與生存期及淋巴轉(zhuǎn)移密切相關(guān),并且可能通過(guò)調(diào)控CXC趨化因子受體7(CXC chemokine receptor, CXCR7)影響體內(nèi)細(xì)胞周期蛋白D1(cyclin D1)、B細(xì)胞白血病/淋巴瘤2(B-cell leukemia/lymphoma-2,Bcl-2)、基質(zhì)金屬蛋白酶2(matrixmetalloprotein 2,MMP2)、MMP-9和上皮鈣黏蛋白(E-cadherin)等蛋白的表達(dá),進(jìn)而抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖[6]。在本研究中,miRNA-101-3p在胃癌細(xì)胞中的表達(dá)下調(diào),為了進(jìn)一步研究miRNA-101-3p對(duì)胃癌細(xì)胞增殖、凋亡以及遷移的影響,采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染技術(shù)過(guò)表達(dá)胃癌細(xì)胞中miRNA-101-3p的水平,結(jié)果顯示上調(diào)miRNA-101-3p的水平后,胃癌細(xì)胞的生長(zhǎng)和遷移能力明顯受到抑制,細(xì)胞S期明顯減少,G0/G1期延長(zhǎng),細(xì)胞阻滯于G0/G1期,而細(xì)胞的早期凋亡率明顯增加;以上結(jié)果說(shuō)明,miRNA-101-3p在胃癌的發(fā)生和發(fā)展中可能起到了抑癌基因的作用。

    EZH2是表觀遺傳調(diào)控因子PcG蛋白的核心組件,在多種腫瘤[11-12]中表達(dá)增高,是腫瘤治療的潛在靶點(diǎn)。已有研究發(fā)現(xiàn)[13-14],胃癌組織中EZH2的表達(dá)明顯增高,而且與生存期密切相關(guān)。在本研究中我們也發(fā)現(xiàn)了胃癌細(xì)胞中EZH2的表達(dá)高于胃黏膜細(xì)胞;有學(xué)者發(fā)現(xiàn)[15],沉默胃癌細(xì)胞中EZH2的表達(dá)后可以誘導(dǎo)P53和組蛋白脫乙酰酶1(histone deacetylase 1, HDAC1)的表達(dá),同時(shí)抑制cyclin D1和cyclin E的表達(dá)進(jìn)而調(diào)控細(xì)胞的增殖; Bai等[16]也發(fā)現(xiàn),抑制EZH2的表達(dá)后可以抑制胃癌細(xì)胞SGC-7901的生長(zhǎng),激活p21和p16的表達(dá),進(jìn)而調(diào)控細(xì)胞周期;吳雪雷等[17]發(fā)現(xiàn) EZH2可以通過(guò)核因子κB(nuclear factor kappa B, NF-κB) 而抑制胃癌細(xì)胞的生長(zhǎng);還有的學(xué)者發(fā)現(xiàn),長(zhǎng)鏈非編碼RNA 00152可通過(guò)結(jié)合EZH2而抑制p15和p21的表達(dá),進(jìn)而促進(jìn)胃癌的進(jìn)展[18],可見(jiàn)EZH2基因可能成為治療胃癌的重要靶點(diǎn)。在本研究中,通過(guò)生物學(xué)信息預(yù)測(cè)EZH2基因可能是miRNA-101-3p的潛在靶基因,也有學(xué)者[19]研究發(fā)現(xiàn)在前列腺癌和乳腺癌中EZH2基因受到miRNA-101-3p的靶向調(diào)控;而在其它腫瘤如膀胱癌[20]和肝癌[21]中通過(guò)雙熒光素報(bào)告基因也驗(yàn)證了miRNA-101-3p對(duì)EZH2基因的靶向調(diào)控;本研究中,Western blot實(shí)驗(yàn)顯示胃癌細(xì)胞中EZH2的表達(dá)顯著高于胃黏膜細(xì)胞,同時(shí)miRNA-101-3p的表達(dá)則低于胃黏膜細(xì)胞,而在上調(diào)胃癌細(xì)胞中的miRNA-101-3p后,EZH2的表達(dá)則明顯下調(diào)。因此我們推斷,在胃癌中EZH2與miRNA-101-3p的水平有可能呈負(fù)相關(guān),并由于miRNA-101-3p下調(diào),使得其對(duì)EZH2基因的負(fù)調(diào)控作用減弱, EZH2的表達(dá)增加,而增高的EZH2蛋白又會(huì)影響E-cadherin[22]、整合素2[23]和印跡基因CDKN1C(p57KP12)[24]等的表達(dá),從而最終促進(jìn)了腫瘤的演進(jìn)。

    綜上所述,miRNA-101-3p可能通過(guò)靶向負(fù)調(diào)控EZH2基因的表達(dá),進(jìn)而抑制胃癌細(xì)胞的生長(zhǎng)和遷移,促進(jìn)胃癌細(xì)胞的凋亡。miRNA-101-3p有望成為治療胃癌的重要靶點(diǎn)。

    [1] Crew KD, Neugut AI. Epidemiology of gastric cancer[J]. World J Gastroenterol, 2006, 12(3):354-362.

    [2] Baba H, Kuwabara K, Ishiguro T, et al. Prognostic factors for stage IV gastric cancer[J]. Int Surg, 2011, 98(2):181-187.

    [3] Chandramouli A, Onyeagucha BC, Mercado-Pimentel ME, et al. MicroRNA-101 (miR-101) post-transcriptio-nally regulates the expression of EP4 receptor in colon can-cers[J]. Cancer Biol Ther, 2012, 13(3):175-183.

    [4] Zhang H, Qi F, Cao Y, et al. Down-regulated microRNA-101 in bladder transitional cell carcinoma is associated with poor prognosis[J]. Med Sci Monit, 2014, 20(2):812-817.

    [5] Su H, Yang JR, Xu T, et al. MicroRNA-101, down-regulated in hepatocellular carcinoma, promotes apoptosis and suppresses tumorigenicity[J]. Cancer Res, 2009, 69(3):1139-1142.

    [6] Li JT, Jia LT, Liu NN, et al. MiRNA-101 inhibits breast cancer growth and metastasis by targeting CX chemokine receptor 7[J]. Oncotarget, 2015, 6(31):30818-30830.

    [7] Wang HJ, Ruan HJ, He XJ, et al. MicroRNA-101 is down-regulated in gastric cancer and involved in cell migration and invasion[J]. Eur J Cancer, 2010, 46(12):2295-2303.

    [8] Sudo T, Utsunomiya T, Mimori K, et al. Clinicopatholo-gical significance of EZH2 mRNA expression in patients with hepatocellular carcinoma[J]. Br J Cancer, 2005, 92(9):1754-1758.

    [9] Mu Z, Li H, Fernandez SV,et al.EZH2 knockdown suppresses the growth and invasion of human inflammatory breast cancer cells[J]. J Exp Clin Cancer Res, 2013, 32:70.

    [10] Lewis BP, Burge CB, Bartel DP. Conserved seed pairing, often flanked by adenosines, indicates that thousands of human genes are microRNA targets[J]. Cell, 2005, 120(1):15-20.

    [11] Varambally S, Dhanasekaran SM, Zhou M, et al. The polycomb group protein EZH2 is involved in progression of prostate cancer[J]. Nature, 2002, 419(6907):624-629.

    [12] Chang CJ, Yang JY, Xia W, et al. EZH2 promotes expansion of breast tumor initiating cells through activation of RAF1-β-catenin signaling[J]. Cancer Cell, 2011, 19(1):86-100.

    [13] Matsukama Y, Semba S, Kato H,et al. Expression of the enhancer of zeste homolog 2 is correlated with poor prognosis in human gastric cancer[J]. Cancer Sci, 2006, 97(6):484-491.

    [14] He LJ, Cai MY, Xu GL,et al. Prognostic significance of overexpression of EZH2 and H3k27me3 proteins in gastric cancer[J]. Asian Pac J Cancer Prev, 2012, 13(7):3173-3178.

    [15] Choi JH, Song YS, Yoon JS, et al. Enhancer of zeste homolog 2 expression is associate with tumor cell proliferation and metastasis in gastric cancer[J]. APMIS, 2010, 118(3):196-202.

    [16] Bai J, Chen J, Ma M, et al. Inhibiting enhancer of zeste homolog 2 promotes cellular senescence in gastric cancer cells SGC-7901 by activation of p21 and p16[J]. DNA Cell Biol, 2014, 33(6):337-344.

    [17] 吳雪雷, 蔡耀武, 莊志忠, 等.EZH2對(duì)胃癌細(xì)胞核因子κB靶基因的調(diào)節(jié)作用[J]. 中國(guó)病理生理雜志,2015,31(12) :2169-2175.

    [18] Chen WM, Huang MD, Sun DP, et al. Long intergenic non-coding RNA 00152 promotes tumor cell cycle progression by binding to EZH2 and repressing p15 and p21 in gastric cancer[J]. Oncotarget, 2016, 7(9):9773-9787.

    [19] Varambally S, Cao Q, Mani RS, et al. Genomic loss of microRNA-101 leads to overexpression of histone methyltransferase EZH2 in cancer[J]. Science, 2008, 322(5908):1695-1699.

    [20] Friedman JM, Liang G, Liu CC, et al. The putative tumor suppressor microRNA-101 modulates the cancer epigenome by repressing the polycomb group protein EZH2[J]. Cancer Res, 2009, 69(6):2623-2629.

    [21] Xu L, Beckebaum S, Lacob S, et al. MicroRNA-101 inhibits human hepatocellular carcinoma progression through EZH2 downregulation and increased cytostatic drug sensitivity[J]. J Hepatol, 2014, 60(3):590-598.

    [22] Han T, Jiao F, Hu H, et al. EZH2 promotes cell migrarion and invasion but not alters cell proliferation by suppressing E-cadherin, partly through association with MALAT-1 in pancreatic cancer[J]. Oncotarget, 2016, 7(10):11194-11207.

    [23] Ferraro A, Boni T, Pintzas A. EZH2 regulates cofilin activity and colon cancer cell migration by targeting ITGA2 gene[J]. PLoS One, 2014, 9(12):e115276.

    [24] Yang X, Karuturi RK, Sun F, et al.CDKN1C(p57KP12) is a direct target of EZH2 and suppressed by multiple epigenetic mechanisms in breast cancer cells[J]. PLoS One, 2009, 4(4):e5011.

    miRNA-101-3p inhibits proliferation and migration of gastric cancer cells by targeting EZH2

    ZHANG Xiao-tian1, ZHANG Xiao-yan1, HUANG Sai-ya1, WANG Qian2, LIU Wei1

    (1DepartmentofMedicalLaboratoryScience,FenyangCollegeofShanxiMedicalUniversity,Fenyang032200,China;2DepartmentofMedicalImaging,ShanxiMedicalUniversity,Taiyuan030001,China.E-mail: 116048164@qq.com)

    AIM: To investigate the role of microRNA-101-3p (miRNA-101-3p) on the proliferation, apoptosis and invasion of gastric cancer cells and the possible regulatory mechanisms.METHODSThe expression of miRNA-101-3p in two kinds of gastric cancer cells and a gastric mucosal cell line was detected by real-time PCR. The miRNA-101-3p was overexpressed by Lipofectamine 2000 transfection with miRNA-101-3p mimics. The effects of miRNA-101-3p on cell cycle distribution and apoptosis were analyzed by flow cytometry. The effects of miRNA-101-3p on cell proliferation and migration abilities were detected by CCK-8 assay, trypan blue exclusion test and Transwell assay. The protein expression of enhancer of zeste homolog 2 (EZH2) was determined by Western blot.RESULTSThe expression of miRNA-101-3p in gastric cancer cells was lower than that in gastric mucosal cells (P<0.05). The gastric cancer cell MGC-803 had the lowest expression level of miRNA-101-3p. The result of flow cytometry showed that the population of S phase was reduced, and the population of G0/G1phase and the early stage apoptotic rate were increased after the expression of miRNA-101-3p was overexpressed (P<0.05). The results of CCK-8 assay, trypan blue exclusion test and Transwell assay showed that overexpression of miRNA-101-3p significantly reduced the proliferation and migration abilities of gastric cancer cells (P<0.05). Overexpression of miRNA-101-3p decreased the protein level of EZH2 (P<0.05).CONCLUSIONmiRNA-101-3p may suppresses the gastric cancer cell proliferation and migration, and promotes the gastric cancer cell apotosis by down-regulation of EZH2.

    Gastric cancer; MicroRNA; Cell proliferation; Cell migration; Apotosis; Enhancer of zeste homolog 2

    1000- 4718(2017)12- 2143- 08

    2017- 07- 17

    2017- 11- 07

    國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No. 81301426);山西醫(yī)科大學(xué)汾陽(yáng)學(xué)院科研項(xiàng)目(No. 2017B05)

    △通訊作者 Tel: 0358-2100372; E-mail: 116048164@qq.com

    R735.2; R363.2

    A

    10.3969/j.issn.1000- 4718.2017.12.006

    (責(zé)任編輯: 林白霜, 羅 森)

    猜你喜歡
    結(jié)果顯示細(xì)胞周期空白對(duì)照
    例析陰性對(duì)照與陽(yáng)性對(duì)照在高中生物實(shí)驗(yàn)教學(xué)中的應(yīng)用
    紅霉素聯(lián)合順鉑對(duì)A549細(xì)胞的細(xì)胞周期和凋亡的影響
    最嚴(yán)象牙禁售令
    過(guò)表達(dá)H3K9me3去甲基化酶對(duì)豬克隆胚胎體外發(fā)育效率的影響(內(nèi)文第 96 ~ 101 頁(yè))圖版
    Identifying vital edges in Chinese air route network via memetic algorithm
    新聞眼
    金融博覽(2016年7期)2016-08-16 18:44:41
    第四次大熊貓調(diào)查結(jié)果顯示我國(guó)野生大熊貓保護(hù)取得新成效
    NSCLC survivin表達(dá)特點(diǎn)及其與細(xì)胞周期的關(guān)系研究
    X線照射劑量率對(duì)A549肺癌細(xì)胞周期的影響
    熊果酸對(duì)肺癌細(xì)胞株A549及SPCA1細(xì)胞周期的抑制作用
    正在播放国产对白刺激| 国产亚洲精品久久久久久毛片| 熟妇人妻久久中文字幕3abv| 999精品在线视频| 亚洲欧美日韩无卡精品| 亚洲精品色激情综合| 亚洲aⅴ乱码一区二区在线播放 | 久久九九热精品免费| 18禁黄网站禁片午夜丰满| 最近最新中文字幕大全电影3 | 欧美av亚洲av综合av国产av| 香蕉av资源在线| 视频区欧美日本亚洲| 精品久久久久久久末码| 精品午夜福利视频在线观看一区| 91九色精品人成在线观看| 黄色 视频免费看| 在线永久观看黄色视频| 黄频高清免费视频| 非洲黑人性xxxx精品又粗又长| 怎么达到女性高潮| 黑人巨大精品欧美一区二区mp4| 国产成人系列免费观看| videosex国产| 国产欧美日韩一区二区精品| 精品久久久久久久久久久久久 | 欧美性猛交黑人性爽| 欧美乱妇无乱码| 国产片内射在线| 亚洲一区中文字幕在线| 亚洲国产毛片av蜜桃av| 免费高清在线观看日韩| 免费在线观看黄色视频的| 亚洲人成网站高清观看| 精品少妇一区二区三区视频日本电影| 亚洲精品久久成人aⅴ小说| 国产亚洲精品久久久久5区| x7x7x7水蜜桃| 真人做人爱边吃奶动态| 黄色 视频免费看| 欧美黑人欧美精品刺激| 日韩大码丰满熟妇| 国产成人啪精品午夜网站| 天天一区二区日本电影三级| 亚洲欧美日韩无卡精品| 免费看美女性在线毛片视频| 国产97色在线日韩免费| 99久久99久久久精品蜜桃| 男人舔女人的私密视频| 19禁男女啪啪无遮挡网站| 亚洲成av人片免费观看| 国产av一区在线观看免费| 成年版毛片免费区| 啦啦啦免费观看视频1| 欧美日韩乱码在线| 久久久久久亚洲精品国产蜜桃av| 亚洲av成人一区二区三| 亚洲精品中文字幕在线视频| 在线免费观看的www视频| 国产成人精品久久二区二区91| 男人操女人黄网站| 欧美一区二区精品小视频在线| 日韩精品中文字幕看吧| 丝袜在线中文字幕| av中文乱码字幕在线| 亚洲精品久久成人aⅴ小说| 久久香蕉国产精品| 母亲3免费完整高清在线观看| 欧美色视频一区免费| 很黄的视频免费| 久久久国产成人精品二区| 伦理电影免费视频| 麻豆一二三区av精品| 国产乱人伦免费视频| 此物有八面人人有两片| 国产免费av片在线观看野外av| 国产欧美日韩精品亚洲av| 精品免费久久久久久久清纯| 国产av又大| 亚洲avbb在线观看| 免费观看精品视频网站| 欧美国产精品va在线观看不卡| 亚洲成人免费电影在线观看| 最好的美女福利视频网| 欧美激情 高清一区二区三区| 日韩欧美免费精品| 欧美日韩福利视频一区二区| 一卡2卡三卡四卡精品乱码亚洲| 我的亚洲天堂| 欧美国产精品va在线观看不卡| 久久婷婷成人综合色麻豆| 国产一区在线观看成人免费| 亚洲精品美女久久久久99蜜臀| 嫩草影院精品99| 欧美日韩一级在线毛片| 国产v大片淫在线免费观看| 天堂影院成人在线观看| 免费一级毛片在线播放高清视频| 色婷婷久久久亚洲欧美| 久久久久久九九精品二区国产 | 欧美日韩精品网址| 嫩草影视91久久| 久久精品国产清高在天天线| 天天添夜夜摸| av欧美777| 老司机靠b影院| 99精品在免费线老司机午夜| 亚洲国产精品合色在线| 久久婷婷成人综合色麻豆| 日本 av在线| 国产精品爽爽va在线观看网站 | 国产麻豆成人av免费视频| 久久热在线av| 欧美精品啪啪一区二区三区| 国产午夜福利久久久久久| 久久国产精品男人的天堂亚洲| av有码第一页| 欧美乱妇无乱码| 国内久久婷婷六月综合欲色啪| 亚洲午夜理论影院| 国产一级毛片七仙女欲春2 | e午夜精品久久久久久久| 高潮久久久久久久久久久不卡| 成人国产综合亚洲| 此物有八面人人有两片| 99热只有精品国产| 欧美色视频一区免费| 国产1区2区3区精品| 午夜福利高清视频| 久久久国产精品麻豆| 免费在线观看成人毛片| 黑人操中国人逼视频| 天天躁狠狠躁夜夜躁狠狠躁| cao死你这个sao货| 级片在线观看| 午夜视频精品福利| 极品教师在线免费播放| 午夜福利成人在线免费观看| 国产视频一区二区在线看| 十八禁网站免费在线| 一级作爱视频免费观看| 国产亚洲精品av在线| 欧美在线黄色| 亚洲五月婷婷丁香| 成人一区二区视频在线观看| 日本五十路高清| а√天堂www在线а√下载| 欧洲精品卡2卡3卡4卡5卡区| 久久久久久免费高清国产稀缺| 国产一区二区在线av高清观看| 亚洲人成伊人成综合网2020| 国产伦一二天堂av在线观看| 波多野结衣高清无吗| 亚洲片人在线观看| 欧美性猛交黑人性爽| 日韩有码中文字幕| 日本一本二区三区精品| 免费一级毛片在线播放高清视频| 又黄又爽又免费观看的视频| 欧美又色又爽又黄视频| 中文字幕人妻丝袜一区二区| 免费搜索国产男女视频| 老司机午夜福利在线观看视频| 色播在线永久视频| 少妇粗大呻吟视频| 国产精品免费一区二区三区在线| 亚洲av熟女| 国产区一区二久久| 国产成人精品久久二区二区免费| 精品一区二区三区视频在线观看免费| 日韩欧美一区视频在线观看| 黄色视频,在线免费观看| 99热这里只有精品一区 | √禁漫天堂资源中文www| 999久久久精品免费观看国产| 女性生殖器流出的白浆| 亚洲第一欧美日韩一区二区三区| 久久香蕉精品热| 久久香蕉国产精品| 老司机福利观看| 亚洲国产高清在线一区二区三 | 久久国产精品人妻蜜桃| 神马国产精品三级电影在线观看 | 欧美另类亚洲清纯唯美| 黄网站色视频无遮挡免费观看| 亚洲精品国产精品久久久不卡| 久久精品国产99精品国产亚洲性色| 成人一区二区视频在线观看| 亚洲精品中文字幕在线视频| 婷婷六月久久综合丁香| 欧美激情极品国产一区二区三区| 日日干狠狠操夜夜爽| 日韩一卡2卡3卡4卡2021年| 亚洲精品av麻豆狂野| 国产高清视频在线播放一区| 一进一出好大好爽视频| 国产精品久久久久久人妻精品电影| 成熟少妇高潮喷水视频| 中文字幕精品免费在线观看视频| 亚洲真实伦在线观看| 国产黄色小视频在线观看| 桃色一区二区三区在线观看| 欧美乱码精品一区二区三区| 亚洲 国产 在线| 国产欧美日韩精品亚洲av| 麻豆成人午夜福利视频| 国产精品电影一区二区三区| 久久久久久人人人人人| 精品久久久久久久毛片微露脸| 亚洲一卡2卡3卡4卡5卡精品中文| 在线十欧美十亚洲十日本专区| 久久精品国产亚洲av香蕉五月| 一进一出抽搐动态| 岛国在线观看网站| av有码第一页| 午夜成年电影在线免费观看| 91字幕亚洲| 亚洲国产精品成人综合色| 丁香六月欧美| 国产又色又爽无遮挡免费看| 欧美人与性动交α欧美精品济南到| 在线十欧美十亚洲十日本专区| 十八禁网站免费在线| 久久久久国产一级毛片高清牌| 精品国产亚洲在线| а√天堂www在线а√下载| 精品国产乱子伦一区二区三区| 美女大奶头视频| 成人手机av| 日本熟妇午夜| 久久久水蜜桃国产精品网| 99久久精品国产亚洲精品| 国产视频一区二区在线看| 极品教师在线免费播放| 88av欧美| 狂野欧美激情性xxxx| 欧美三级亚洲精品| 亚洲欧美一区二区三区黑人| 怎么达到女性高潮| av欧美777| 非洲黑人性xxxx精品又粗又长| 精品少妇一区二区三区视频日本电影| 亚洲九九香蕉| 女人被狂操c到高潮| 国产99白浆流出| 满18在线观看网站| 国产精品野战在线观看| 男女做爰动态图高潮gif福利片| 亚洲人成伊人成综合网2020| 精品国产亚洲在线| 国产成人精品无人区| 窝窝影院91人妻| 一级a爱片免费观看的视频| 一个人观看的视频www高清免费观看 | 欧美丝袜亚洲另类 | av欧美777| 这个男人来自地球电影免费观看| 九色国产91popny在线| 欧美亚洲日本最大视频资源| 男女床上黄色一级片免费看| 国产色视频综合| 欧美一级a爱片免费观看看 | 亚洲精品在线观看二区| 琪琪午夜伦伦电影理论片6080| 老鸭窝网址在线观看| 婷婷六月久久综合丁香| 欧美成人性av电影在线观看| 国产熟女午夜一区二区三区| 国产黄a三级三级三级人| 亚洲精品久久国产高清桃花| 法律面前人人平等表现在哪些方面| 侵犯人妻中文字幕一二三四区| 亚洲精品久久成人aⅴ小说| 在线观看午夜福利视频| 精品一区二区三区av网在线观看| 99国产极品粉嫩在线观看| 人成视频在线观看免费观看| 国产在线精品亚洲第一网站| 欧美亚洲日本最大视频资源| 国产精品爽爽va在线观看网站 | 午夜久久久在线观看| 国产精品亚洲一级av第二区| 欧美黄色片欧美黄色片| 日韩大码丰满熟妇| 窝窝影院91人妻| 日韩精品免费视频一区二区三区| 国产精华一区二区三区| 真人做人爱边吃奶动态| 亚洲国产精品999在线| 亚洲av日韩精品久久久久久密| 国产麻豆成人av免费视频| 亚洲午夜理论影院| 亚洲国产高清在线一区二区三 | 操出白浆在线播放| 国产成+人综合+亚洲专区| 国产成年人精品一区二区| 无人区码免费观看不卡| 日日爽夜夜爽网站| 久久狼人影院| 可以在线观看的亚洲视频| www日本在线高清视频| 88av欧美| 日韩一卡2卡3卡4卡2021年| 国产精品国产高清国产av| 久久99热这里只有精品18| 这个男人来自地球电影免费观看| 啦啦啦观看免费观看视频高清| 一进一出抽搐gif免费好疼| 亚洲人成77777在线视频| 午夜成年电影在线免费观看| 91字幕亚洲| 18美女黄网站色大片免费观看| 91在线观看av| 18禁国产床啪视频网站| 18禁黄网站禁片午夜丰满| 欧美绝顶高潮抽搐喷水| 91麻豆精品激情在线观看国产| 久久久久久亚洲精品国产蜜桃av| 亚洲精品在线美女| 俄罗斯特黄特色一大片| 欧美国产日韩亚洲一区| 久久精品人妻少妇| 99久久无色码亚洲精品果冻| 国产1区2区3区精品| 精品国产美女av久久久久小说| 欧美色欧美亚洲另类二区| 免费无遮挡裸体视频| 国产精品,欧美在线| 国产熟女午夜一区二区三区| 最近最新中文字幕大全电影3 | 久久国产精品男人的天堂亚洲| a级毛片在线看网站| 夜夜躁狠狠躁天天躁| 国内少妇人妻偷人精品xxx网站 | 色综合婷婷激情| 搡老岳熟女国产| 国产色视频综合| 级片在线观看| 又紧又爽又黄一区二区| 成人永久免费在线观看视频| 欧美精品啪啪一区二区三区| 深夜精品福利| 少妇的丰满在线观看| 国产黄片美女视频| 波多野结衣高清作品| 99久久精品国产亚洲精品| 国产精品国产高清国产av| 午夜福利欧美成人| 欧美成人性av电影在线观看| 日韩欧美在线二视频| 又黄又爽又免费观看的视频| 一区福利在线观看| 大香蕉久久成人网| 正在播放国产对白刺激| 一级黄色大片毛片| 欧美黄色片欧美黄色片| 国产av不卡久久| 国产国语露脸激情在线看| 国产伦在线观看视频一区| 亚洲国产毛片av蜜桃av| 日本a在线网址| www.精华液| 国产精品98久久久久久宅男小说| 12—13女人毛片做爰片一| 国产亚洲欧美在线一区二区| 又大又爽又粗| 亚洲国产精品久久男人天堂| 久久青草综合色| 亚洲欧美精品综合一区二区三区| 日韩欧美一区二区三区在线观看| 狠狠狠狠99中文字幕| 欧美黄色淫秽网站| 国产免费男女视频| 黄网站色视频无遮挡免费观看| 精品乱码久久久久久99久播| 亚洲人成电影免费在线| 午夜日韩欧美国产| 久久人人精品亚洲av| 色播亚洲综合网| 最近最新中文字幕大全电影3 | 欧美国产精品va在线观看不卡| 久久精品国产亚洲av香蕉五月| 麻豆成人午夜福利视频| 国产精品亚洲美女久久久| 美女高潮喷水抽搐中文字幕| 亚洲人成伊人成综合网2020| 亚洲国产精品合色在线| 十八禁网站免费在线| 性欧美人与动物交配| 精品一区二区三区视频在线观看免费| 久久人妻福利社区极品人妻图片| 正在播放国产对白刺激| 国产精品影院久久| 欧美成人一区二区免费高清观看 | 亚洲第一青青草原| 在线观看免费午夜福利视频| www日本在线高清视频| 久久精品aⅴ一区二区三区四区| 国产av又大| 中文字幕精品免费在线观看视频| 88av欧美| 亚洲男人的天堂狠狠| 亚洲全国av大片| 高清毛片免费观看视频网站| 欧美性长视频在线观看| 国产精品九九99| 日本一本二区三区精品| 美女午夜性视频免费| 午夜激情福利司机影院| 精品福利观看| 成人亚洲精品一区在线观看| 91大片在线观看| 巨乳人妻的诱惑在线观看| 三级毛片av免费| 精品一区二区三区视频在线观看免费| 99国产精品一区二区蜜桃av| 亚洲中文日韩欧美视频| 欧美激情 高清一区二区三区| 成人亚洲精品av一区二区| 久久久久亚洲av毛片大全| 国产精华一区二区三区| 白带黄色成豆腐渣| 国产精品精品国产色婷婷| 精品一区二区三区av网在线观看| 久热爱精品视频在线9| 夜夜爽天天搞| 一二三四在线观看免费中文在| 琪琪午夜伦伦电影理论片6080| 色播在线永久视频| 两个人视频免费观看高清| 国产精品免费视频内射| 久久午夜亚洲精品久久| 韩国精品一区二区三区| 在线av久久热| 久久99热这里只有精品18| 两个人看的免费小视频| 视频区欧美日本亚洲| 欧美日本视频| 亚洲国产精品成人综合色| 黑人巨大精品欧美一区二区mp4| 香蕉国产在线看| 国内少妇人妻偷人精品xxx网站 | 亚洲,欧美精品.| 亚洲男人的天堂狠狠| 久久久国产成人免费| 日韩大尺度精品在线看网址| 国产免费av片在线观看野外av| 成年女人毛片免费观看观看9| 天天躁夜夜躁狠狠躁躁| 久久精品国产亚洲av香蕉五月| 91国产中文字幕| 久久久久免费精品人妻一区二区 | av有码第一页| 男女那种视频在线观看| 日本 av在线| 可以免费在线观看a视频的电影网站| 波多野结衣高清无吗| 国产精华一区二区三区| 日本成人三级电影网站| 69av精品久久久久久| 美国免费a级毛片| 亚洲av日韩精品久久久久久密| 亚洲国产欧美网| 午夜福利欧美成人| 黄片大片在线免费观看| 搞女人的毛片| 视频区欧美日本亚洲| 亚洲国产欧美网| 亚洲狠狠婷婷综合久久图片| 午夜日韩欧美国产| 国产精品自产拍在线观看55亚洲| 国内精品久久久久精免费| 午夜福利一区二区在线看| 欧美中文综合在线视频| 久久国产乱子伦精品免费另类| 亚洲成人久久爱视频| 精品国产超薄肉色丝袜足j| a级毛片在线看网站| 亚洲色图av天堂| 久久亚洲真实| av免费在线观看网站| 母亲3免费完整高清在线观看| 中文字幕高清在线视频| 亚洲久久久国产精品| 欧美大码av| 他把我摸到了高潮在线观看| 亚洲精品国产一区二区精华液| 欧美在线黄色| 精品久久蜜臀av无| 村上凉子中文字幕在线| 中文字幕精品亚洲无线码一区 | 久久久国产精品麻豆| 真人做人爱边吃奶动态| 美女高潮到喷水免费观看| 黄色a级毛片大全视频| 一区二区三区精品91| 精品电影一区二区在线| 校园春色视频在线观看| 国产高清激情床上av| 精品一区二区三区av网在线观看| 听说在线观看完整版免费高清| 757午夜福利合集在线观看| 国产精华一区二区三区| 2021天堂中文幕一二区在线观 | 天堂√8在线中文| 一本综合久久免费| 久久久久九九精品影院| 亚洲av成人不卡在线观看播放网| 国产精品久久电影中文字幕| 黄色视频不卡| 国产精品国产高清国产av| 亚洲色图 男人天堂 中文字幕| 久久人人精品亚洲av| 午夜久久久久精精品| 久久久久久国产a免费观看| 欧美国产精品va在线观看不卡| 久久性视频一级片| 国产av在哪里看| 黄色丝袜av网址大全| 国产精品九九99| 久久久久国产精品人妻aⅴ院| 大香蕉久久成人网| 久久人人精品亚洲av| 久久午夜综合久久蜜桃| or卡值多少钱| 国产视频一区二区在线看| 久久这里只有精品19| 亚洲精品久久成人aⅴ小说| 日日夜夜操网爽| 大型av网站在线播放| 悠悠久久av| 欧美一级毛片孕妇| 老汉色av国产亚洲站长工具| 天天一区二区日本电影三级| 久久午夜亚洲精品久久| 一级a爱片免费观看的视频| 亚洲在线自拍视频| 欧美激情高清一区二区三区| 亚洲成人免费电影在线观看| 欧美丝袜亚洲另类 | 精品电影一区二区在线| 午夜久久久在线观看| 国产三级黄色录像| 成年版毛片免费区| 99久久国产精品久久久| 国产精品久久久人人做人人爽| 人人妻人人看人人澡| 久久天躁狠狠躁夜夜2o2o| 亚洲av成人不卡在线观看播放网| 黄色丝袜av网址大全| 国产一区二区三区在线臀色熟女| 亚洲欧美精品综合一区二区三区| 精品无人区乱码1区二区| 国产精品久久久久久精品电影 | av超薄肉色丝袜交足视频| 好男人电影高清在线观看| 老司机福利观看| 欧美激情极品国产一区二区三区| 免费无遮挡裸体视频| bbb黄色大片| 国产免费av片在线观看野外av| 亚洲av片天天在线观看| 久久精品成人免费网站| 国产野战对白在线观看| 黄色a级毛片大全视频| 国产高清有码在线观看视频 | 嫩草影视91久久| 在线播放国产精品三级| 亚洲狠狠婷婷综合久久图片| 日韩中文字幕欧美一区二区| 午夜激情福利司机影院| 宅男免费午夜| 欧美 亚洲 国产 日韩一| 国产熟女午夜一区二区三区| 日本 av在线| 国产成人精品久久二区二区免费| 日韩大码丰满熟妇| 日韩成人在线观看一区二区三区| 我的亚洲天堂| 免费人成视频x8x8入口观看| 自线自在国产av| 中文在线观看免费www的网站 | 亚洲免费av在线视频| 岛国视频午夜一区免费看| 亚洲最大成人中文| 女警被强在线播放| 黄色女人牲交| 久久久久免费精品人妻一区二区 | 午夜激情av网站| 日韩一卡2卡3卡4卡2021年| 99热只有精品国产| 熟妇人妻久久中文字幕3abv| 99精品久久久久人妻精品| 久久婷婷人人爽人人干人人爱| 在线观看舔阴道视频| 香蕉国产在线看| 久久精品夜夜夜夜夜久久蜜豆 | 色婷婷久久久亚洲欧美| 国产精品美女特级片免费视频播放器 | 久久 成人 亚洲| 最近最新免费中文字幕在线| 国产亚洲精品第一综合不卡| 一级毛片女人18水好多| 亚洲五月天丁香| 午夜免费成人在线视频| 国产成人av激情在线播放| cao死你这个sao货| 精品人妻1区二区| 黑人欧美特级aaaaaa片| 51午夜福利影视在线观看| 91字幕亚洲| 两个人看的免费小视频| 久久久久久久精品吃奶| av中文乱码字幕在线| 久久青草综合色|