長春西汀減輕腦出血大鼠腦組織的炎癥損傷*

孫建平， 李付平， 徐昭娟△， 白建英， 楊江霞， 張秀芬， 李翠輕， 趙 冬

(1河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院神經(jīng)外科， 河北 石家莊 050000； 河北中醫(yī)學(xué)院 2護(hù)理學(xué)院， 3實驗中心， 4基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院， 5教務(wù)處， 河北 石家莊 050028)

長春西汀減輕腦出血大鼠腦組織的炎癥損傷*

孫建平1， 李付平2， 徐昭娟2△， 白建英2， 楊江霞3， 張秀芬2， 李翠輕4， 趙 冬5

(1河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院神經(jīng)外科， 河北 石家莊 050000； 河北中醫(yī)學(xué)院2護(hù)理學(xué)院，3實驗中心，4基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，5教務(wù)處， 河北 石家莊 050028)

目的探討長春西汀對腦出血大鼠的干預(yù)作用以及對炎癥損傷的影響。方法將大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、腦出血組以及長春西汀低劑量組、中劑量組和高劑量組。除假手術(shù)組外，其余大鼠均通過注射VII型膠原酶的方法建立腦出血模型，長春西汀低劑量組、中劑量組和高劑量組分別給予腹腔注射0.5、1.0和1.5 mg/kg長春西汀，每天1次，共給藥7 d。給藥完成后，對各組大鼠進(jìn)行神經(jīng)功能缺損評分，稱重法計算腦組織的含水量，檢測腦組織中髓過氧化物酶(MPO)活性，Western blot法檢測腦組織中Toll樣受體4(TLR4)、核因子κB(NF-κB)、細(xì)胞間黏附分子1(ICAM-1)與血管細(xì)胞黏附分子1(VCAM-1)的蛋白表達(dá)。結(jié)果與腦出血組相比，給予長春西汀干預(yù)的大鼠神經(jīng)功能缺損評分顯著下降(P<0.05)，腦組織含水量明顯下降(P<0.05)，MPO活性顯著降低(P<0.05)，腦組織中TLR4、NF-κB、ICAM-1與VCAM-1的蛋白表達(dá)顯著下降(P<0.05)。結(jié)論長春西汀對腦出血大鼠腦組織具有保護(hù)作用，可能是通過抑制TLR4誘導(dǎo)的NF-κB信號通路以及ICAM-1與VCAM-1的表達(dá)來抑制炎癥反應(yīng)。

長春西?。?腦出血； Toll樣受體4； 核因子κB； 黏附分子

急性腦出血(intracerebral hemorrhage，ICH)是指非外傷因素引起的腦實質(zhì)內(nèi)血管破裂的出血，由于病情發(fā)生急驟，可出現(xiàn)在腦實質(zhì)的任何部位，因此發(fā)病率和死亡率都非常高。我國中老年人的發(fā)病率占全部腦血管疾病的20%～40%，隨著近年來人們飲食結(jié)構(gòu)的改變及生活節(jié)奏的加快，急性腦出血的發(fā)病人群趨向年輕化，導(dǎo)致發(fā)病率越來越高[1]。

長春西汀(vinpocetine，Vin)別名阿樸長春胺酸乙酯，臨床上主要用于治療缺血性中風(fēng)和其它由腦血管病變引起的疾病[2]。在歐洲與日本，長春西汀一直用來治療腦梗死所致的腦損傷[3]。國內(nèi)學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，長春西汀對大鼠腦缺血再灌注的炎癥反應(yīng)有顯著的抑制作用，可能是通過降低核因子κB(nuclear factor-κB，NF-κB)和腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)的表達(dá)發(fā)揮作用[4]。因此，推測長春西汀有可能在抗癥作用領(lǐng)域發(fā)揮作用，我們觀察長春西汀對腦出血大鼠模型腦組織炎癥反應(yīng)的作用，并對其可能的作用機(jī)制進(jìn)行討論。

材 料 和 方 法

1 實驗動物

健康雄性SD大鼠75只，購自河南省動物中心[許可證號:SYXK(豫)2013-0006]，SPF級，體質(zhì)量220～260 g，飼養(yǎng)于恒溫恒濕環(huán)境中，自由飲水進(jìn)食，晝夜各12 h，適應(yīng)性飼養(yǎng) 1 周。

2 實驗試劑

長春西汀注射液購自河南潤弘制藥股份有限公司；髓過氧化物酶(myeloperoxidase，MPO)活性測定試劑盒購自Sigma-Aldrich；抗NF-κB、細(xì)胞間黏附分子1(intercellular cell adhesion molecule-1，ICAM-1)與血管細(xì)胞黏附分子1(vascular cell adhesion molecule-1，VCAM-1)抗體購自Santa Cruz；抗Toll樣受體4(Toll-like receptors 4，TLR4)與β-actin抗體購自碧云天技術(shù)公司。

3 方法

3.1實驗分組 按隨機(jī)數(shù)字法將大鼠分為5組，每組15只，分別為假手術(shù)(sham)組、腦出血(ICH)組以及Vin低劑量(Vin-L)組、中劑量(Vin-M)組和高劑量(Vin-H)組。建立腦出血大鼠模型后，Vin 低劑量組、中劑量組和高劑量組分別給予腹腔注射長春西汀0.5、1.0和1.5 mg/kg，每天1次，共給藥7 d，假手術(shù)組與腦出血組分別給予等量生理鹽水灌胃，每天1次，共給予7 d。

3.2腦出血大鼠模型建立 所有大鼠術(shù)前12 h禁食，6 h禁水，腹腔注射1%氯胺酮(30 mg/kg)進(jìn)行麻醉，俯臥固定在立體定位儀上，使大鼠前囟點與人字點在同一水平面，暴露顱骨，以前囟為原點，往后0.2 mm，左3 mm為穿刺點，牙科鉆垂直鉆穿顱骨，用微量進(jìn)樣針吸取2.5 μL VII型膠原酶，從鉆孔點進(jìn)針，深度約為6 mm，緩慢注入，注射完成后，留針約5 min，推針，縫合。假手術(shù)組除不注射VII型膠原酶，其它操作同上。

3.3神經(jīng)功能缺損評分(neurological deficit score, NDS) 建模成功并予給藥處理的各組大鼠的神經(jīng)功能缺損評分標(biāo)準(zhǔn)參照Longa等[5]的方法，分為5級：正?；顒?，無神經(jīng)功能缺損記0分；癱瘓側(cè)前肢不能充分伸展記1分；大鼠有向癱瘓側(cè)旋轉(zhuǎn)的行為記2分；向癱瘓側(cè)傾倒記3分；無法自發(fā)行走，意識喪失記4分。對麻醉清醒后的大鼠進(jìn)行神經(jīng)功能評分，1～3分為造模成功，0、4分為造模不成功。

3.4腦含水量的測定 給藥結(jié)束后，過量麻醉處死大鼠，迅速取出新鮮大腦組織，去除嗅球、小腦、腦干和軟腦膜后，稱量濕重，在90 ℃烤箱烘烤至恒重，稱量干重，計算腦組織腦含水量(brain water content，BWC)，BWC(%)=(濕重-干重)/濕重×100%。

3.5MPO活性的測定 給藥結(jié)束后，迅速取出大鼠血腫周圍腦組織，勻漿，取上清液，采用MPO試劑盒，按照說明書要求，于25 ℃在分光光度計460 nm波長處測定MPO活性，活性單位是U/g，即每分鐘降解1 μmol時所需要過氧化物的量。

3.6Western blot檢測相關(guān)蛋白的表達(dá) 給藥結(jié)束后，處死大鼠，剪取大鼠血腫周圍腦組織，加入裂解液在冰上進(jìn)行裂解30 min，12 000 r/min、4 ℃離心5 min，收集細(xì)胞，提取細(xì)胞總蛋白并定量，調(diào)整蛋白量。取等量裂解產(chǎn)物，上樣，進(jìn)行12% SDS-PAGE。轉(zhuǎn)膜后，加入5%脫脂奶粉室溫孵育1 h，將膜于 I 抗中4 ℃孵育過夜，TBST洗膜3次，每次5 min，再加入相對應(yīng) II 抗，37 ℃孵育2 h，TBST洗膜3次，每次5 min。ECL化學(xué)發(fā)光法顯色，運(yùn)用ImageJ圖像分析系統(tǒng)對每個條帶進(jìn)行灰度分析。

4 統(tǒng)計學(xué)處理

所有實驗數(shù)據(jù)均采用SPSS 15.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析。計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，組內(nèi)數(shù)據(jù)采用單因素方差分析，兩組間數(shù)據(jù)采用Benferroni校正的t檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 各組大鼠神經(jīng)功能缺損評分

造模完成后，腦出血組有一只大鼠死亡，其余各組大鼠均未出現(xiàn)死亡。腦出血組及各給藥組大鼠的神經(jīng)功能缺損評分均顯著高于假手術(shù)組(P<0.05)；給藥完成后，與ICH組比較，給予長春西汀的大鼠的神經(jīng)功能缺損評分降低，但并未到達(dá)假手術(shù)組的水平(P<0.05)，見表1。

2 各組大鼠腦含水量的變化

腦出血組大鼠的腦含水量顯著高于假手術(shù)組(P<0.05)；給藥后，給予長春西汀的大鼠的腦含水量明顯低于腦出血組大鼠(P<0.05)，并隨藥物劑量增大而腦含水量逐漸下降，見表2。

表1 神經(jīng)功能缺損評分表

*P<0.05vssham group;#P<0.05vsICH group.

表2各組大鼠腦含水量的變化

Table 2. The changes of brain water content for each group (Mean±SD.n=10)

Group0d7d14dSham76.65±0.6475.34±0.4375.34±0.43ICH82.54±0.89*82.34±0.83*81.34±0.94*Vin-L80.99±0.98*79.39±0.68*#79.68±0.57*#Vin-M81.57±0.83*78.24±0.77*#78.98±0.48*#Vin-H81.08±0.92*77.86±0.61*#77.21±0.59*#

*P<0.05vssham group;#P<0.05vsICH group.

3 各組大鼠腦組織中MPO活性

腦出血組與Vin給藥組大鼠腦組織中的MPO活性在造模3 d時達(dá)到峰值，之后隨時間而下降；其中給予長春西汀的大鼠腦組織中MPO活性顯著低于腦出血組，并隨藥物劑量增大，而MPO活性降低(P<0.05)，見表3。

表3各組大鼠腦組織MPO活性變化

Table 3. The change of MPO activity in brain tissue for each group (Mean±SD.n=10)

Group0d7d14dSham0.28±0.030.29±0.040.31±0.03ICH3.58±0.28*4.05±0.37*3.89±0.35*Vin-L3.52±0.31*3.87±0.31*#3.15±0.27*#Vin-M3.64±0.33*3.77±0.38*#2.87±0.25*#Vin-H3.56±0.29*3.64±0.32*#2.33±0.24*#

*P<0.05vssham group;#P<0.05vsICH group.

4 各組大鼠血腫周圍腦組織中TLR4與NF-κB的蛋白表達(dá)水平

腦出血組血腫周圍腦組織中TLR4與NF-κB的蛋白表達(dá)顯著高于假手術(shù)組(P<0.05)；給予長春西汀后，大鼠血腫周圍腦組織TLR4與NF-κB的蛋白表達(dá)明顯低于腦出血組，并隨藥物劑量增大有下降的趨勢(P<0.05)，見圖1。

Figure 1. The protein expression of TLR4 and NF-κB in the brain tissue around hematoma. Mean±SD.n=6.*P<0.05vssham group;#P<0.05vsICH group.

圖1各組大鼠血腫周圍腦組織中TLR4與NF-κB的蛋白表達(dá)水平

5 各組大鼠血腫周圍腦組織中ICAM-1與VCAM-1的蛋白表達(dá)水平

腦出血組血腫周圍腦組織ICAM-1與VCAM-1的蛋白表達(dá)顯著高于假手術(shù)組；給予長春西汀后，大鼠血腫周圍腦組織ICAM-1與VCAM-1的蛋白表達(dá)明顯低于腦出血組，并隨藥物劑量增大有下降的趨勢(P<0.05)，見圖2。

討 論

MPO主要存在于中性粒細(xì)胞中，具有過氧化氫還原的作用，測定MPO的活性可以用來判斷中性粒細(xì)胞的數(shù)目。急性腦出血的早期會出現(xiàn)白細(xì)胞與中性粒細(xì)胞含量的升高，而研究表明白細(xì)胞與中性粒細(xì)胞計數(shù)的增高提示病情嚴(yán)重，預(yù)后差[6]。本實驗表明，急性腦出血大鼠腦組織中MPO的活性顯著上升，并隨時間延長而有所下降，同一時間段采用長春西汀后，大鼠腦組織中MPO明顯低于腦出血大鼠，提示長春西汀可能對于腦出血炎癥具有一定程度的抑制作用。

Figure 2. The protein expression of ICAM-1 and VCAM-1 in the brain tissue around hematoma. Mean±SD.n=6.*P<0.05vssham group;#P<0.05vsICH group.

圖2各組大鼠血腫周圍腦組織中ICAM-1與VCAM-1的蛋白表達(dá)水平

TLR4是TLRs家族重要成員之一，可特異性識別生物源性與非生物源性刺激，激活NF-κB，啟動炎癥反應(yīng)，并且在細(xì)胞分化、增殖和凋亡的過程中起非常重要的調(diào)節(jié)作用[7]。研究發(fā)現(xiàn)，TLR4介導(dǎo)的NF-κB信號途徑參與腦缺血再灌注后的炎癥反應(yīng)，加重神經(jīng)元損傷和凋亡，抑制TLR4的表達(dá)能夠緩解腦缺血再灌損傷的程度[8]。另有文獻(xiàn)表明，在腦出血后血腫周圍腦組織中存在炎癥反應(yīng)與細(xì)胞凋亡[9]。多項研究發(fā)現(xiàn)，在缺血缺氧以及葡萄球菌感染引起的腦損傷小鼠模型中，TLR4的表達(dá)在腦微血管比軟腦膜以及室管膜的表達(dá)顯著增強(qiáng)，從而得到TLR4在細(xì)菌感染以及非感染因素引起的腦損傷中具有一定程度的作用[10-11]。NF-κB信號通路是TLR4胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)到通路中最重要的下游通路。有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，在采用自體尾動脈血注入建立的大鼠腦出血模型中，血腫周圍的NF-κB表達(dá)升高，并與炎癥反應(yīng)的高峰一致[12]。本實驗結(jié)果表明，注射VII型膠原酶建立的大鼠模型血腫周圍腦組織的TLR4與NF-κB表達(dá)顯著上升，提示腦出血大鼠血腫周圍腦組織中可能存在有炎癥反應(yīng)，采用長春西汀給藥后，可能通過抑制TLR4的表達(dá)，從而抑制由TLR4誘導(dǎo)的NF-κB信號通路的活化，進(jìn)而抑制炎癥反應(yīng)。

ICAM-1是炎癥反應(yīng)中白細(xì)胞在黏附分子作用下發(fā)生黏附和浸潤的關(guān)鍵因子之一，它通過與淋巴細(xì)胞抗原的相互作用，從而介導(dǎo)白細(xì)胞的黏附和浸潤。VCAM-1可介導(dǎo)淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞與嗜酸性粒細(xì)胞黏附于血管內(nèi)皮表面，促進(jìn)白細(xì)胞向炎癥部分聚集，從而使血管內(nèi)皮細(xì)胞受損。實驗表明，長春西汀能夠降低腦組織中ICAM-1與VCAM-1的表達(dá)，推測長春西汀能夠降低腦出血腦組織中白細(xì)胞向炎癥部分的聚集，從而發(fā)揮抑制炎癥反應(yīng)的作用。

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Effects of vinpocetine on inflammation of brain in rats with intracerebral hemorrhage

SUN Jian-ping1， LI Fu-ping2, XU Zhao-juan2, BAI Jian-ying2, YANG Jiang-xia3, ZHANG Xiu-fen2, LI Cui-qing4, ZHAO Dong5

(1DepartmentofNeurosurgery，TheSecondHospitalofHebeiMedicalUniversity，Shijiazhuang050000，China；2SchoolofNursing，3ExperimentCenter，4SchoolofBasicMedicine，5OfficeofTeachingAffairs,HebeiUniversityofChineseMedicine,Shijiazhuang050028,China.E-mail:xuzhaojuanhbyd@163.com)

AIM: To investigate the effects of vinpocetine on inflammation of brain in intracerebral hemorrhage (ICH) rats and to explore the underlying mechanisms.METHODSAll rats were randomly divided into sham group, ICH group, ICH with low dose of vinpocetine treatment group, ICH with medium dose of vinpocetine treatment group, and ICH with high dose of vinpocetine treatment group. Except sham group， the rats in other groups were injected with type VII collagenase to establish ICH model, and then the rats in vinpocetine treatment groups were

vinpocetine at 0.5, 1.0 or 1.5 mg/kg by intraperitoneal injection once a day for 7 days. After corresponding treatment, the impairment of neurological function in the rats was scored and the water content of the brain tissues was measured. Moreover, the activity of myeloperoxidase (MPO) was determined by ELISA, and the protein expression of Toll-like receptors 4 (TLR4), nuclear factor-κB(NF-κB), intercellular cell adhesion molecule-1 (ICAM-1) and vascular cell adhesion molcule-1 (VCAM-1) in the brain tissues was determined by Western blot.RESULTSCompared with ICH group, vinpocetine treatment significantly decreased the scores of the impairment of neurological function and the water content of the brain tissues. Moreover, the activity of MPO and the protein expression of TLR4, NF-κB, ICAM-1 and VCAM-1 were also reduced after vinpocetine treatment (P<0.05).CONCLUSIONVinpocetine improves neurological function in ICH rats via suppression of inflammation by inhibiting NF-κB signaling and expression of ICAM-1 and VCAM-1.

Vinpocetine; Intracerebral hemorrhage; Toll-like receptors 4; Nuclear factor-κB; Adhesion molecules

1000- 4718(2017)12- 2139- 04

2017- 05- 08

2017- 08- 29

河北省醫(yī)學(xué)科學(xué)研究重點課題計劃項目(No.ZD20140110； No.ZD20150221)；河南潤弘制藥股份有限公司贊助的橫向項目

△通訊作者 Tel： 0311-89926000； E-mail： xuzhaojuanhbyd@163.com

R743.4； R965

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2017.12.005

(責(zé)任編輯： 陳妙玲， 羅 森)