芒柄花黃素對(duì)大鼠局部腦缺血再灌注損傷保護(hù)作用的初步研究

姜慈靜++++++吳秋慧++++++任倩瑤++++++王勇++++++陳健++++++盧慧玲

[摘要] 目的 探討芒柄花黃素對(duì)大鼠腦局部缺血再灌注損傷的神經(jīng)保護(hù)作用。 方法 采用隨機(jī)數(shù)字表法將42只SD雄性大鼠分為假手術(shù)組、缺血再灌注組和芒柄花黃素組，每組14只。芒柄花黃素組腹腔注射芒柄花黃素溶液20 mg/kg，假手術(shù)組和缺血再灌注組注射等劑量生理鹽水，連續(xù)7 d。線栓法復(fù)制大鼠大腦中動(dòng)脈缺血再灌注模型，缺血時(shí)間1.5 h。再灌注后24 h各組分別進(jìn)行神經(jīng)功能缺損測(cè)定；干/濕重法檢測(cè)腦水腫程度；2，3，5-氯化三苯基四氮唑（TTC）染色計(jì)算腦梗死體積并檢測(cè)血漿超氧化物歧化酶（SOD）活力、丙二醛（MDA）水平。 結(jié)果 與缺血再灌注組比較，芒柄花黃素組大鼠神經(jīng)功能缺損評(píng)分降低，第二腦片梗死體積和第三腦片水腫程度減輕，血漿SOD活性提高，MDA水平下降，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05或P < 0.01）。 結(jié)論 芒柄花黃素可改善大鼠腦缺血再灌注后神經(jīng)功能缺損程度，減小腦梗死體積，其機(jī)制可能與減低氧化應(yīng)激水平有關(guān)。

[關(guān)鍵詞] 芒柄花黃素；腦缺血再灌注損傷；植物雌激素；神經(jīng)功能缺損

[中圖分類號(hào)] R743 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-7210（2017）11（b）-0008-04

[Abstract] Objective To investigate the protective effect of formononetin on local cerebral ischemia-reperfusion injury in rats. Methods According to the random number table method， 42 male SD rats were divided into sham group， ischemia-reperfusion group and formononetin group， with 14 rats in each group. The formononetin group was given formononetin solution 20 mg/kg by intraperitoneal injection， the sham group and ischemia-reperfusion group were injected with same dose of normal saline， for 7 days. Suture-occluded method was used to copy the model of rats with cerebral ischemia-reperfusion injury in middle cerebral artery， the ischemic time was 1.5 h. After reperfusion for 24 h， the neurologic impairment of all groups was detected； the dry/wet method was used to detect the degree of cerebral edema； 2，3，5-tripheyltetrazolium （TTC） staining was used to calculate the volume of cerebral infarction and detect the activities of plasma superoxide dismutase （SOD） and the levels of malondialdehyde （MDA）. Results Compared with ischemia-reperfusion group， the score of neurologic impairment in formononetin group was decreased， the volume of cerebral infarction of the second brain slice and the degree of cerebral edema of the third brain slice were reduced， the activities of plasma SOD were increased， and the levels of MDA were declined， the differences were all statistically significant （P < 0.05 or P < 0.01）. Conclusion Formononetin can improve the degree of neurologic impairment， reduce the volume of cerebral infarction， the mechanism may be related to the decrease of oxidative stress.

[Key words] Formononetin； Cerebral ischemia-reperfusion injury； Phytoestrogen； Neurologic impairment

雌激素對(duì)腦缺血再灌注損傷有保護(hù)作用，但雌激素替代治療可能增加乳腺癌和子宮癌的發(fā)病率，這使雌激素的應(yīng)用受到爭(zhēng)議[1-2]。植物雌激素被認(rèn)為性質(zhì)更為溫和，副作用小于雌激素。芒柄花黃素（formononetin）是黃芪、雞血藤、紅三葉草等多種中藥的有效成分之一，其異黃酮結(jié)構(gòu)具有植物雌激素（phytoestrogen）作用。本研究通過線栓法復(fù)制大鼠局部腦缺血再灌注模型，探討芒柄花黃素是否能夠降低大鼠神經(jīng)損傷和腦梗死程度，起到神經(jīng)保護(hù)作用。

1 材料與方法endprint

1.1 材料

芒柄花黃素（純度>98%）購(gòu)自Phytomaker有限公司，200 mmol/L溶于DMSO，保存在4℃環(huán)境維持性狀穩(wěn)定。作用于動(dòng)物終濃度<0.5%。超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）及相關(guān)試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所。線栓購(gòu)自廣州佳靈生物技術(shù)有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組與給藥

SPF級(jí)雄性SD大鼠，3月齡，重量250～280 g，由桂林醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供（合格證號(hào)SCXK桂2003-0001），20～24℃恒溫飼養(yǎng)。采用隨機(jī)數(shù)字表法將大鼠分為假手術(shù)組、缺血再灌注組和芒柄花黃素組，每組14只。芒柄花黃素組大鼠腹腔注射芒柄花黃素溶液，用量20 mg/kg，假手術(shù)組和缺血再灌注組注射同等劑量生理鹽水，連續(xù)7 d。

1.3 動(dòng)物模型制備

大鼠術(shù)前禁食、不禁水12 h，7.5%水合氯醛麻醉。采用線栓法制備大鼠左側(cè)大腦中動(dòng)脈阻塞模型。小心分離左側(cè)頸總動(dòng)脈、頸外動(dòng)脈、頸內(nèi)動(dòng)脈。結(jié)扎頸外動(dòng)脈及頸總動(dòng)脈近心端。線栓從頸總動(dòng)脈進(jìn)入頸內(nèi)動(dòng)脈，其起始端距離頸動(dòng)脈分叉處18～20 mm，阻塞大腦中動(dòng)脈血流。缺血1.5 h后，拔出線栓恢復(fù)血流，即復(fù)制缺血再灌注組模型。芒柄花黃素組模型與缺血再灌注組相同，假手術(shù)組僅分離頸部血管，未插入線栓。

1.4 神經(jīng)功能缺損評(píng)分和大鼠篩選

再灌注后24 h進(jìn)行神經(jīng)功能缺損評(píng)分。評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)[3]如下：0分，無(wú)神經(jīng)功能缺損癥狀；1分，提尾不能完全伸展對(duì)側(cè)前爪；2分，行走時(shí)向癱瘓側(cè)轉(zhuǎn)圈；3分，向癱瘓側(cè)傾倒；4分，意識(shí)喪失。本實(shí)驗(yàn)只選取評(píng)分在1～2分的大鼠進(jìn)行進(jìn)一步操作，同時(shí)剔除腦底部有出血或明顯血栓的大鼠，補(bǔ)足動(dòng)物直到達(dá)到實(shí)驗(yàn)所需數(shù)量。

1.5 2，3，5-氯化三苯基四氮唑（TTC）染色

評(píng)分后處死大鼠取腦。腦組織快速冷凍約20 min，從額極向后連續(xù)取5個(gè)冠狀腦片，切片厚度約2 mm。病變部位主要集中在第二、第三腦片。取第二腦片置于1% TTC染色液中37℃避光水浴30 min，正常腦組織的琥珀酸脫氫酶與TTC反應(yīng)而呈紅色，梗死區(qū)域因脫氫酶活性下降不反應(yīng)而呈白色。使用圖片處理系統(tǒng)Image J測(cè)量腦梗死區(qū)上下面積（S1、S2），并計(jì)算腦梗死體積。

1.6 腦組織含水量測(cè)定

取第三腦片在電子天平上稱重（濕重），然后置于80℃烘箱烘干至恒重，再次稱重（干重），腦組織含水量（%）=（腦組織濕重-腦組織干重）/腦組織濕重×100%。

1.7 抗氧化指標(biāo)檢測(cè)

再灌注24 h后麻醉后心臟取血，靜置20 min，離心半徑8 cm，3500 r/min，離心10 min分離出血清。WST-1法檢測(cè)血漿超氧化物歧化酶（SOD）活力，TBA法檢測(cè)丙二醛（MDA）含量。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 15.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，多組比較采用方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，以P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 芒柄花黃素對(duì)大鼠神經(jīng)功能、腦梗死體積和腦含水量的影響

缺血再灌注組和芒柄花黃素組大鼠TTC染色顯示不同程度白色梗死區(qū)，假手術(shù)組未見梗死，TTC染色為紅色（圖1）。與缺血再灌注組比較，芒柄花黃素組大鼠再灌注24 h神經(jīng)功能評(píng)分降低（P < 0.05），第二腦片梗死體積減少（P < 0.01），第三腦片含水量降低（P < 0.05）。見表1。

2.2 芒柄花黃素對(duì)大鼠血漿氧化應(yīng)激指標(biāo)的影響

芒柄花黃素組血漿SOD活力高于缺血再灌注組，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.01）。缺血再灌注組、芒柄花黃素組大鼠血漿MDA水平均高于假手術(shù)組（P < 0.01），芒柄花黃素組血漿MDA水平低于缺血再灌注組，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.01）。見表2。

3 討論

芒柄花黃素基本結(jié)構(gòu)為7-羥基-4'-甲氧基異黃酮，屬于黃酮類植物雌激素，與其同類的包括大豆異黃酮、染料木黃酮、毛蕊異黃酮等[4]。芒柄花黃素具有類似雌激素的多種生物活性，如抑制食源性肥胖和骨質(zhì)疏松[5]、作為聯(lián)合用藥治療貧血[6]、抑制炎性反應(yīng)[7-8]等等，同時(shí)有誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡[9]、抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)[10]等作用，也能夠通過上調(diào)eNOS改善動(dòng)脈內(nèi)皮功能[11]。

本研究探索芒柄花黃素是否具有局部腦缺血保護(hù)作用。24 h神經(jīng)功能評(píng)分顯示芒柄花黃素組神經(jīng)功能缺損情況比缺血再灌注組減輕（P < 0.05），實(shí)驗(yàn)結(jié)果與毛蕊異黃酮對(duì)大鼠神經(jīng)功能改善結(jié)果相似[12]，毛蕊異黃酮在化學(xué)結(jié)構(gòu)與芒柄花黃素僅相差在B環(huán)多了一個(gè)羥基，又被稱為3′-羥基芒柄花黃素，中高劑量的毛蕊異黃酮灌胃能夠降低大鼠缺血2 h再灌注24 h的18分制神經(jīng)功能評(píng)分。另有資料顯示，大豆異黃酮能夠改善記憶障礙大鼠14 d后的水迷宮學(xué)習(xí)記憶能力[13]。鷹嘴豆異黃酮可以改善半乳糖導(dǎo)致的小鼠衰老模型學(xué)習(xí)記憶能力[14]。芒柄花黃素體外實(shí)驗(yàn)也顯示[15]，芒柄花黃素預(yù)處理（10 μmol/L）12 h顯著減少N-甲基-D-天冬氨酸暴露引起的皮質(zhì)神經(jīng)元細(xì)胞損失，特別是早期細(xì)胞凋亡。本研究使用TTC染色法檢測(cè)第二腦片腦梗死情況，結(jié)果顯示，與缺血再灌注組比較，腦梗死體積芒柄花黃素組有明顯降低，第三腦片腦水腫程度芒柄花黃素組也比缺血再灌注組減輕。不同腦缺血模型資料顯示[16-17]，使用芒柄花黃素灌胃或飲食攝取可以減輕全腦或局部腦缺血的梗死程度和水腫情況。侯進(jìn)義等[18]對(duì)去勢(shì)雌性大鼠進(jìn)行雌激素預(yù)處理，發(fā)現(xiàn)可以減輕腦水腫和血腦屏障通透性，該論文認(rèn)為雌激素上調(diào)相關(guān)蛋白表達(dá)有關(guān)。從以上資料來(lái)看，芒柄花黃素的神經(jīng)保護(hù)作用可能是其植物雌激素效應(yīng)的一部分。endprint

在體外實(shí)驗(yàn)中，芒柄花黃素被認(rèn)為具有抗氧化功能。一項(xiàng)關(guān)于黃芪異黃酮提取物（包括芒柄花黃素、芒柄花苷、毛蕊異黃酮等）對(duì)PC12細(xì)胞的氧化保護(hù)實(shí)驗(yàn)研究顯示[19]，芒柄花黃素防止SOD和谷胱甘肽過氧化物酶（GSH）活性的降低，并且阻止GSH的大量丟失。芒柄花黃素對(duì)鄰苯三酚氧產(chǎn)生的超氧陰離子和由鄰二氮菲-Fe2+/H2O2體系產(chǎn)生的羥自由基也有抑制和清除的作用[20]。本研究中芒柄花黃素組大鼠血漿MDA水平減低，SOD活性增高，提示芒柄花黃素能夠增強(qiáng)腦缺血大鼠抗氧化水平，減輕氧化應(yīng)激損傷，這與芒柄花黃素減少大鼠腦梗死體積、改善神經(jīng)功能評(píng)分和腦水腫程度相一致。芒柄花黃素作為一種來(lái)源廣泛的植物活性藥物，對(duì)大鼠腦缺血的保護(hù)作用將為腦缺血性疾病的預(yù)防和治療提供新的方向，但其上下游具體發(fā)生機(jī)制尚需進(jìn)一步探索。

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