HPLC法同時(shí)測定大黃-黃連藥材中5種蒽醌類成分的含量及最優(yōu)配伍研究

王有森，王智亮（濰坊市人民醫(yī)院藥劑科，山東濰坊261599）

HPLC法同時(shí)測定大黃-黃連藥材中5種蒽醌類成分的含量及最優(yōu)配伍研究

王有森＊，王智亮（濰坊市人民醫(yī)院藥劑科，山東濰坊261599）

目的：建立同時(shí)測定大黃-黃連藥材中5種蒽醌類成分含量的方法，并優(yōu)選大黃-黃連藥材質(zhì)量比。方法：采用高效液相色譜法。色譜柱為Zorbax SB-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm），流動(dòng)相為乙腈-0.05 mol/L磷酸二氫鉀（48∶52，V/V，每100 mL中加十二烷基硫酸鈉0.4 g，磷酸調(diào)節(jié)pH至4.0），流速為1 mL/min，檢測波長為254 nm，柱溫為25℃，進(jìn)樣量為10 μL。考察大黃-黃連藥材質(zhì)量比為1∶1、1∶2、2∶1、2∶3、3∶2時(shí)配伍藥材中蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚的含量。結(jié)果：蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚進(jìn)樣量分別在0.652～3.081、0.704～3.422、1.280～6.197、0.633～0.324、1.326～5.954 μg范圍內(nèi)與各自峰面積積分值呈良好線性關(guān)系（r≥0.999 7），精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性試驗(yàn)的RSD均小于2.0%（n＝6），平均加樣回收率為98.92%～100.37%（RSD≤2.26%，n＝6）。大黃-黃連藥材質(zhì)量比為2∶1時(shí)，5種蒽醌類成分總量最高。結(jié)論：本方法精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性良好，可用于不同配伍比大黃-黃連藥材的質(zhì)量檢定；大黃-黃連藥材的最佳質(zhì)量比為2∶1。

大黃；黃連；配伍；蒽醌類成分；高效液相色譜法

大黃黃連瀉心湯源自張仲景的《傷寒雜病論》，注有“心下痞，按之濡，其脈關(guān)上浮者，大黃黃連瀉心湯主之”[1]。現(xiàn)代藥理研究表明，大黃黃連瀉心湯具有調(diào)血脂、抗菌、增強(qiáng)機(jī)體免疫功能、抗消化性潰瘍等作用[2-4]。該方由大黃2兩、黃連1兩合煎而成，即大黃-黃連藥材的質(zhì)量比為2∶1，但這是否是其有效成分的最佳比例尚不得而知。因此，筆者以高效液相色譜（HPLC）法測定大黃-黃連藥材不同配伍下蒽醌類成分（蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚）的含量[5-7]，以多種成分指標(biāo)綜合評(píng)價(jià)大黃黃連瀉心湯加減方，為其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的控制提供參考。

1 材料

1.1 儀器

1100型HPLC儀，包括二極管陣列檢測器（美國Agilent公司）；KQ-500GVDV型超聲清洗儀（昆山超聲儀器有限公司）；BS224S型分析天平（德國Satorius公司）；MF10型粉碎機(jī)（德國IKA公司）。

1.2 藥材與試劑

大黃、黃連藥材購自安徽亳州，經(jīng)濰坊市人民醫(yī)院藥劑科王智亮主管藥師鑒定，均符合2015年《中國藥典》（一部）相關(guān)規(guī)定。蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚對(duì)照品（中國食品藥品檢定研究院，批號(hào)：110795-201305、110757-201302、110756-201210、110796-201101、110758-201206，純度：＞98%）；甲醇為色譜純，其他試劑為分析純，水為純化水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Zorbax SB-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：乙腈-0.05 mol/L磷酸二氫鉀（48∶52，V/V，每100 mL中加十二烷基硫酸鈉0.4 g，磷酸調(diào)節(jié)pH至4.0）；流速：1 mL/min；檢測波長：254 nm；柱溫：25℃；進(jìn)樣量：10 μL[8-10]。

2.2 溶液的制備

2.2.1 供試品溶液的制備按“2.9”項(xiàng)下質(zhì)量比稱取大黃-黃連藥材共約0.2 g，精密稱定，加入甲醇20 mL，稱定質(zhì)量，超聲（功率：250 W，頻率：40 kHz，下同）40 min，放冷，再稱定質(zhì)量，用甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，即得供試品溶液。

2.2.2 混合對(duì)照品溶液的制備取減壓干燥至恒質(zhì)量的蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚對(duì)照品適量，以甲醇溶解，超聲20 min，制得蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚質(zhì)量濃度分別為0.124 8、0.135 2、0.250 7、0.126 7、0.264 5 mg/mL的混合對(duì)照品溶液。

2.3 專屬性試驗(yàn)

取供試品溶液、混合對(duì)照品溶液各10 μL，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄色譜圖。結(jié)果，蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚出峰處未見其他干擾峰；蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚分離度大于2，且以蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚峰理論板數(shù)計(jì)大于4 000。色譜圖見圖1。

圖1 高效液相色譜圖Fig 1HPLC chromatograms

2.4 線性關(guān)系考察

取混合對(duì)照品溶液5、10、15、20、25 μL，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定。以蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)（x，μg）、峰面積積分值為縱坐標(biāo)（y）進(jìn)行線性回歸分析，得回歸方程、線性范圍見表1。

表1 回歸方程與線性范圍Tab 1Regression equation and linear range

由表1可知，蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚在各自進(jìn)樣量范圍內(nèi)與峰面積積分值呈良好的線性關(guān)系。

2.5 精密度試驗(yàn)

量取混合對(duì)照品溶液10μL，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定6次。結(jié)果，蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚峰面積的RSD分別為1.24%、0.86%、0.73%、1.09%、0.86%（n＝6），表明本試驗(yàn)精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取供試品溶液，于室溫下放置0、2、4、6、8、10 h時(shí)，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定6次。結(jié)果，蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚峰面積的RSD分別為0.98%、0.85%、1.32%、1.16%、0.92%（n＝6），表明供試品溶液在室溫下放置10 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.7 重復(fù)性試驗(yàn)

取大黃、黃連適量，按“2.2.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定6次。結(jié)果，蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚含量的RSD分別為1.48%、1.86%、1.25%、1.19%、1.07%（n＝6），表明本試驗(yàn)重復(fù)性良好。

2.8 加樣回收率試驗(yàn)

取已知含量的大黃-黃連樣品（質(zhì)量比為2∶1），共6份，加入蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚對(duì)照品溶液（0.124 8、0.135 2、0.250 7、0.126 7、0.264 5 mg/mL）適量，按“2.2.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，計(jì)算加樣回收率，結(jié)果見表2。

2.9 樣品中蒽醌類成分的含量測定

制備大黃-黃連藥材質(zhì)量比分別為1∶1、1∶2、2∶1、2∶3、3∶2的樣品，按“2.2.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定蒽醌類成分的含量，結(jié)果見表3。

3 討論

大黃、黃連二藥，味苦性寒、直折火勢，是治療各種火證的主藥。黃連解毒湯、大黃湯、梔子金花湯、三補(bǔ)丸、大金花丸、清心丸、既濟(jì)解毒湯、人中黃丸、當(dāng)歸龍薈丸等瀉火之劑，其實(shí)都是在大黃黃連瀉心湯基礎(chǔ)上，據(jù)證加減而成?！督饏T要略》中提到大黃瀉心湯可“急瀉三陽實(shí)火”，大黃中蒽醌類成分的作用就是泄下[11]，黃連中生物堿作用為抑菌[12-13]，因此本文考察重點(diǎn)為蒽醌類成分。

表2 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（n＝6）Tab 2Results of recovery test（n＝6）

表3 含量測定結(jié)果（n＝3，mg/g）Tab 3Result of content determination（n＝3，mg/g）

供試品溶液的制備中比較了超聲和回流提取法，結(jié)果超聲提取效果明顯且操作簡單、方便，用時(shí)較短，故采用超聲提取法。超聲提取法是采用超聲波輔助溶劑進(jìn)行提取，通過破壞植物藥材的細(xì)胞，使溶劑滲透到藥材細(xì)胞中，可縮短提取時(shí)間、提高提取率，多用于小型生產(chǎn)或?qū)嶒?yàn)。超聲提取與藥材實(shí)際運(yùn)用中的煎煮提取都是屬于物理提取，但超聲提取較煎煮提取藥材有效成分含量多，由于各指標(biāo)成分在超聲或煎煮中提取條件一致，因此各成分含量比例一致[14-16]。筆者為了讓各藥對(duì)中各指標(biāo)成分在短時(shí)間內(nèi)含量結(jié)果差異更明顯，因此采用超聲提取法，這也是試驗(yàn)中采取的通用方法。筆者在預(yù)試驗(yàn)中考察了不同超聲時(shí)間下，不同百分比甲醇、乙醇的超聲效果，結(jié)果表明各指標(biāo)成分在甲醇中超聲40 min提取率較高。

2015年版《中國藥典》（一部）中大黃和三黃片等含大黃的制劑中蒽醌類成分含量測定檢測波長均為254 nm[17]，實(shí)驗(yàn)對(duì)5種成分進(jìn)行200～400 nm全波長掃描，測得最大吸收峰均為（250±5）nm，因此選擇檢測波長為254 nm。

由含量測定結(jié)果可知，當(dāng)大黃-黃連藥材質(zhì)量比為1∶1時(shí)，蒽醌類成分含量最低；隨著黃連的比例降低，蒽醌類成分逐漸增加。這可能是由于大黃-黃連配伍時(shí)，黃連主要成分生物堿與酸性的蒽醌類發(fā)生沉淀作用，使得大黃蒽醌類成分減少。由于該方中大黃和黃連均為主要組成，因此不宜過多減少黃連比例，故本試驗(yàn)未考察大黃-黃連質(zhì)量比超過3∶1的配比[18-20]。

綜上所述，本方法操作簡便，可用于大黃-黃連不同配伍下蒽醌類成分的含量測定。在一定范圍內(nèi)，適當(dāng)增加大黃配比，可增加蒽醌類成分含量。

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Simultaneous Content Determination of 5 Anthraquinones of Rhei Radix-coptidis Rhizoma by HPLC and Study on the Optimal Compatibility

WANG Yousen，WANG Zhiliang（Dept.of Pharmacy，Weifang People’s Hospital，Shandong Weifang 261599，China）

OBJECTIVE：To establish a method for the simultaneous content determination 5 anthraquinones of rhei radix-coptidis rhizoma，and optimize its best mass ratio.METHODS：HPLC was performed on the column of Zorbax SB-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）with mobile phase of acetonitrile-0.05 mol/L potassium dihydrogen phosphate（48∶52，V/V，adding sodium dodecyl sulfate 0.4 g per 100 mL，pH value was adjusted to 4.0）；detection wavelength was 254 nm；flow rate was 1 mL/min；column temperature was 25℃；and injection volume was 10 μL.When mass ratio of rhei radix-coptidis rhizoma was 1∶1，1∶2，2∶1，2∶3，3∶2，the contents of aloe emodin，rhein，emodin，chrysophanol and emodin ether were investigated.RESULTS：The aloe emodin，rhein，emodin，chrysophanol and emodin ether showed good linear relationship with peak area in the range of 0.652-3.081，0.704-3.422，1.280-6.197，0.633-0.324，1.326-5.954 μg（r≥0.999 7）；RSDs of precision，stability，reproducibility tests were lower than 2.0%（n＝6）；and average recovery was 98.92%-100.37%（RSD≤2.26%，n＝6）.When mass ratio was 2∶1，the total contents of 5 ingredients were the highest.CONCLUSIONS：The method has good precision，stability，reproducibility，and can be used for the quality verification of rhei radix-coptidis rhizoma under different compatibilities.The best mass ratio of rhei radixcoptidis rhizoma is 2∶1.

Rhei radix；Coptidis rhizoma；Compatibility；Anthraquinones；HPLC

R943.1

A

1001-0408（2017）34-4818-04

DOI10.6039/j.issn.1001-0408.2017.34.17

＊主任藥師。研究方向：醫(yī)院藥學(xué)。電話：0536-8234981。E-mail：wfwys666@163.com

2017-08-22

2017-10-07）

（編輯：劉明偉）