不同劑量丙泊酚對肝缺血再灌注心肌能量代謝的影響

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不同劑量丙泊酚對肝缺血再灌注心肌能量代謝的影響

寧俊平，高敏，龐曉紅

目的探討不同劑量丙泊酚對肝缺血再灌注時心肌能量代謝的影響。方法選取健康清潔級雄性SD大鼠60只，隨機(jī)分為丙泊酚高劑量組(高劑量組)、丙泊酚低劑量組(低劑量組)、模型組、對照組，各15只。高劑量組：造模前大鼠股靜脈注射丙泊酚60 mg/(kg·h)；低劑量組：造模前大鼠股靜脈注射丙泊酚20 mg/(kg·h)；對照組和模型組：造模前股靜脈注射生理鹽水3 mL/(kg·h)。麻醉后暴露肝區(qū)，對照組僅分離肝門。其余3組動脈鉗鉗夾肝蒂30 min后松開(灌注)2 h，造模完成。黃嘌呤氧化酶法檢測超氧化物歧化酶(SOD)，采用硫代巴比妥酸比色法檢測丙二醛(MDA)含量；化學(xué)比色法分別檢測Na+-K+-ATP酶和Ca2+-Mg2+-ATP酶；采用Lanir法檢測心肌組織內(nèi)ATP、ADP、AMP含量，計算心肌能量(EC)值；HE染色。結(jié)果模型組SOD明顯低于其他3組，MDA明顯高于其他3組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，說明造模成功。低劑量組SOD明顯高于高劑量組，MDA明顯低于高劑量組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。低劑量組ATP、ADP、EC明顯高于高劑量組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。HE染色低劑量組的細(xì)胞形態(tài)比高劑量組和模型組清晰，心肌肌束斷裂較少，細(xì)胞核部分清晰，少量紅細(xì)胞滲出和炎性細(xì)胞浸潤。結(jié)論肝缺血再灌注時心肌組織發(fā)生過氧化反應(yīng)，心肌細(xì)胞能量代謝障礙，低劑量丙泊酚能夠減少心肌組織能量代謝障礙，增加ATP含量，提高Na+-K+-ATP酶和Ca2+-Mg2+-ATP酶的活性，增加心肌組織的能量代謝。

肝缺血再灌注；心肌能量代謝；丙泊酚；氧化物歧化酶；丙二醛

肝缺血再灌注是指肝臟缺血缺氧短暫時間后恢復(fù)肝臟血流，常引起再灌注損傷，已有研究表明[1-2]，肝缺血再灌注可能導(dǎo)致循環(huán)衰竭、呼吸衰竭、腎功能不全等，其中心肌損傷是最多見的，發(fā)生機(jī)制很復(fù)雜：氧自由基增多、心肌線粒體代謝障礙、心肌信號傳導(dǎo)異常等[3-4]。丙泊酚是一種短效的麻醉藥，常用于臨床手術(shù)中，具有抗氧化應(yīng)激、保護(hù)組織缺血再灌注損傷的作用[5-6]。目前更多的是研究肝缺血再灌注對肝臟的損傷，而保護(hù)心肌的研究較少。本實驗通過觀察肝缺血再灌注時心肌組織內(nèi)過氧化反應(yīng)和心肌能量代謝，探討不同劑量丙泊酚對心肌組織能量代謝的保護(hù)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動物及分組 選取中國醫(yī)科大學(xué)動物部的健康清潔級雄性SD大鼠60只，體重350 g～380 g，隨機(jī)分為丙泊酚高劑量組(高劑量組)、丙泊酚低劑量組(低劑量組)、模型組、對照組，各15只。其中高劑量組：造模前30 min經(jīng)大鼠股靜脈注射丙泊酚(意大利Astra Zenecz公司生產(chǎn)，批號：GT029)60 mg/(kg·h)；低劑量組：造模前30 min經(jīng)大鼠股靜脈注射丙泊酚20 mg/(kg·h)；對照組和模型組：造模前30 min經(jīng)大鼠股靜脈注射生理鹽水3 mL/(kg·h)。

1.2 造模方法 所有大鼠禁食水12 h后，腹腔麻醉注射25%烏拉坦(1 g/kg)，由上腹正中切開，暴露肝區(qū)。對照組分離肝門，不鉗夾。其余3組用動脈夾鉗夾肝蒂(包括門靜脈、肝動脈、肝左右葉血流，占肝臟95%血流，肝臟表面變灰白色，用無菌濕紗布覆蓋) 30 min后松開(灌注)2 h，制成大鼠肝缺血再灌注模型。處死大鼠，提取大鼠左心室心肌組織進(jìn)行實驗。

1.3 儀器與方法 ①將100 mg左心室游離壁心肌組織加入生理鹽水制成濃度為10%的勻漿液，參照試劑盒(南京建成生物工程研究所，編號A001、A003)的說明，采用黃嘌呤氧化酶法檢測超氧化物歧化酶(SOD)，采用硫代巴比妥酸比色法檢測丙二醛(MDA)含量。②將50 mg左心室心尖組織，鹽水沖洗后研磨成10%的混懸液，3 000 r/min離心10 min，取上清液低溫保存，采用化學(xué)比色法分別檢測Na+-K+-ATP酶(南京建成生物研究所生產(chǎn)，批號：20100423)、Ca2+-Mg2+-ATP酶(南京建成生物研究所生產(chǎn)，批號：20100423)活性。③用高效液相色譜儀器檢測ATP、ADP、AMP，色譜條件：溫度35 ℃，色譜柱(大連依利特生產(chǎn)，ODSC18，150 mm×4.6 mm，5 μm)，254 nm波長。流動相：0.25 mol/L(pH4.25)甲醇，KH2PO4緩沖液為(17∶83)時檢測AMP，流動相：0.16 mol/L(pH6.5)甲醇，KH2PO4緩沖液為(15∶85)時檢測ATP和ADP，采用Lanir法檢測心肌組織內(nèi)ATP、ADP、AMP含量，計算心肌能量(EC)值，EC=(ATP+0.5ADP)/(AMP+ATP+ADP)。④將左心室心尖組織，放入4%多聚甲醛溶液中，酒精脫水，二甲苯脫水，石蠟包埋、切片5 mm厚，HE染色。

2 結(jié) 果

2.1 4組心肌組織中SOD、MDA含量比較 模型組SOD明顯低于其他3組，MDA明顯高于其他3組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，說明造模成功。低劑量組SOD明顯高于高劑量組，MDA明顯低于高劑量組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。詳見表1。

組別nSOD(U/mg)MDA(nmol/mg)對照組1584．82±5．630．36±0．19模型組1528．73±2．981)2．98±0．561)高劑量組1552．46±3．271)2)1．83±0．421)2)低劑量組1577．24±3．861)2)3)0．69±0．231)2)3)F值 6．03 2726．30P <0．01 <0．01 與對照組比較，1)P<0．01；與模型組比較，2)P<0．01；與高劑量組比較，3)P<0．01。

2.2 4組ATP、AMP、ADP、EC的含量比較 模型組ATP、AMP、ADP、EC明顯低于其他3組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。低劑量組和高劑量組ATP、ADP、AMP、EC明顯高于模型組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，且低劑量組ATP、ADP、EC明顯高于高劑量組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。詳見表2。

表2 4組ATP、AMP、ADP、EC的含量比較 (±s) μmol/g

2.3 4組Na+-K+-ATP酶活性比較 模型組Na+-K+-ATP酶、Ca2+-Mg2+-ATP酶均明顯低于其他3組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。低劑量組和高劑量組Na+-K+-ATP酶、Ca2+-Mg2+-ATP酶明顯高于模型組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，低劑量組Na+-K+-ATP酶、Ca2+-Mg2+-ATP酶均明顯高于高劑量組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。詳見表3。

組別nNa+?K+?ATP酶Ca2+?Mg2+?ATP酶對照組1515．56±3．2617．83±4．13模型組15 4．15±2．061) 6．35±3．271)高劑量組15 8．68±2．971)2) 9．89±3．861)2)低劑量組1512．34±3．131)2)3)13．67±4．051)2)3)F值 10．47 9．92P <0．01 <0．01 與對照組比較，1)P<0．01；與模型組比較，2)P<0．01；與高劑量組比較，3)P<0．01。

2.4 4組心肌組織形態(tài)觀察 對照組心肌肌束整齊排列，胞漿豐富粉色，細(xì)胞核清晰藍(lán)色，無紅細(xì)胞滲出，未見炎性細(xì)胞浸潤。模型組心肌肌束多數(shù)斷裂，胞漿染色不一，細(xì)胞核消失，可見大量紅細(xì)胞滲出，大量炎性細(xì)胞浸潤。高劑量組心肌肌束斷裂，紅細(xì)胞滲出和炎性細(xì)胞較低劑量組明顯。低劑量組心肌肌束少量斷裂，細(xì)胞核部分清晰，少量紅細(xì)胞滲出和炎性細(xì)胞浸潤。

3 討 論

肝缺血再灌注在臨床肝臟外科手術(shù)中經(jīng)常出現(xiàn)，常因肝移植、肝癌根治術(shù)、肝葉切除等治療中需要短時間阻斷肝的血液供應(yīng)，已有研究證實[7]，肝缺血再灌注損傷的發(fā)生機(jī)制是氧化應(yīng)激反應(yīng)。SOD和MDA是體內(nèi)常見的抗氧化因子，SOD直接清除因氧化反應(yīng)產(chǎn)生的氧自由基，而MDA是在氧自由基作用下發(fā)生過氧化物反應(yīng)的產(chǎn)物，都具有保護(hù)組織內(nèi)皮細(xì)胞的作用[8-9]。本實驗結(jié)果顯示，與對照組比較，模型組SOD明顯降低，MDA明顯升高，說明造模成功。

心臟是機(jī)體對缺血缺氧最敏感的臟器，而肝短暫缺血后再恢復(fù)血液供應(yīng)，白細(xì)胞、線粒體和花生四烯酸等產(chǎn)生過多的氧自由基[10-11]，直接損害心肌細(xì)胞膜，影響心肌細(xì)胞膜的正常轉(zhuǎn)運，破壞細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致細(xì)胞能量代謝障礙，同時心肌結(jié)構(gòu)發(fā)生改變[12]。丙泊酚與丙二醛的化學(xué)結(jié)構(gòu)相似，當(dāng)發(fā)生氧化應(yīng)激性反應(yīng)時，酚性羥基還原氫原子形成可以消除自由基的穩(wěn)定分子，阻斷了脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，同時丙泊酚可以降低心肌細(xì)胞的耗氧量，進(jìn)一步提高了丙泊酚的抗氧化能力[13]。

心肌細(xì)胞正常功能依靠心肌的能量代謝維持，它主要由ATP供給，在線粒體中進(jìn)行，而維持線粒體細(xì)胞功能的是Na+-K+-ATP酶的活性，當(dāng)Na+-K+-ATP酶的活性降低，導(dǎo)致細(xì)胞水腫Na+與Ca2+交換障礙，則Ca2+-Mg2+-ATP酶活性下降，直接導(dǎo)致ATP降低，加重?fù)p傷心肌能量代謝障礙[14]。EC值是評價心肌細(xì)胞能量狀態(tài)的客觀指標(biāo)，本實驗結(jié)果顯示：模型組的心肌結(jié)構(gòu)明顯改變，低劑量組的細(xì)胞形態(tài)比高劑量組和模型組清晰，心肌肌束斷裂較少，細(xì)胞核部分清晰，少量紅細(xì)胞滲出和炎性細(xì)胞浸潤。低劑量組和高劑量組的ATP、ADP、AMP、EC明顯高于模型組，低劑量組ATP、ADP、EC明顯高于高劑量組，說明低劑量丙泊酚可以明顯提升心肌組織能量，減少心肌組織發(fā)生氧化損傷。與王宏等[15]的研究結(jié)果一致。目前關(guān)于肝缺血再灌注對遠(yuǎn)隔臟器損傷的報道較少，發(fā)生機(jī)制尚不明確，有研究報道[16]，丙泊酚預(yù)處理的劑量為6 mg/(kg·h)，心肌組織ATP值最接近正常水平，說明小劑量丙泊酚能夠更好地減少心肌受損。

綜上所述，肝缺血再灌注時心肌組織發(fā)生過氧化反應(yīng)，心肌細(xì)胞能量代謝障礙，低劑量丙泊酚能夠減少心肌組織能量代謝障礙，增加ATP含量，提高Na+-K+-ATP酶和Ca2+-Mg2+-ATP酶的活性，增加心肌組織的能量代謝。

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R542 R256.2

A

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信息：寧俊平，高敏，龐曉紅.不同劑量丙泊酚對肝缺血再灌注心肌能量代謝的影響[J].中西醫(yī)結(jié)合心腦血管病雜志，2017，15(22)：2832-2834.

2016-11-10)

(本文編輯 郭懷印)