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不同劑量丙泊酚對肝缺血再灌注心肌能量代謝的影響
寧俊平,高敏,龐曉紅
目的探討不同劑量丙泊酚對肝缺血再灌注時心肌能量代謝的影響。方法選取健康清潔級雄性SD大鼠60只,隨機(jī)分為丙泊酚高劑量組(高劑量組)、丙泊酚低劑量組(低劑量組)、模型組、對照組,各15只。高劑量組:造模前大鼠股靜脈注射丙泊酚60 mg/(kg·h);低劑量組:造模前大鼠股靜脈注射丙泊酚20 mg/(kg·h);對照組和模型組:造模前股靜脈注射生理鹽水3 mL/(kg·h)。麻醉后暴露肝區(qū),對照組僅分離肝門。其余3組動脈鉗鉗夾肝蒂30 min后松開(灌注)2 h,造模完成。黃嘌呤氧化酶法檢測超氧化物歧化酶(SOD),采用硫代巴比妥酸比色法檢測丙二醛(MDA)含量;化學(xué)比色法分別檢測Na+-K+-ATP酶和Ca2+-Mg2+-ATP酶;采用Lanir法檢測心肌組織內(nèi)ATP、ADP、AMP含量,計算心肌能量(EC)值;HE染色。結(jié)果模型組SOD明顯低于其他3組,MDA明顯高于其他3組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01),說明造模成功。低劑量組SOD明顯高于高劑量組,MDA明顯低于高劑量組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。低劑量組ATP、ADP、EC明顯高于高劑量組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。HE染色低劑量組的細(xì)胞形態(tài)比高劑量組和模型組清晰,心肌肌束斷裂較少,細(xì)胞核部分清晰,少量紅細(xì)胞滲出和炎性細(xì)胞浸潤。結(jié)論肝缺血再灌注時心肌組織發(fā)生過氧化反應(yīng),心肌細(xì)胞能量代謝障礙,低劑量丙泊酚能夠減少心肌組織能量代謝障礙,增加ATP含量,提高Na+-K+-ATP酶和Ca2+-Mg2+-ATP酶的活性,增加心肌組織的能量代謝。
肝缺血再灌注;心肌能量代謝;丙泊酚;氧化物歧化酶;丙二醛
肝缺血再灌注是指肝臟缺血缺氧短暫時間后恢復(fù)肝臟血流,常引起再灌注損傷,已有研究表明[1-2],肝缺血再灌注可能導(dǎo)致循環(huán)衰竭、呼吸衰竭、腎功能不全等,其中心肌損傷是最多見的,發(fā)生機(jī)制很復(fù)雜:氧自由基增多、心肌線粒體代謝障礙、心肌信號傳導(dǎo)異常等[3-4]。丙泊酚是一種短效的麻醉藥,常用于臨床手術(shù)中,具有抗氧化應(yīng)激、保護(hù)組織缺血再灌注損傷的作用[5-6]。目前更多的是研究肝缺血再灌注對肝臟的損傷,而保護(hù)心肌的研究較少。本實驗通過觀察肝缺血再灌注時心肌組織內(nèi)過氧化反應(yīng)和心肌能量代謝,探討不同劑量丙泊酚對心肌組織能量代謝的保護(hù)機(jī)制。
1.1 動物及分組 選取中國醫(yī)科大學(xué)動物部的健康清潔級雄性SD大鼠60只,體重350 g~380 g,隨機(jī)分為丙泊酚高劑量組(高劑量組)、丙泊酚低劑量組(低劑量組)、模型組、對照組,各15只。其中高劑量組:造模前30 min經(jīng)大鼠股靜脈注射丙泊酚(意大利Astra Zenecz公司生產(chǎn),批號:GT029)60 mg/(kg·h);低劑量組:造模前30 min經(jīng)大鼠股靜脈注射丙泊酚20 mg/(kg·h);對照組和模型組:造模前30 min經(jīng)大鼠股靜脈注射生理鹽水3 mL/(kg·h)。
1.2 造模方法 所有大鼠禁食水12 h后,腹腔麻醉注射25%烏拉坦(1 g/kg),由上腹正中切開,暴露肝區(qū)。對照組分離肝門,不鉗夾。其余3組用動脈夾鉗夾肝蒂(包括門靜脈、肝動脈、肝左右葉血流,占肝臟95%血流,肝臟表面變灰白色,用無菌濕紗布覆蓋) 30 min后松開(灌注)2 h,制成大鼠肝缺血再灌注模型。處死大鼠,提取大鼠左心室心肌組織進(jìn)行實驗。
1.3 儀器與方法 ①將100 mg左心室游離壁心肌組織加入生理鹽水制成濃度為10%的勻漿液,參照試劑盒(南京建成生物工程研究所,編號A001、A003)的說明,采用黃嘌呤氧化酶法檢測超氧化物歧化酶(SOD),采用硫代巴比妥酸比色法檢測丙二醛(MDA)含量。②將50 mg左心室心尖組織,鹽水沖洗后研磨成10%的混懸液,3 000 r/min離心10 min,取上清液低溫保存,采用化學(xué)比色法分別檢測Na+-K+-ATP酶(南京建成生物研究所生產(chǎn),批號:20100423)、Ca2+-Mg2+-ATP酶(南京建成生物研究所生產(chǎn),批號:20100423)活性。③用高效液相色譜儀器檢測ATP、ADP、AMP,色譜條件:溫度35 ℃,色譜柱(大連依利特生產(chǎn),ODSC18,150 mm×4.6 mm,5 μm),254 nm波長。流動相:0.25 mol/L(pH4.25)甲醇,KH2PO4緩沖液為(17∶83)時檢測AMP,流動相:0.16 mol/L(pH6.5)甲醇,KH2PO4緩沖液為(15∶85)時檢測ATP和ADP,采用Lanir法檢測心肌組織內(nèi)ATP、ADP、AMP含量,計算心肌能量(EC)值,EC=(ATP+0.5ADP)/(AMP+ATP+ADP)。④將左心室心尖組織,放入4%多聚甲醛溶液中,酒精脫水,二甲苯脫水,石蠟包埋、切片5 mm厚,HE染色。
2.1 4組心肌組織中SOD、MDA含量比較 模型組SOD明顯低于其他3組,MDA明顯高于其他3組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01),說明造模成功。低劑量組SOD明顯高于高劑量組,MDA明顯低于高劑量組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。詳見表1。
組別nSOD(U/mg)MDA(nmol/mg)對照組1584.82±5.630.36±0.19模型組1528.73±2.981)2.98±0.561)高劑量組1552.46±3.271)2)1.83±0.421)2)低劑量組1577.24±3.861)2)3)0.69±0.231)2)3)F值 6.03 2726.30P <0.01 <0.01 與對照組比較,1)P<0.01;與模型組比較,2)P<0.01;與高劑量組比較,3)P<0.01。
2.2 4組ATP、AMP、ADP、EC的含量比較 模型組ATP、AMP、ADP、EC明顯低于其他3組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。低劑量組和高劑量組ATP、ADP、AMP、EC明顯高于模型組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01),且低劑量組ATP、ADP、EC明顯高于高劑量組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。詳見表2。
表2 4組ATP、AMP、ADP、EC的含量比較 (±s) μmol/g
2.3 4組Na+-K+-ATP酶活性比較 模型組Na+-K+-ATP酶、Ca2+-Mg2+-ATP酶均明顯低于其他3組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。低劑量組和高劑量組Na+-K+-ATP酶、Ca2+-Mg2+-ATP酶明顯高于模型組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01),低劑量組Na+-K+-ATP酶、Ca2+-Mg2+-ATP酶均明顯高于高劑量組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。詳見表3。
組別nNa+?K+?ATP酶Ca2+?Mg2+?ATP酶對照組1515.56±3.2617.83±4.13模型組15 4.15±2.061) 6.35±3.271)高劑量組15 8.68±2.971)2) 9.89±3.861)2)低劑量組1512.34±3.131)2)3)13.67±4.051)2)3)F值 10.47 9.92P <0.01 <0.01 與對照組比較,1)P<0.01;與模型組比較,2)P<0.01;與高劑量組比較,3)P<0.01。
2.4 4組心肌組織形態(tài)觀察 對照組心肌肌束整齊排列,胞漿豐富粉色,細(xì)胞核清晰藍(lán)色,無紅細(xì)胞滲出,未見炎性細(xì)胞浸潤。模型組心肌肌束多數(shù)斷裂,胞漿染色不一,細(xì)胞核消失,可見大量紅細(xì)胞滲出,大量炎性細(xì)胞浸潤。高劑量組心肌肌束斷裂,紅細(xì)胞滲出和炎性細(xì)胞較低劑量組明顯。低劑量組心肌肌束少量斷裂,細(xì)胞核部分清晰,少量紅細(xì)胞滲出和炎性細(xì)胞浸潤。
肝缺血再灌注在臨床肝臟外科手術(shù)中經(jīng)常出現(xiàn),常因肝移植、肝癌根治術(shù)、肝葉切除等治療中需要短時間阻斷肝的血液供應(yīng),已有研究證實[7],肝缺血再灌注損傷的發(fā)生機(jī)制是氧化應(yīng)激反應(yīng)。SOD和MDA是體內(nèi)常見的抗氧化因子,SOD直接清除因氧化反應(yīng)產(chǎn)生的氧自由基,而MDA是在氧自由基作用下發(fā)生過氧化物反應(yīng)的產(chǎn)物,都具有保護(hù)組織內(nèi)皮細(xì)胞的作用[8-9]。本實驗結(jié)果顯示,與對照組比較,模型組SOD明顯降低,MDA明顯升高,說明造模成功。
心臟是機(jī)體對缺血缺氧最敏感的臟器,而肝短暫缺血后再恢復(fù)血液供應(yīng),白細(xì)胞、線粒體和花生四烯酸等產(chǎn)生過多的氧自由基[10-11],直接損害心肌細(xì)胞膜,影響心肌細(xì)胞膜的正常轉(zhuǎn)運,破壞細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu),導(dǎo)致細(xì)胞能量代謝障礙,同時心肌結(jié)構(gòu)發(fā)生改變[12]。丙泊酚與丙二醛的化學(xué)結(jié)構(gòu)相似,當(dāng)發(fā)生氧化應(yīng)激性反應(yīng)時,酚性羥基還原氫原子形成可以消除自由基的穩(wěn)定分子,阻斷了脂質(zhì)過氧化反應(yīng),同時丙泊酚可以降低心肌細(xì)胞的耗氧量,進(jìn)一步提高了丙泊酚的抗氧化能力[13]。
心肌細(xì)胞正常功能依靠心肌的能量代謝維持,它主要由ATP供給,在線粒體中進(jìn)行,而維持線粒體細(xì)胞功能的是Na+-K+-ATP酶的活性,當(dāng)Na+-K+-ATP酶的活性降低,導(dǎo)致細(xì)胞水腫Na+與Ca2+交換障礙,則Ca2+-Mg2+-ATP酶活性下降,直接導(dǎo)致ATP降低,加重?fù)p傷心肌能量代謝障礙[14]。EC值是評價心肌細(xì)胞能量狀態(tài)的客觀指標(biāo),本實驗結(jié)果顯示:模型組的心肌結(jié)構(gòu)明顯改變,低劑量組的細(xì)胞形態(tài)比高劑量組和模型組清晰,心肌肌束斷裂較少,細(xì)胞核部分清晰,少量紅細(xì)胞滲出和炎性細(xì)胞浸潤。低劑量組和高劑量組的ATP、ADP、AMP、EC明顯高于模型組,低劑量組ATP、ADP、EC明顯高于高劑量組,說明低劑量丙泊酚可以明顯提升心肌組織能量,減少心肌組織發(fā)生氧化損傷。與王宏等[15]的研究結(jié)果一致。目前關(guān)于肝缺血再灌注對遠(yuǎn)隔臟器損傷的報道較少,發(fā)生機(jī)制尚不明確,有研究報道[16],丙泊酚預(yù)處理的劑量為6 mg/(kg·h),心肌組織ATP值最接近正常水平,說明小劑量丙泊酚能夠更好地減少心肌受損。
綜上所述,肝缺血再灌注時心肌組織發(fā)生過氧化反應(yīng),心肌細(xì)胞能量代謝障礙,低劑量丙泊酚能夠減少心肌組織能量代謝障礙,增加ATP含量,提高Na+-K+-ATP酶和Ca2+-Mg2+-ATP酶的活性,增加心肌組織的能量代謝。
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R542 R256.2
A
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信息:寧俊平,高敏,龐曉紅.不同劑量丙泊酚對肝缺血再灌注心肌能量代謝的影響[J].中西醫(yī)結(jié)合心腦血管病雜志,2017,15(22):2832-2834.
2016-11-10)
(本文編輯 郭懷印)