下調大鼠血管平滑肌細胞血管緊張素轉換酶的表達

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下調大鼠血管平滑肌細胞血管緊張素轉換酶的表達

周華，張翠芳，陳瑞瑞，高奮，楊志明

目的構建腺病毒載體使其攜帶血管緊張素轉換酶(ACE)基因短發(fā)夾RNA(shRNA)，觀察選擇性下調大鼠血管平滑肌細胞ACE表達。方法從之前構建的真核表達載體p-ACE-shRNA中擴增ACE-shRNA片段，采用RT-PCR法并克隆進穿梭質粒pDC316中，將構建好的pDC316-ACE-shRNA穿梭質粒載體和pBHGlox-E1，3Cre骨架病毒共轉染293細胞，進行病毒顆粒包裝重組、滴度測定和純化。隨后進行原代培養(yǎng)大鼠血管平滑肌細胞轉染，通過實時熒光定量PCR分別在轉染前及轉染后24 h、48 h、72 h檢測ACE mRNA的表達。結果經PCR檢測證實攜帶ACE-shRNA重組腺病毒載體構建成功并制備出了高滴度重組病毒，大鼠血管平滑肌細胞被轉染后24 h，ACE mRNA表達無明顯變化；被轉染后48 h，ACE mPNA表達顯著降低，差異有統計學意義(P<0．05)；被轉染后72 h時ACE mRNA表達更低。結論本實驗成功構建重組腺病毒載體其攜帶ACE-shRNA片段，同時證實shRNA可選擇性下調原代培養(yǎng)大鼠血管平滑肌細胞上ACE表達，可能為心血管病基因治療提供新思路。

RNA干擾；平滑肌細胞；血管緊張素轉換酶

平滑肌細胞(VSMC)的增殖、遷移、收縮、凋亡，基質重塑、內質網應激、胰島素抵抗參與了動脈粥樣硬化等多種心血管疾病的病理生理過程[1]。血管緊張素Ⅱ作為腎素-血管緊張素-醛固酮系統(RAAS)生物活性最強、作用范圍最廣的活性肽，通過激活血管平滑肌細胞上PI3K/Akt 、MAPK 等信號轉導通路促進上述病理過程發(fā)生[2]。然而，傳統的治療是對血管緊張素轉換酶(ACE)的非循環(huán)特異阻斷、組織特異、血管壁特異，因為不同部位ACE介導的病理過程有其特殊性，局部ACE阻斷越來越受到科研工作者的重視[3]。本研究通過構建腺病毒載體使其含有ACE-shRNA，在原代培養(yǎng)大鼠血管平滑肌細胞利用RNAi技術下調ACE基因表達，旨在探索RNAi技術選擇性阻斷平滑肌細胞上的ACE在動脈粥樣硬化等心血管疾病基因治療中的應用前景。

1 材料與方法

1.1 主要材料 先期由本研究小組構建完成的質粒

p-ACE-shRNA，人源U6啟動子與增強綠色熒光蛋白(EGFP)序列，內含靶向大鼠ACE shRNA片段、兩個限制性內切酶位點Sac1和EcoR1之間克隆的質粒pGenesil-1。腺病毒包裝系統AdMax同時包括穿梭質粒pDC316-EGFP-shRNA-U6、腺病毒骨架質粒pBHGlox-E1，3Cre與HEK- 293細胞(北京本元正陽基因技術公司)。各種限制性內切酶、Taq DNA聚合酶、T4 DNA連接酶、RNase A(TaKaRa)。PCR產物回收純化試劑盒(寧波中鼎生物技術有限公司)與轉染試劑Lipofectamine2000(Gibco)。DMEM、F12培養(yǎng)基 (Gibco)、質粒提取試劑盒(QIAGEN)、氯化銫(Sigma)、胎牛血清(Hyclone)。超絕總RNA抽提試劑盒含UNIQ-10柱(上海生工生物工程技術有限公司)。其他各種試劑均為國產或進口分析純試劑。探針、引物的合成與設計均由上?；瞪锛夹g工程有限公司完成。

1.2 目的基因獲取 取1 μL p-ACE-shRNA質粒用熱休克法轉化入DH-5α感受態(tài)大腸桿菌，挑取一單克隆，接入LB培養(yǎng)基5 mL，37 ℃振蕩培養(yǎng)18 h，取菌液3 mL提取質粒。在HindⅢ限制酶和BamHI限制酶的作用下，水浴37 ℃酶切過夜。1%瓊脂糖凝膠進行酶切產物電泳，取酶切產物5 μL和1 mL 6×Loading Buffer 混勻上樣，10 V/cm進行電泳。

1.3 pDC316-EGFP-ACE-shRNA-U6重組質粒的構建 1%的瓊脂糖凝膠進行酶切產物電泳，紫外燈下收集質粒pDC316-EGFP-shRNA-U6的5.2kb片段酶切產物和質粒pACE-shRNA的60bp片段酶切產物，并回收DNA片段。在16 ℃水浴DNA連接酶連接過夜，取連接產物5 μL用熱休克法轉化入DH-5α感受態(tài)大腸桿菌，37 ℃下振蕩培養(yǎng)18 h，取菌液3 mL提取質粒，用酶切法篩選重組正確質粒，重組質粒命名為pDC316-EGFP-ACE-shRNA-U6。pDC316-EGFP-ACE-shRNA-U6重組質粒行酶切鑒定，送上海英駿生物技術有限公司進行測序。

1.4 雙質粒共同轉染293細胞，同源重組并且產生重組腺病毒 轉染的前1 d，于六孔板中接種293細胞，每孔有5×105個細胞，培養(yǎng)基為胎牛血清DMEM+10% Hyclone，置于37 ℃培養(yǎng)箱含5% CO2培養(yǎng)過夜。待細胞生長到80%～90%底面積時，取骨架質粒和穿梭質粒進行共轉染。用脂質體Lipofectamine2000進行轉染，轉染前先用培養(yǎng)液DMEM進行稀釋，轉染之后每天觀察細胞的出毒跡象。出毒現象：細胞呈葡萄狀變大變圓，開始明顯噬斑出現時。待大部分細胞發(fā)生病變即從底部脫落進行收毒。重組的腺病毒命名為Ad5-EGFP-ACE-shRNA。

1.5 重組的Ad5-EGFP-ACE-shRNA腺病毒進行PCR鑒定 在細胞瓶25 cm2中培養(yǎng)293細胞，待生長到90%細胞滿時，取上述第1代的500 μL毒種接種于細胞上，待細胞完全病變時凍融細胞3次按前述方法，收集病毒的上清液離心，此即為第2代的毒種(P2)。進行PCR鑒定目的基因，PCR的反應條件：94 ℃ 5 min、94 ℃ 30 s、55 ℃ 30 s、72 ℃ 40 s共30個循環(huán)；72 ℃5 min。然后再進行毒種的生產、純化和滴度測定。

1.6 大鼠血管平滑肌細胞培養(yǎng)及鑒定 解剖取出大鼠的胸腹主動脈，于無菌條件下，組織貼塊法培養(yǎng)平滑肌細胞，當細胞長滿80%培養(yǎng)瓶底時即可傳代，胞漿α-肌動蛋白免疫熒光陽性即鑒定為平滑肌細胞，實驗采用第3～4代細胞進行。

1.7 重組的Ad5-EGFP-ACE-shRNA腺病毒轉染大鼠血管平滑肌細胞 當大鼠的血管平滑肌細胞生長至90%融合時進行傳代，放置的無菌蓋玻片6孔板用5×105個/孔進行接種，同步化細胞后分為空白對照組、陽性病毒組和陰性病毒組。在接種24 h后，達到70%～80%細胞融合時進行轉染，將培養(yǎng)板中培養(yǎng)基吸去，等量的維持液加入，選擇對數生長期的細胞，直接將病毒按每孔1∶10接種滴入培養(yǎng)基中。48 h后在熒光顯微鏡下觀察轉染的效率。分別于轉染前及轉染后24 h、48 h、72 h收集細胞并提取mRNA。

1.8 綠色熒光蛋白檢測評價轉染的效率 用倒置相差顯微鏡，在轉染后48 h，先后經GFP特異性的濾色片濾光后通過自然光和紫外激發(fā)光源觀察六孔板內的血管平滑肌細胞，兩人同時獨立估計相同視野下的綠色熒光細胞數與自然光下總細胞數的百分比，取其平均值作為細胞轉染效率。

1.9 實時熒光定量PCR檢測ACE mRNA的表達 按試劑盒說明書提取總RNA，之后反轉錄成cDNA。在GenBank上選取大鼠的ACE mRNA序列(序列號NM_012544)，ACE探針序列為：5’-FTGGCACTTGTCTGTCACTGGAGCCTGATP-3’，上游引物為：5’-GCCTCCCAACGAGTTAGAAGAG-3’，下游引物為：5’-CGGGACGTGGCCATTATATT-3’；β-actin探針序列為：5’-FTCCAGCCTTCCTTCCTGGGTATGGAATC-3’，上游引物為：5’-TCAGGTCATCACTATCGGCAAT-3’，下游引物為：5’-GGATGTCAACGTCACACTTCATG-3’；探針修飾：P代表TAQMAN-MGB基團，F代表FAM。制備標準的曲線樣品：需要先將樣品管家基因(β-actin)以及目的基因進行PCR的擴增，行梯度稀釋其產物用于標準曲線制做。PCR的反應條件為94 ℃預變性2 min，94 ℃變性15 s，60 ℃退火、延伸30 s，共30個循環(huán)。在GeneAmp 5700 sequence Detector System檢測儀上進行擴增同時收集熒光信號，分析結果。為消除RT及PCR反應效率差異、mRNA定量對結果的影響，實驗中同步行絕對拷貝數定量檢測內對照β-actin，以檢測基因和β-actin絕對拷貝數之比為檢測基因相對表達量。

2 結 果

2.1 pACE-shRNA質粒酶切鑒定 pACE-shRNA質粒酶切鑒定電泳圖(見圖1)。質粒pACE-shRNA經HindIII和BamHI雙酶切預計得到4.8kb和60bp的小片段兩條帶。實驗結果與預計相符。

2.2 pDC316-EGFP-ACE-shRNA-U6重組質粒酶切鑒定及測序鑒定 pDC316-EGFP-ACE-shRNA-U6重組質粒的酶切鑒定電泳圖(見圖2)。質粒pDC316-EGFP-ACE-shRNA-U6中shRNA編碼序列后方設計插入了一個SalI位點，所以，經SalI單酶切預計能產生一條線性化條帶5.2kb，電泳的結果與預計相符，經酶切鑒定該重組的質粒正確。在英駿公司用引物Cdcksi-r進行測序比對表明：測出序列與U6啟動子序列完全一致。說明編碼序列shRNA已成功構建到pDC316-EGFP-ACE-shRNA-U6重組質粒中，所以，pDC316-EGFP-ACE-shRNA-U6重組質粒構建正確。

注：1代表BamHI+HindIII雙酶切pACE-shRNA質粒；M1代表DL15 000(上樣量5 μL，條帶大小分別為15 000、10 000、7 500、5 000、2 500、1 000、250)；M2代表DL2 000(上樣量5 μL，條帶大小分別為2 000、1 000、50、500、250、100)。

注：1代表 SalI單酶切pDC316-EGFP-ACE-shRNA-U6質粒；2代表 pDC316-EGFP-ACE-shRNA-U6質粒；M1代表DL2 000(上樣量5 μL，條帶大小分別為2 000、1 000、750、500、250 、100)； M2代表DL15 000(上樣量5 μL，條帶大小分別為15 000、10 000、7 500、5 000、2 500、1 000)。

2.3 Ad5-EGFP-ACE-shRNA重組腺病毒進行PCR鑒定、測序及滴度測定 Ad5-EGFP-ACE-shRNA重組腺病毒經PCR可擴增出目的基因，大小約在500bp左右(見圖3)。

DNA測序同前比對的結果表明，通過位點特異性基因重組方式產生重組腺病毒所克隆的序列和已知的序列完全一致，未發(fā)現有移碼或突變，表明腺病毒骨架質粒和穿梭質粒確實發(fā)生了重組。

滴度測定的結果表明：Ad5-EGFP-ACE-shRNA重組腺病毒的感染性滴度(TCID50/mL)為 8×109，Ad5對照腺病毒的感染性滴度(TCID50/mL)為7.3×109。

注：M代表DL2000Marker(2 000bp、1 000bp、750bp、500bp、250bp、100bp)； 1代表Ad5-EGFP-ACE-shRNA-U6提DNA原液；2代表Ad5-EGFP-ACE-shRNA-U6提DNA稀釋10倍；3代表 Ad5-EGFP-ACE-shRNA-U6提DNA稀釋100倍；4代表陽性對照(pDC316-EGFP-ACE-shRNA-U6)；5代表陰性對照。

2.4 大鼠血管平滑肌細胞培養(yǎng)及鑒定 在倒置顯微鏡下觀察可見血管平滑肌細胞形狀多樣，一般為三角形、梭形、星形或帶形，部分區(qū)域細胞呈單層，部分區(qū)域呈多層重疊，高低起伏，呈現VSMC特征性的“谷”“峰”狀生長(見圖4)。通過熒光顯微鏡掃描，RASMC核周胞漿可呈現較強的黃綠色熒光，呈彌散分布或顆粒狀存在，而背景則無熒光顯現，證實培養(yǎng)平滑肌細胞成功(見圖5)。

圖4 大鼠主動脈平滑肌細胞(×100)

圖5平滑肌細胞α-肌動蛋白免疫熒光鑒定(×200)

2.5 Ad5-EGFP-ACE-shRNA重組腺病毒成功轉染了大鼠血管平滑肌細胞 Ad5-EGFP-ACE-shRNA重組腺病毒轉染大鼠血管平滑肌細胞 48 h后，在熒光顯微鏡下觀察發(fā)現有所編碼的綠色熒光蛋白(EGFP)的病毒載體表達，熒光細胞與自然光下細胞數之比即為轉染效率，大約95%以上，證實病毒載體轉染平滑肌細胞成功；并且可見感染細胞出現很強凝聚性而且可形成細胞團，有時可呈串狀，細胞折光性增強(見圖6)。

圖6 Ad5-EGFP-ACE-shRNA轉染大鼠血管平滑肌細胞后48 h(×100)

2.6 Ad5-EGFP-ACE-shRNA重組腺病毒轉染大鼠血管平滑肌細胞后對ACE mRNA表達的影響 與空白對照組和陰性病毒組相比，陽性病毒組(Ad5-EGFP-ACE-shRNA)細胞ACE mRNA的表達轉染后24 h無明顯變化；48 h明顯降低，差異有統計學意義(P<0．01)；72 h更低；表明Ad5-EGFP-ACE-shRNA 顯著下調了ACE mRNA 表達。而空白對照組和陰性病毒組轉染前后的各時間點ACE mRNA的表達無明顯變化(見表1)。結果提示RNAi所介導的基因沉默主要由于靶mRNA降解而引起。

組別0h24h48h72h空白對照組0．862±0．0420．863±0．0320．864±0．0330．861±0．031陰性病毒組0．853±0．0320．854±0．0280．852±0．0320．853±0．032陽性病毒組0．855±0．0240．853±0．026 0．454±0．0241)3) 0．253±0．0132)4) 與空白對照組比較，1)P<0．05，2)P<0．01；與陰性病毒組比較，3)P<0．05，4)P<0．01。

3 討 論

隨著基因治療技術的興起，現代醫(yī)學診療已經向分子水平轉變?；蚣夹g已經廣泛用于生命科學的各個領域，為人類多種疾病的診療帶來革命性變化[4]。RNAi是一種進化上高度保守、具有高度特異性，與特異性位點結合后只降解與其同源序列的RNA，所致的一種轉錄后基因沉默現象，利用該技術可特異性阻斷某些致病基因的表達[5]。近年來國內外對RNAi技術的研究極為廣泛，并取得重大進展[6-8]。本研究通過構建腺病毒載體使其含有ACE-shRNA，在原代培養(yǎng)大鼠血管平滑肌細胞利用RNAi技術特異性下調ACE基因表達，為研究AngⅡ介導血管平滑肌細胞在動脈粥樣硬化等多種心血管疾病中的病理生理作用奠定基礎。

VSMC生長、分化，細胞外基質重塑、降解，炎癥反應，胰島素抵抗等貫穿動脈粥樣硬化全過程。越來越多的證據表明 AngⅡ通過作用VSMC上的AT1受體，激活細胞內多種信號轉導通路調控上述病理過程[9]。

VSMC作為血管壁的重要成分，其高度分化的收縮表型在維持血管壁張力中發(fā)揮重要作用。VSMC從動脈中膜遷移到內膜、吞噬脂質后轉變?yōu)榕菽毎?，分泌大量的細胞外基質，引起纖維組織增生，因此VSMC的異常增殖、收縮、遷移可促進早期粥樣硬化斑塊的形成[10]。 AngⅡ可通過兩類通路調控VSMC生長、分化。首先，通過激活受體(非酪氨酸蛋白酶家族)包括EGFR、 PDGFR、 c-Src、 PYK2、FAK、JAK2，調控VSMC生長、分化(增殖、遷移、收縮)。其次，激活酪氨酸蛋白酶家族包括MAPK家族、p70S6K、Akt、PKCs等參與上述病理過程[9]。其中PI3K/Akt、P70s6K的激活可促進VSMC增殖，P38MAPK的激活促進VSMC增殖的同時也促進其收縮，EPK激活對上述三種病理過程均有促進作用[11-14]。有研究表明AngⅡ誘導的活性氧簇(ROS)又對上述通路具有調節(jié)作用[15]。

晚期病變尤其是不穩(wěn)定斑塊以纖維帽薄、大量炎癥細胞浸潤、平滑肌細胞和細胞外基質較少為特征，VSMC的凋亡、壞死以及細胞外基質降解在晚期病變尤其是不穩(wěn)定斑塊的破裂中發(fā)揮重要作用[10]；多項研究表明AngⅡ可激活MAPK、PLD、PLA2，作用于NADP/NADPH氧化酶，激活線粒體上的KATP，產生更多ROS，從而啟動線粒體介導的VSMC的凋亡，誘發(fā)斑塊破裂等急性心血管事件[16-20]；細胞外基質作為血管壁的重要組成成分，其中基質金屬蛋白酶9(MMP-9)與組織蛋白酶抑制劑1比值(TIMP-1)在維持細胞外基質平衡及斑塊穩(wěn)定性中發(fā)揮重要作用，晚期斑塊中AngⅡ通過激動VSMC上的AT1受體，雖不影響TIMP-1表達，但可促進基質金屬蛋白酶1(MMP-1)、基質金屬蛋白酶3(MMP-3)和MMP-9表達，MMP/TIMP增大，促進Ⅰ型前膠原肽N端(PⅠNP)及Ⅲ型前膠原肽N端(PⅢNP)的降解，導致斑塊破裂，且平滑肌細胞的凋亡及細胞外基質的降解與腹主動脈瘤(AAA)明確相關[21-25]。

AngⅡ以濃度依賴的方式激活IRE1通路，促進內質網生成更多轉錄因子NF-κB及AP-1，介導ERStress相關的炎癥反應，從而參與動脈粥樣硬化全過程[26-29]；且ER Stress相關的炎癥可能與慢性腎臟疾病(CKD)所致動脈粥樣硬化相關[26，30]。有研究證明IRE1α/IKK/NF-κB誘導的炎癥反應能夠被血管緊張素轉化酶抑制所阻斷，也有學者用IRE1α-siRNA技術阻斷了AngⅡ介導的炎癥反應，從而減少了ER stress相關AS的發(fā)生[31]。利用RNAi技術在基因水平通過下調ACEmRNA，減少AngⅡ生成，有望為動脈粥樣硬化的基因治療帶來希望。早期對VSMC的研究表明，胰島素可通過MAPK通路刺激血管平滑肌細胞的生長和遷移[32]，意味著胰島素在某些情況下可促進AS的形成。然而，最近的研究表明，胰島素通過與IRS-1作用激活PI3K/Akt通路，刺激中內皮型一氧化氮合酶(eNOS)和誘導型一氧化氮合成酶(iNOS)表達而促進NO產生，改善血管重塑，延緩動脈粥樣硬化的發(fā)生[33-34]。有趣的是，在胰島素抵抗條件下，PI3K/Akt通路的抑制與ERK/MAPK通路激活有關[35]。Folli 等[36]在小鼠主動脈 VSMC模型中發(fā)現 AngⅡ能夠減弱胰島素對IRS-1磷酸化作用及PI3K通路的激活，證明了AngⅡ能增加胰島素抵抗，進而加速AS形成。血管緊張素轉化酶抑制劑及AT1受體拮抗劑的應用能夠改善胰島素抵抗，延緩AS進程，本研究利用RNAi技術阻斷VSMC上ACE的表達。

傳統藥物治療對ACE 的阻斷并非循環(huán)特異、組織特異、血管壁特異，因為不同部位ACE介導的病理過程有其特殊性，局部ACE阻斷越來越受到科研工作者的重視[3]。在強調金準醫(yī)學的今天，RNAi技術特異性阻斷VSMC上的ACE表達較傳統的血管緊張素轉化酶抑制劑及AT1受體拮抗劑對腎素-血管緊張素-醛固酮系統的阻斷具有獨特優(yōu)勢，為進一步研究血管平滑肌細胞對動脈粥樣硬化、腹主動脈瘤等多種心血管疾病的作用機制奠定基礎。

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Selective Knockdown of Angiotensin-converting Enzyme in Rat Vascular Smooth Muscle Cells by RNA Interference

Zhou Hua，Zhang Cuifang，Cheng Ruirui，Gao Fen，Yang Zhiming

Second Hospital，Shanxi Medical University，Taiyuan 030001，Shanxi，China

Objective To construct adenovirus vector carrying the shRNA of rat angiotensin- converting enzyme (ACE) .To selectively knock down the expression of angiotensin-converting enzyme (ACE) in rat vascular smooth muscle cells by RNA interference.Methods The rat ACE-shRNA segments was obtained from plasmid p-ACE-shRNA which was constructed at an earlier date by RT-PCR and then was cloned into the shuttle plasmid pDC316 to form the pDC316-EGFP-ACE-shRNA vector.The pDC316-EGFP-ACE-shRNA plasmid was cotransfected with genomic plasmid pBHGlox-E1，3Cre into 293 cells to package the recombinant adenovirus.The recombinant adenovirus was transfected into the primary cultured rat vascular smooth muscle cells.ACE mRNA expression were analyzed from rat vascular smooth muscle cells before transfection and 24，48，72 hours after transfection by real-time fluorescence quantitative PCR.Results Recombinant adenoviral vector Ad-EGFP-ACE-shRNA was constructed successfully，which was confirmed by restriction enzyme digestion，PCR and GFP expression.Expression of ACE mRNA in rat vascular smooth muscle cells were significantly reduced 48 hours after Ad-EGFP-ACE-shRNA transfection，and was nearly undetectable after 72 hours．Conclusion The recombinant adenoviral vector carrying ACE-shRNA is successfully constructed.RNA interference can knockdown ACE expression in cultured rat vascular smooth muscle cells，which maybe provide a new gene therapy idea for cardiovascular diseases．

RNA interference；vascular smooth muscle cells；angiotensin-converting enzyme

R329

A

10.3969/j.issn.1672-1349.2017.22.007

1672-1349(2017)22-2821-06

山西省衛(wèi)生廳科技攻關項目(No.200933)

山西醫(yī)科大學第二醫(yī)院(太原030001)，E-mail：zhouhua032670@sina.com

信息：周華，張翠芳，陳瑞瑞，等.下調大鼠血管平滑肌細胞血管緊張素轉換酶的表達[J].中西醫(yī)結合心腦血管病雜志，2017，15(22)：2821-2826.

2017-04-16)

(本文編輯 郭懷印)