鯉春病毒血癥病毒焦磷酸測(cè)序檢測(cè)技術(shù)的建立

劉 瑤，尹偉力，張四化，岳志芹，孫 濤

( 1.榮成出入境檢驗(yàn)檢疫局，山東 榮成 264300； 2.煙臺(tái)出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫中心，山東 煙臺(tái) 264000；3.武漢市動(dòng)物疫病防控中心，湖北 武漢 430003； 4.山東出入境檢驗(yàn)檢疫局技術(shù)中心，山東 青島 266002 )

鯉春病毒血癥病毒焦磷酸測(cè)序檢測(cè)技術(shù)的建立

劉 瑤1，尹偉力2，張四化3，岳志芹4，孫 濤4

( 1.榮成出入境檢驗(yàn)檢疫局，山東 榮成 264300； 2.煙臺(tái)出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫中心，山東 煙臺(tái) 264000；3.武漢市動(dòng)物疫病防控中心，湖北 武漢 430003； 4.山東出入境檢驗(yàn)檢疫局技術(shù)中心，山東 青島 266002 )

通過收集鯉春病毒血癥病毒基因序列，設(shè)計(jì)了鯉春病毒血癥病毒最為保守的指紋序列，以及測(cè)序引物，建立了鯉春病毒血癥病毒焦磷酸測(cè)序檢測(cè)方法。對(duì)所構(gòu)建的鯉春病毒血癥病毒焦磷酸檢測(cè)方法進(jìn)行特異性試驗(yàn)和靈敏度檢測(cè)，試驗(yàn)結(jié)果表明所建立的方法特異性好，在8種魚類病毒中能夠特異性檢測(cè)出目的病毒，檢測(cè)方法靈敏度高，最低檢出核酸量為10 pg/μL。對(duì)建立的焦磷酸測(cè)序檢測(cè)方法進(jìn)行了實(shí)際應(yīng)用研究，選取國(guó)內(nèi)采集與進(jìn)口的魚類樣本共計(jì)80批次進(jìn)行鯉春病毒血癥病毒檢測(cè)。結(jié)果顯示，焦磷酸測(cè)序檢測(cè)方法可以有效的檢出常規(guī)RT-PCR不能檢出的假陰性樣本和弱陽性樣本，該方法的靈敏度和特異性可以滿足水生動(dòng)物疫病檢測(cè)的需要。

鯉春病毒血癥病毒；焦磷酸測(cè)序；檢測(cè)

鯉春病毒血癥病毒(Spring Viremia of Carp Virus，SVCV)又稱鯉魚彈狀病毒，是魚類強(qiáng)致病性病毒之一[1]。鯉春病毒血癥會(huì)引起鯉科魚類急性出血性疾病，該病為必須向世界動(dòng)物衛(wèi)生組織申報(bào)的疫病。鯉春病毒血癥病毒會(huì)造成魚類出現(xiàn)傳染性出血性壞死，死亡率高達(dá)90%，損失極其慘重[2]。鯉春病毒血癥病毒在歐洲廣為流行[3-5]。鯉春病毒血癥病毒在美洲的太平洋沿岸，從秘魯?shù)侥鞲绲暮琪V(Oncorhynchusmykiss)養(yǎng)殖場(chǎng)流行，偶爾也發(fā)現(xiàn)在這些地區(qū)的野生虹鱒有鯉春病毒血癥病毒感染。美洲的大西洋、加勒比海和墨西哥灣的沿海地區(qū)養(yǎng)殖金魚(Carassiusauratus)也發(fā)現(xiàn)了鯉春病毒血癥病毒，但在當(dāng)?shù)匾吧痿~種群中尚未發(fā)現(xiàn)鯉春病毒血癥病毒感染[6]。2002年美國(guó)首次報(bào)道在國(guó)內(nèi)分離出兩株鯉春病毒血癥病毒，2006年加拿大首次報(bào)道分離出鯉春病毒血癥病毒[7]。我國(guó)在2004年首次分離出鯉春病毒血癥病毒，標(biāo)志著該病毒已經(jīng)隨著國(guó)際貿(mào)易增長(zhǎng)傳入境內(nèi)[8]。

鯉春病毒血癥病毒是影響世界魚類養(yǎng)殖業(yè)的主要病害，如何控制好疫病的爆發(fā)，做好病害防治，成為目前我國(guó)水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)和進(jìn)出口行業(yè)的重中之重。參照世界動(dòng)物衛(wèi)生組織《水生動(dòng)物疫病診斷手冊(cè)》[9]及我國(guó)的出入境檢驗(yàn)檢疫行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)[10]，細(xì)胞分離與RT-PCR方法是目前普遍適用且有效的兩種檢測(cè)方法。細(xì)胞分離操作復(fù)雜，需要盲傳2代，檢測(cè)周期長(zhǎng)，而RT-PCR方法必須與測(cè)序聯(lián)合使用才能作為疫病確診的依據(jù)。RT-PCR方法作為一種常規(guī)的核酸檢測(cè)方法，其操作需要經(jīng)歷核酸提取、核酸擴(kuò)增、瓊脂糖電泳、擴(kuò)增產(chǎn)物回收以及擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序5個(gè)階段，全程耗時(shí)3～5 d，耗時(shí)長(zhǎng)。如果PCR擴(kuò)增產(chǎn)物含量低而不能達(dá)到測(cè)序要求時(shí)，測(cè)序?qū)o法進(jìn)行，進(jìn)而不能對(duì)檢測(cè)到的疑似陽性樣品進(jìn)行最終確診。

在實(shí)際檢測(cè)工作中，需要建立一種對(duì)病原體一段很短但是特別保守的片段進(jìn)行測(cè)序的方法，這種方法要求快速簡(jiǎn)潔并滿足對(duì)病原體大量檢測(cè)的需要。因焦磷酸測(cè)序檢測(cè)方法能夠短時(shí)間內(nèi)精準(zhǔn)測(cè)出短DNA片段的序列，同時(shí)可以測(cè)96份樣品[11-12]，操作簡(jiǎn)便，能夠形成標(biāo)準(zhǔn)化的檢測(cè)流程，特別適合水生動(dòng)物疫病病原體的檢測(cè)與確證。本研究以鯉春病毒血癥病毒為研究對(duì)象，設(shè)計(jì)特異的測(cè)序引物及其指紋序列，優(yōu)化焦磷酸測(cè)序條件，建立特異、準(zhǔn)確的鯉春病毒血癥病毒焦磷酸測(cè)序檢測(cè)技術(shù)體系，為水生動(dòng)物病毒病害的監(jiān)測(cè)和防控提供新的檢測(cè)方法。

1 材料與方法

1.1 毒株核酸

傳染性造血器官壞死病毒(IHNV)、流行性造血器官壞死病毒(EHNV)、病毒性出血性敗血癥病毒(VHSV)、傳染性胰臟壞死病毒(IPNV)、牙鲆彈狀病毒(HRV)、病毒性神經(jīng)壞死病毒(VNNV)和錦鯉皰疹病毒(KHV)核酸均由華中農(nóng)業(yè)大學(xué)友情提供。鯉春病毒血癥病毒毒株由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 試劑與設(shè)備

引物、檢測(cè)探針均由TaKaRa(寶生物, 大連)公司合成；生物素標(biāo)記通用引物由Invitrogen(英駿，上海)公司合成；dNTP、ExTaq DNA聚合酶混液、onestep RT-PCR試劑盒、DL2000分子標(biāo)記均購(gòu)自TaKaRa(寶生物, 大連)公司；Qiagen DNA提取試劑盒(52906)、Qiagen RNA提取試劑盒(74104)購(gòu)自于Qiagen公司；Pyro SQA Reagents DNA序列分析試劑盒(96次)、鏈霉親和素包被磁珠購(gòu)自北京基因有限公司。Qiagen PYROMARKID焦磷酸測(cè)序儀；PCR擴(kuò)增儀(Eppendorf)；電泳儀(北京六一，DYY-8C)；凝膠成像儀(天能，G-BOX-EF)；紫外燈觀察箱(上海路陽，Icm-26)。

1.3 測(cè)序指紋序列的確定及測(cè)序引物設(shè)計(jì)

選取鯉春病毒血癥病毒較為保守的G基因作為研究對(duì)象。通過美國(guó)國(guó)立生物信息技術(shù)中心(NCBI)查詢檢索已公開的鯉春病毒血癥病毒G基因。去除一些信息不全、不完整的序列片段，對(duì)來自同一地點(diǎn)，同一年份，序列差異極小的毒株，選取其中一株，最后選取的序列號(hào)如下：

鯉春病毒血癥病毒G基因序列登陸號(hào)分別為：AJ318079.1、DQ491000.1、U18101.2、JQ666284.1、AY842484.1、AY842485.1、AY842486.1、DQ227500.1、DQ227501.1、DQ227502.1、DQ227503.1、DQ227504.1、AY842488.1、AY842489.1、EU370915.1、AY527273.1。

用DNAStar 7.1軟件中附帶的Editseq和MegAlign功能，將上面找到的序列輸入至軟件中，每個(gè)堿基進(jìn)行比對(duì)。找到鯉春病毒血癥病毒最為保守的20 bp以內(nèi)的一段序列，作為焦磷酸測(cè)序的指紋序列。在指紋序列上、下游設(shè)計(jì)測(cè)序引物。

1.4 測(cè)序引物RT-PCR反應(yīng)

按照Qiagen RNA提取試劑盒說明書提取組織樣品或病毒液的RNA。

取2 μL鯉春病毒血癥病毒核酸，按照RT-PCR試劑盒說明配置反應(yīng)體系，加入上游測(cè)序引物0.5 μL，標(biāo)記生物素下游測(cè)序引物0.5 μL，DEPC水補(bǔ)足體積至50 μL。PCR儀設(shè)定如下程序：50 ℃ 30 min，94 ℃ 5 min，94 ℃ 30 s，摸索測(cè)序引物的退火溫度，72 ℃延伸30 s，共30個(gè)循環(huán)，最后72 ℃延伸10 min，4 ℃保溫。

取10 μL RT-PCR產(chǎn)物和1 μL加6×Loading buffer混合，在1%瓊脂糖凝膠上以5 V/cm電壓電泳，以標(biāo)準(zhǔn)分子量作參考，觀察是否擴(kuò)增成功。

1.5 焦磷酸測(cè)序反應(yīng)

取50 μL PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，加入200 μg包被了鏈酶親和素的磁珠，室溫孵育20 min，讓磁珠與PCR產(chǎn)物連接。用測(cè)序儀自帶的真空泵工具將連接磁珠的PCR產(chǎn)物吸起，然后用70%酒精清洗5 s；放入denatureation buffer清洗5 s；用washing buffer清洗10 s；用真空泵工具將PCR磁珠產(chǎn)物放入反應(yīng)板中，加入測(cè)序引物2 μL，輕輕振搖，釋放磁珠。將待測(cè)物放入80 ℃烘箱2 min，放置室溫冷卻。

將待測(cè)物放入焦磷酸測(cè)序儀中反應(yīng)，反應(yīng)溫度設(shè)置為28 ℃。每次進(jìn)樣的壓力選擇60 kPa，進(jìn)樣時(shí)間設(shè)置為8 ms，每輪測(cè)序時(shí)間設(shè)置為65 s。測(cè)序引物沿著待測(cè)模板，隨著不同dNTP的加入而擴(kuò)增。每當(dāng)有單個(gè)dNTP結(jié)合，反應(yīng)會(huì)釋放信號(hào)，測(cè)序儀收集信號(hào)，生成測(cè)序峰。

1.6 特異性測(cè)定

將鯉春病毒血癥病毒的測(cè)序引物分別與病毒性出血性敗血癥病毒、流行性造血器官壞死病毒、傳染性胰臟壞死病毒、牙鲆彈狀病毒、病毒性神經(jīng)壞死病毒、傳染性造血器官壞死病毒和錦鯉皰疹病毒的RNA模板進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，將RT-PCR產(chǎn)物進(jìn)行焦磷酸測(cè)序分析。

1.7 靈敏度檢測(cè)

將鯉春病毒血癥病毒核酸進(jìn)行10倍倍比稀釋后，采用建立的焦磷酸測(cè)序方法進(jìn)行檢測(cè)，并檢測(cè)其靈敏度。

1.8 實(shí)際樣本的檢測(cè)

2013—2015年，采集我國(guó)國(guó)內(nèi)養(yǎng)殖的魚類樣品共計(jì)50批次，進(jìn)口魚樣共計(jì)30批次，每批次采集魚樣本至少30尾，魚品種為鯉魚(Cyprinuscarpio)、草魚(Ctenopharyngodonidellus)、黃顙魚(Pelteobagrusfulvidraco)、大菱鲆(Scophthalmusmaximus)、虹鱒，采樣樣品為魚苗、幼魚或成魚。取魚樣本的腎、脾、肝、眼、腦等器官。對(duì)于魚苗，取整尾魚作為樣品，將組織勻漿，提取RNA，進(jìn)行病毒性出血性敗血癥病毒焦磷酸測(cè)序檢測(cè)。

取樣本核酸，進(jìn)行鯉春病毒血癥病毒的常規(guī)RT-PCR檢測(cè)，檢測(cè)引物參考世界動(dòng)物衛(wèi)生組織《水生動(dòng)物疫病診斷手冊(cè)》[9]，將這兩種檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行比較。

2 結(jié) 果

2.1 測(cè)序指紋序列的確定及測(cè)序引物設(shè)計(jì)

鯉春病毒血癥病毒G基因序列比對(duì)后，發(fā)現(xiàn)包含712～722位點(diǎn)的核酸序列“TGGGGGCGAATGCAGA”高度保守，將其作為標(biāo)準(zhǔn)指紋序列(圖1，圖2)。

根據(jù)鯉春病毒血癥病毒的指紋序列，設(shè)計(jì)測(cè)序引物(表1)。

表 1 測(cè)序引物設(shè)計(jì)

圖1 鯉春病毒血癥病毒的指紋序列

圖2 鯉春病毒血癥病毒G基因引物設(shè)計(jì)結(jié)果

2.2 測(cè)序引物的RT-PCR擴(kuò)增

通過對(duì)PCR的變性、退火、延伸溫度和時(shí)間的優(yōu)化，最后確定測(cè)序引物RT-PCR的循環(huán)條件為：94 ℃預(yù)變性5 min后，進(jìn)入94 ℃變性30 s，退火58 ℃，30 s，72 ℃延伸30 s的循環(huán)，共循環(huán)30次。然后72 ℃再延伸10 min，4 ℃結(jié)束。

用所建立的鯉春病毒血癥病毒測(cè)序引物RT-PCR方法，擴(kuò)增鯉春病毒血癥病毒病毒核酸，檢測(cè)結(jié)果均擴(kuò)增出與試驗(yàn)設(shè)計(jì)相符的目的條帶(138 bp)，電泳結(jié)果見圖3。

圖3 電泳結(jié)果M:DNA標(biāo)準(zhǔn)DL2000; 1,2:鯉春病毒血癥病毒; 3:陰性對(duì)照.

2.3 焦磷酸測(cè)序結(jié)果

鯉春病毒血癥病毒的RT-PCR產(chǎn)物，經(jīng)焦磷酸測(cè)序反應(yīng)，所測(cè)序列為“TGGGGGCGAATGCAGA”(圖4)，與設(shè)計(jì)的指紋序列一致。

圖4 鯉春病毒血癥病毒測(cè)序結(jié)果

2.4 特異性測(cè)定

將鯉春病毒血癥病毒的特異性測(cè)序引物分別與病毒性出血性敗血癥病毒、流行性造血器官壞死病毒、傳染性胰臟壞死病毒、牙鲆彈狀病毒、病毒性神經(jīng)壞死病毒、傳染性造血器官壞死病毒和錦鯉皰疹病毒的RA模板進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增及焦磷酸測(cè)序，只有與特異性引物相吻合的鯉春病毒血癥病毒RNA模板得到預(yù)期擴(kuò)增片段大小(138 bp，圖5)及相應(yīng)峰型，其余病毒均未得到特異性條帶及和已知序列吻合的峰型，由此鑒定了引物設(shè)計(jì)的特異性。

圖5 鯉春病毒血癥病毒焦磷酸測(cè)序特異性擴(kuò)增結(jié)果M:DNA標(biāo)準(zhǔn)DL2000；1:鯉春病毒血癥病毒； 2:傳染性造血器官壞死病毒； 3:病毒性出血性敗血癥病毒； 4:流行性造血器官壞死病毒； 5:牙鲆彈狀病毒； 6:傳染性胰臟壞死病毒；7:病毒性神經(jīng)壞死病毒；8:錦鯉皰疹病毒； 9:陰性對(duì)照.

2.5 靈敏度測(cè)試

將鯉春病毒血癥病毒核酸進(jìn)行10倍倍比稀釋后采用該焦磷酸測(cè)序方法檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，隨著核酸質(zhì)量濃度的降低，測(cè)序結(jié)果隨之減少。該方法對(duì)鯉春病毒血癥病毒核酸的最低檢出量達(dá)10 pg/μL(圖6)。

圖6 鯉春病毒血癥病毒焦磷酸測(cè)序靈敏度結(jié)果M:DNA標(biāo)準(zhǔn)DL2000； 1:鯉春病毒血癥病毒核酸 10 ng/μL； 2:鯉春病毒血癥病毒核酸 1 ng/μL； 3:鯉春病毒血癥病毒核酸 100 pg/μL； 4:鯉春病毒血癥病毒核酸 10 pg/μL； 5:鯉春病毒血癥病毒核酸 1 pg/μL； 6:鯉春病毒血癥病毒核酸 100 fg/μL.

2.6 實(shí)際樣品的檢測(cè)

鯉春病毒血癥病毒陽性檢出樣品數(shù)量：焦磷酸測(cè)序檢測(cè)方法與常規(guī)RT-PCR方法檢測(cè)結(jié)果相同，共計(jì)9批陽性，常規(guī)RT-PCR方法9批陽性，其中弱陽性2批。除2批RT-PCR弱陽性樣品外，其余RT-PCR檢出陽性樣品均經(jīng)測(cè)序確證為鯉春病毒血癥病毒陽性。陽性檢出樣品涉及兩種被采樣魚品種。檢測(cè)結(jié)果見表2。

表2 鯉春病毒血癥病毒焦磷酸測(cè)序檢測(cè)方法與常規(guī)RT-PCR檢測(cè)結(jié)果

(續(xù)表2)

編號(hào)采樣地點(diǎn)樣品名稱檢測(cè)結(jié)果焦磷酸測(cè)序RT-PCR38廣州草魚--39廣州草魚--40廣州草魚--41廈門黃顙魚--42廈門黃顙魚--43廈門黃顙魚--44廈門黃顙魚--45廈門黃顙魚--46廈門黃顙魚--47廈門黃顙魚--48廈門黃顙魚--49廈門黃顙魚--50廈門黃顙魚--51南昌鯉魚++(弱陽)52南昌鯉魚--53南昌鯉魚--54南昌鯉魚--55南昌鯉魚--56南昌鯉魚--57南昌鯉魚++58南昌鯉魚--59南昌鯉魚++60南昌鯉魚--61重慶鯉魚++62重慶鯉魚--63重慶鯉魚--64重慶鯉魚--65重慶鯉魚--66重慶鯉魚--67重慶鯉魚++68重慶鯉魚--69重慶鯉魚--70重慶鯉魚--71加拿大虹鱒--72加拿大虹鱒--73加拿大虹鱒--74加拿大虹鱒--75加拿大虹鱒--76加拿大虹鱒--77加拿大虹鱒--78加拿大虹鱒--79加拿大虹鱒--80加拿大虹鱒--

3 討 論

本試驗(yàn)建立了鯉春病毒血癥病毒的焦磷酸檢測(cè)方法，并對(duì)其進(jìn)行了反應(yīng)條件的優(yōu)化。該方法為國(guó)內(nèi)外首次建立鯉春病毒血癥病毒焦磷酸檢測(cè)技術(shù)。

3.1 焦磷酸測(cè)序檢測(cè)方法與傳統(tǒng)檢測(cè)方法的比較

世界動(dòng)物衛(wèi)生組織對(duì)于鯉春病毒血癥病毒推薦的檢測(cè)方法為病毒分離與RT-PCR方法。病毒分離需要建立合適的水生動(dòng)物細(xì)胞系，即使已有構(gòu)建好的細(xì)胞系，還需對(duì)細(xì)胞進(jìn)行傳代、凍存等操作。在進(jìn)行病毒分離時(shí)，需要將樣品溶液進(jìn)行倍比稀釋，每個(gè)稀釋度接種細(xì)胞，觀察7 d為一代。如果這一代細(xì)胞沒有出現(xiàn)細(xì)胞病變則需要盲傳第二代，還需觀察7 d。病毒分離方法總計(jì)需要約14 d的時(shí)間，操作繁瑣，周期較長(zhǎng)，不適合口岸對(duì)大量進(jìn)出境水生動(dòng)物快速檢疫的需求。

對(duì)于RT-PCR方法來說，由于靈敏度有限及其引物在擴(kuò)增時(shí)可能產(chǎn)生錯(cuò)配導(dǎo)致非特異性結(jié)合，檢測(cè)結(jié)果會(huì)存在假陽性、假陰性和非特異性擴(kuò)增，為保證結(jié)果的準(zhǔn)確性，世界動(dòng)物衛(wèi)生組織和我國(guó)出入境檢驗(yàn)檢疫行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)明確規(guī)定需要對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序需要送到專門的生物公司，檢測(cè)周期較長(zhǎng)。本研究建立的焦磷酸方法耗時(shí)短，一般3～4 h就可以出結(jié)果，并且以具體序列為檢測(cè)結(jié)果，這杜絕了假陽性的出現(xiàn)。本研究利用建立的鯉春病毒血癥病毒焦磷酸檢測(cè)方法對(duì)我國(guó)國(guó)內(nèi)養(yǎng)殖魚與進(jìn)口魚80份樣本進(jìn)行檢測(cè)，涉及鯉魚、草魚、黃顙魚、大菱鲆、虹鱒等多個(gè)品種，進(jìn)行了鯉春病毒血癥病毒的檢測(cè)，草魚曾經(jīng)在我國(guó)出口魚類養(yǎng)殖業(yè)中占據(jù)重要地位，而鯉魚是近些年常有疫病檢出的主要宿主魚。將檢測(cè)結(jié)果與世界動(dòng)物衛(wèi)生組織推薦的常規(guī)RT-PCR方法相對(duì)比，結(jié)果可以看出，焦磷酸方法對(duì)于常規(guī)RT-PCR方法的弱陽性樣品樣本有明顯的檢出，且檢測(cè)結(jié)果與PCR方法完全一致，因而可以有效的證明，焦磷酸方法的高靈敏度是有效的，避免了假陽性檢出。而常規(guī)PCR檢測(cè)方法檢出的弱陽性樣品，由于不能滿足測(cè)序?qū)颖竞康囊?，因而不能進(jìn)行有效測(cè)序，參照世界動(dòng)物衛(wèi)生組織水生動(dòng)物疫病診斷手冊(cè)和我國(guó)檢驗(yàn)檢疫行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)，由于不能進(jìn)行有效測(cè)序，因而不能作為疫病陽性檢出確診的依據(jù)。

3.2 焦磷酸檢測(cè)方法的核心設(shè)計(jì)

焦磷酸測(cè)序方法的核心是設(shè)計(jì)特異性的測(cè)序引物與指紋序列。據(jù)文獻(xiàn)所述[13]，焦磷酸測(cè)序時(shí)，測(cè)序引物5′末端特異性無嚴(yán)格要求，而3′段需要與目的核酸序列完全互補(bǔ)。本研究所設(shè)計(jì)的測(cè)序引物的5′末端與3′末端DNA熔解溫度值一致，因而引物兩端可以同時(shí)與模板結(jié)合，具有一致性，有利于提高檢測(cè)的準(zhǔn)確率。指紋序列的設(shè)計(jì)需要通過比對(duì)病毒各個(gè)基因的序列，選擇最為保守的一段序列。因?yàn)榻沽姿釡y(cè)序技術(shù)不能測(cè)過長(zhǎng)的片段，指紋序列應(yīng)該選擇20 bp以內(nèi)的長(zhǎng)度。

本研究建立的焦磷酸測(cè)序技術(shù)結(jié)合PCR的靈敏度和DNA測(cè)序技術(shù)的精確度兩方面的優(yōu)勢(shì)，測(cè)序引物與指紋序列高度保守的情況下，對(duì)一段短序列進(jìn)行測(cè)序，檢測(cè)結(jié)果直觀可見、操作簡(jiǎn)便、檢測(cè)周期短。

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DevelopmentofPyrosequencingMethodforDetectingSpringViremiaofCarpVirus

LIU Yao1，YIN Weili2，ZHANG Sihua3，YUE Zhiqin4，SUN Tao4

( 1. Rongcheng Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau，Rongcheng 264300，China；2. Inspection and Quarantine Center of Yantai Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau，Yantai 264000，China；3.Wuhan Center For Animal Disease Control and Prevention，Wuhan 430003，China；4. Technical Center of Shandong Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau, Qingdao 266002，China )

By collecting the sequences of spring viremia of carp virus (SVCV), the fingerprint sequences and the sequencing primers of the virus were designed and the pyrosequencing method for detection of SVCV was established successfully. The specificity and sensitivity of the method is well, which can specifically identify the objective virus in the eight fish viruses. The method has highly sensitivity and the minimum nucleic acid detection limit of 10 pg/μL. The method was verified by the detection of SVCV in 80 batches of the samples collected from domestic and imported fishes. The results indicate that the pyrosequencing method can effectively detect the false negative and weakly positive samples, while the traditional method RT-PCR cannot detect them in these situations. The specificity and sensitivity of the method meet the requirement for detection of aquatic animal diseases.

spring viremia of carp virus(SVCV); pyrosequencing; detection

10.16378/j.cnki.1003-1111.2017.04.008

S948

A

1003-1111(2017)04-0449-07

2016-07-01；

2016-09-23.

國(guó)家質(zhì)檢總局科研項(xiàng)目(2015IK195).

劉瑤(1980—)女，工程師；研究方向：海水養(yǎng)殖. E-mail: 13561863668@163.com.通訊作者：尹偉力(1982—)男，高級(jí)獸醫(yī)師；研究方向：獸醫(yī)學(xué). E-mail: vi123vi@163.com.