基于COⅠ序列絨螯蟹屬DNA條形碼和遺傳多樣性研究

徐 潔，王曉梅，李晶晶，陳 池，李轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)，張玲穎

( 1. 天津農(nóng)學(xué)院 水產(chǎn)學(xué)院，天津市水產(chǎn)生態(tài)及養(yǎng)殖重點(diǎn)實驗室，天津 300384；2.天津市水生動物疫病預(yù)防控制中心，天津 300402 )

基于COⅠ序列絨螯蟹屬DNA條形碼和遺傳多樣性研究

徐 潔1，王曉梅1，李晶晶2，陳 池1，李轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)1，張玲穎1

( 1. 天津農(nóng)學(xué)院 水產(chǎn)學(xué)院，天津市水產(chǎn)生態(tài)及養(yǎng)殖重點(diǎn)實驗室，天津 300384；2.天津市水生動物疫病預(yù)防控制中心，天津 300402 )

對絨螯蟹屬的中華絨螯蟹如東和七里海群體、日本絨螯蟹、合浦絨螯蟹及狹顎絨螯蟹共80條線粒體COⅠ片段進(jìn)行擴(kuò)增和測序，并與GenBank中絨螯蟹屬的臺灣絨螯蟹2條和近方蟹屬的絨毛近方蟹19條COⅠ 基因序列進(jìn)行聯(lián)配分析。結(jié)果顯示，101條序列包含44種單倍型，序列組成表現(xiàn)明顯的堿基偏倚性。中華絨螯蟹如東、七里海群體與日本絨螯蟹間的遺傳距離分別為1.210%和1.078%，明顯低于COⅠ基因DNA條形碼鑒別種的遺傳距離為2%的閾值，表明中華絨螯蟹和日本絨螯蟹為同一物種；而合浦絨螯蟹與中華絨螯蟹如東和七里海群體及與日本絨螯蟹的遺傳距離分別為4.823%、5.101%以及5.011%，明顯大于2%的鑒別閾值，說明合浦絨螯蟹為獨(dú)立的種。以絨毛近方蟹為外群，基于群體內(nèi)及群體間的遺傳距離構(gòu)建的鄰接樹顯示，中華絨螯蟹與日本絨螯蟹聚在一起，合浦絨螯蟹則聚成單系。本文測序的5個群體除狹顎絨螯蟹外，其余均具有遺傳多樣性，單倍型多樣性為0.593±0.144～0.779±0.068，核苷酸多樣性為0.00156～0.01336；此外，中華絨螯蟹如東群體與日本絨螯蟹、合浦絨螯蟹和中華絨螯蟹七里海群體分別共享單倍型H1、H2和H3，說明這些蟹類可能有種質(zhì)資源混雜或是遺傳污染的現(xiàn)象。

絨螯蟹；COⅠ基因；DNA條形碼；物種鑒定；遺傳多樣性

絨螯蟹屬(Eriocheir)隸屬于節(jié)肢動物門、甲殼動物亞門、軟甲綱、十足目、方蟹科。對于絨螯蟹屬內(nèi)種的分類一直存在爭議[1-6]，但學(xué)者們較為公認(rèn)的觀點(diǎn)是該屬包含5個物種，即中華絨螯蟹(E.sinensis)、日本絨螯蟹(E.japonica)、合浦絨螯蟹(E.hepuensis)、狹顎絨螯蟹(E.leptognathus)和臺灣絨螯蟹(E.formosa)[7-10]。這些蟹類不僅形態(tài)特征有差異，地理分布各不相同，其經(jīng)濟(jì)價值也有區(qū)別；其中以中華絨螯蟹的經(jīng)濟(jì)價值最高，日本絨螯蟹與合浦絨螯蟹次之，這三種蟹俗稱均為河蟹[10-11]。自20世紀(jì)70年代起，全國的河蟹養(yǎng)殖業(yè)蓬勃發(fā)展，河蟹的天然苗種不能滿足人工養(yǎng)殖的需求，需要從各地引進(jìn)河蟹苗種，從而導(dǎo)致種質(zhì)資源混雜和遺傳污染。

DNA條形碼是利用一段種內(nèi)較為保守但種間存在明顯差異的DNA序列來鑒定物種的技術(shù)，現(xiàn)已成為物種鑒定的新興技術(shù)。由于線粒體COⅠ基因進(jìn)化速度較核DNA快，與其他基因序列如線粒體12S rRNA和16S rRNA 相比，很少發(fā)生缺失和插入，因此加拿大圭爾夫大學(xué)的Hebert等[12]極力主張將COⅠ基因作為動物物種鑒定的DNA條形碼，并于2003年首次提出將一段短的COⅠ基因序列作為動物物種鑒定的通用條形碼。COⅠ基因作為DNA條形碼在水產(chǎn)動物的物種鑒定和遺傳多樣性分析上得到廣泛應(yīng)用[13-20]，但對絨螯蟹的研究報道甚少[21]。

本文通過分析絨螯蟹樣本線粒體COⅠ基因序列，探討應(yīng)用DNA條形碼技術(shù)對絨螯蟹屬物種作進(jìn)一步鑒定，并分析絨螯蟹樣本的遺傳多樣性，以期積累絨螯蟹DNA條形碼數(shù)據(jù)，為了解絨螯蟹種質(zhì)資源的變化以及為絨螯蟹種質(zhì)資源的保護(hù)和開發(fā)與利用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗所用的絨螯蟹樣本除中華絨螯蟹七里海群體為天津市水生動物疫病預(yù)防控制中心于天津市蟹源水產(chǎn)養(yǎng)殖有限公司培育的第6代繁育群體外，其余樣本均為本實驗室采集的自然群體(表1為絨螯蟹樣本的采集信息)。樣本采集后，取附肢于95%的乙醇固定、4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 絨螯蟹樣本采集信息

1.2 DNA的提取、PCR擴(kuò)增及PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的測序

依據(jù)文獻(xiàn)[22]的方法略作改進(jìn)，提取樣本附肢肌肉組織的總體DNA。擴(kuò)增線粒體COⅠ基因片段的引物序列為：COⅠ-L(5′-GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG-3′)和COⅠ-H(5′-TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA-3′)。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。PCR反應(yīng)體系為25 μL，包括1×PCR buffer，2 mmol/L Mg2+，200 μmol/L dNTP，引物各0.4 μmol/L，Taq酶1.5 U，50～100 ng模板DNA。PCR反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃ 1 min，55 ℃ 1 min，72 ℃ 1.5 min，共35個循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min。

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，擴(kuò)增良好的產(chǎn)物經(jīng)純化后雙向測序。純化、測序由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。本研究測序的COⅠ基因片段序列經(jīng)GenBank的Blast在線比對(http://blast. ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)，確認(rèn)試驗所得序列為目的片段。

1.3 數(shù)據(jù)分析

自GenBank下載COⅠ基因片段長度等于或超過658 bp的方蟹科、近方蟹屬的絨毛近方蟹 (Hemigrapsuspenicillatus)19條序列和絨螯蟹屬的臺灣絨螯蟹的2條序列，與本研究測得的序列進(jìn)行聯(lián)配分析。

利用Clustal X 1.81軟件對所有序列進(jìn)行人工校正、序列對齊后，截取658 bp的序列進(jìn)一步分析。應(yīng)用DnaSP 5.1軟件分析群體的核苷酸多樣性指數(shù)、單倍型多樣性指數(shù)，多態(tài)位點(diǎn)、單突變位點(diǎn)和簡約信息位點(diǎn)；應(yīng)用MEGA 4.1軟件分析序列的堿基組成、堿基的轉(zhuǎn)換與顛換比(R值)、群體內(nèi)及群體間的遺傳距離(Kimura 2-parameter距離)，并依據(jù)群體內(nèi)及群體間遺傳距離、以絨毛近方蟹為外群，采用鄰接法構(gòu)建分子系統(tǒng)樹，系統(tǒng)樹分支的置信度采用自展法，重復(fù)檢測1000次。

2 結(jié)果與分析

2.1 線粒體COⅠ基因的序列特征

本研究獲得絨螯蟹屬5個群體共80個個體的COⅠ基因序列，去掉引物后長度為658 bp，與GenBank下載的COⅠ序列(21條)進(jìn)行聯(lián)配分析，101條序列未見插入和缺失現(xiàn)象。其堿基組成及位點(diǎn)變異分析表明所有序列均表現(xiàn)出明顯的堿基偏倚性，即CG含量(33.43%～38.22%)明顯低于AT含量(61.78%～66.57%)；除狹顎絨螯蟹外，所有群體的COⅠ序列均具有變異位點(diǎn)，且堿基轉(zhuǎn)換多于顛換(表2)。

表2 絨螯蟹和絨毛近方蟹COⅠ序列堿基組成及變異信息

2.2 單倍型分布及遺傳多樣性分析

本研究測序的絨螯蟹屬5個群體80條COⅠ序列中檢測到23種單倍型，既有群體特有的單倍型，也存在群體共享的單倍型(表3)。其中，中華絨螯蟹如東群體與日本絨螯蟹共享單倍型H1(共5個個體，占2個群體總數(shù)的14.3%)，與合浦絨螯蟹共享單倍型H2(共10個個體，占2個群體總數(shù)的27.8%)，與中華絨螯蟹七里海群體共享單倍型H3(共8個個體，占2個群體總數(shù)的17.8%)。GenBank下載的21條COⅠ序列中檢測到21種單倍型。每個群體單倍型種類、各種單倍型所包含的個體數(shù)及在群體中的比例見表3。

所有群體的遺傳多樣性分析結(jié)果顯示(表3)，狹顎絨螯蟹未檢測到遺傳多樣性，其余6個群體的單倍型多樣性指數(shù)為0.593±0.144～1.000±0.500，核苷酸多樣性指數(shù)為0.00152～0.04096。除狹顎絨螯蟹和臺灣絨螯蟹外，其他5個群體的Tajimas D中性檢驗范圍為-2.34216～-0.65889，除中華絨螯蟹如東群體外，其余4個群體的中性檢驗結(jié)果均不顯著(P>0.10)，符合分子水平的突變?yōu)橹行酝蛔儭?/p>

表3 44個單倍型在7個群體中的分布及序列多樣性

注：括號內(nèi)數(shù)字表示單倍型的樣本個體數(shù)，加粗字體表示共享單倍型；GenBank下載序列的檢索號見表2.

2.3 遺傳距離、R值與分子系統(tǒng)樹

應(yīng)用MEGA軟件得出群體內(nèi)或種內(nèi)的遺傳距離為：中華絨螯蟹如東群體和七里海群體分別為0.000%～5.408%和0.000%～0.766%，日本絨螯蟹為0.000%～4.920%，合浦絨螯蟹為0.000%～0.612%，臺灣絨螯蟹為0.152%，絨毛近方蟹為0.152%～16.594%。其平均值以及群體間或種間的遺傳距離的平均值和COⅠ序列堿基轉(zhuǎn)換與顛換的比值(R值)見表4。

表4 絨螯蟹屬和近方蟹屬不同分類階元的平均遺傳距離和R值

注：對角線處加粗?jǐn)?shù)字為種群內(nèi)或種內(nèi)平均遺傳距離(%)；對角線下為種群間或種間平均遺傳距離(%)；對角線上為COⅠ序列的R值.

由表4可知，基于COⅠ序列得出絨螯蟹屬群體內(nèi)或種內(nèi)的遺傳距離為0.000%～1.384%，均小于2%；絨螯蟹屬不同群體間或種間的遺傳距離明顯變大，為0.478%～16.932%；絨螯蟹屬6個群體與近方蟹屬絨毛近方蟹的遺傳距離為17.641%～18.621%。

以絨毛近方蟹為外群，依據(jù)群體內(nèi)及群體間遺傳距離，分別構(gòu)建44種單倍型和群體的鄰接系統(tǒng)樹(圖1和圖2)。構(gòu)建群體鄰接樹時，本研究測序的5個群體選取所含個體數(shù)最多的單倍型序列、而GenBank下載的臺灣絨螯蟹和絨毛近方蟹則各任選1條序列。由圖1可見，44種單倍型可分為兩大支系，一個支系為近方蟹屬的絨毛近方蟹，另一支系由絨螯蟹屬的6個群體構(gòu)成；在絨螯蟹屬支系中，合浦絨螯蟹、狹顎絨螯蟹和臺灣絨螯蟹又各自形成單系，但中華絨螯蟹如東群體、七里海群體和日本絨螯蟹沒能各自形成單系。本文分析的7個群體的親緣關(guān)系由近至遠(yuǎn)的順序是：中華絨螯蟹如東群體和七里海群體的親緣關(guān)系最近，之后是與日本絨螯蟹、合浦絨螯蟹、狹顎絨螯蟹、臺灣絨螯蟹和絨毛近方蟹(圖2)。

圖1 基于群體內(nèi)及群體間遺傳距離構(gòu)建的 COⅠ基因單倍型的鄰接樹樣本名稱中“-”后面的字母f表示雌性、m表示雄性，樣本名稱中的阿拉伯?dāng)?shù)字代表樣本號，括號內(nèi)的數(shù)字表示單倍型的種類.

圖2 基于群體內(nèi)及群體間遺傳距離建立的7個群體的鄰接樹

3 討 論

3.1 序列分析

COⅠ基因是線粒體DNA編碼細(xì)胞色素c氧化酶亞單位Ⅰ的基因，在蛋白質(zhì)編碼區(qū)，很少發(fā)生插入和缺失。本研究測序的5個絨螯蟹群體80個個體以及GenBank下載的臺灣絨螯蟹2個個體和絨毛近方蟹19個個體的線粒體COⅠ基因序列(658 bp)未發(fā)現(xiàn)堿基的插入與缺失。本研究分析的7個群體101條序列，除狹顎絨螯蟹外，均存在變異位點(diǎn)，因臺灣絨螯蟹只有2條序列所以僅有單突變位點(diǎn)，其余序列既有單突變位點(diǎn)又有簡約位點(diǎn)。在堿基替換上，中華絨螯蟹七里海群體、合浦絨螯蟹和臺灣絨螯蟹線粒體COⅠ序列不存在堿基顛換，只存在轉(zhuǎn)換；而中華絨螯蟹如東群體、日本絨螯蟹和絨毛近方蟹線粒體COⅠ序列既有堿基轉(zhuǎn)換又有顛換。在堿基組成上，所有序列均是T含量最高，除狹顎絨螯蟹外，G含量最低；AT含量明顯高于GC含量，該結(jié)果與COⅠ基因堿基組成中普遍存在的AT含量高于GC含量的現(xiàn)象一致[18,23-24]。

3.2 絨螯蟹屬物種的有效性

長期以來，絨螯蟹屬內(nèi)種及亞種的分類存在著較大的分歧。在日本絨螯蟹與中華絨螯蟹的分類上，Li等[25]應(yīng)用同工酶技術(shù)及形態(tài)學(xué)分析，認(rèn)為中華絨螯蟹是日本絨螯蟹的不同生態(tài)表型群體，應(yīng)一并稱之為日本絨螯蟹；戴愛云[2]通過形態(tài)學(xué)分析認(rèn)為日本絨螯蟹可能是中華絨螯蟹的一個亞種；孔曉瑜等[4]的研究結(jié)果顯示中華絨螯蟹與日本絨螯蟹COⅠ序列間差異較大，傾向于支持存在中華絨螯蟹和日本絨螯蟹兩個種或它們?yōu)橥环N的兩個地理亞種的觀點(diǎn)；張列士等[26]通過比較日本絨螯蟹與我國各水系中華絨螯蟹的形態(tài)特征發(fā)現(xiàn)日本絨螯蟹是具有獨(dú)立形態(tài)的種；孫紅英等[5]通過對線粒體16S rDNA序列進(jìn)行分析，認(rèn)為中華絨螯蟹、合浦絨螯蟹和日本絨螯蟹屬于同一個物種E.japonica；王茜等[27]通過形態(tài)學(xué)分析認(rèn)為中華絨螯蟹與日本絨螯蟹的差異應(yīng)在亞種以上水平。在合浦絨螯蟹的分類上，戴愛云[28]將合浦絨螯蟹定名為日本絨螯蟹合浦亞種；Guo等[1]的研究結(jié)果表明合浦絨螯蟹是一個獨(dú)立的物種；堵南山[7]認(rèn)為日本絨螯蟹合浦亞種很可能是日本絨螯蟹在南方地區(qū)的一個種群；謝浩等[3]采用RAPD技術(shù)對3種絨螯蟹的親緣關(guān)系進(jìn)行研究，結(jié)果表明合浦絨螯蟹與日本絨螯蟹、中華絨螯蟹之間差異顯著，認(rèn)為合浦絨螯蟹形態(tài)分類地位更接近日本絨螯蟹；李孟仙等[9]通過形態(tài)學(xué)研究認(rèn)為合浦絨螯蟹是絨螯蟹屬一個獨(dú)立的物種，并將其學(xué)名由“日本絨螯蟹合浦亞種”改為“合浦絨螯蟹”。

Costa等[21]對甲殼綱150個物種的DNA條形碼(基于線粒體COⅠ序列)的分析結(jié)果表明，基于Kimura雙參數(shù)模型計算的甲殼綱十足目動物種內(nèi)遺傳距離為0.00%～2.57%(平均值為0.46%)，86%的物種種內(nèi)遺傳距離低于1%；種間遺傳距離為4.92%[雪蟹屬(Chionoecete)]～31.39%[端足類鉤蝦屬(Gammarus)]，平均為17.16%；屬間的遺傳距離為11.27%～49.93%，平均為19.75%。

本研究通過DNA條形碼分析顯示，絨螯蟹屬的中華絨螯蟹如東群體和七里海群體、日本絨螯蟹、合浦絨螯蟹、狹顎絨螯蟹和臺灣絨螯蟹種內(nèi)平均遺傳距離分別為0.633%、0.276%、1.384%、0.157%、0.000%和0.152%。中華絨螯蟹如東群體與七里海群體間的平均遺傳距離為0.478%，與Costa等[21]對十足目動物種內(nèi)遺傳距離的研究結(jié)果基本相符。日本絨螯蟹與中華絨螯蟹如東群體、七里海群體間的平均遺傳距離分別為1.210%、1.078%，小于日本絨螯蟹群體內(nèi)的遺傳距離(1.384%)，均小于Hebert等[29]認(rèn)為以線粒體COⅠ基因為DNA條形碼的最小種間遺傳距離為2%的閾值；故本研究結(jié)果支持日本絨螯蟹與中華絨螯蟹同屬于一個物種的觀點(diǎn)。而合浦絨螯蟹與中華絨螯蟹如東群體、七里海群體和日本絨螯蟹間的平均遺傳距離分別為4.823%、5.101%、5.011%，明顯高于2%的閾值；因此，本研究支持合浦絨螯蟹為絨螯蟹屬一個獨(dú)立物種的觀點(diǎn)。此外，本研究中，絨螯蟹屬內(nèi)群體間的遺傳距離最小為0.478%(中華絨螯蟹如東群體與七里海群體)，最大為16.932%(狹顎絨螯蟹與臺灣絨螯蟹)；而絨螯蟹屬與近方蟹屬間的遺傳距離最小為17.641%(臺灣絨螯蟹與絨毛近方蟹)，最大為18.621%(狹顎絨螯蟹與絨毛近方蟹)。該結(jié)果與Costa等[21]對十足目動物種內(nèi)和種間遺傳距離的研究結(jié)果相符合。

以近方蟹屬的絨毛近方蟹為外群，基于群體內(nèi)及群體間的遺傳距離所構(gòu)建的群體鄰接樹顯示，中華絨螯蟹如東群體與中華絨螯蟹七里海群體的親緣關(guān)系最近，之后依次是與日本絨螯蟹、合浦絨螯蟹、狹顎絨螯蟹、臺灣絨螯蟹和絨毛近方蟹，絨螯蟹屬中與絨毛近方蟹親緣關(guān)系最近的物種是臺灣絨螯蟹。44種單倍型的鄰接樹顯示，絨螯蟹屬的6個群體聚成了3大分支，其中狹顎絨螯蟹和臺灣絨螯蟹各成一支；而中華絨螯蟹如東群體和七里海群體、日本絨螯蟹以及合浦絨螯蟹形成另一個分支，但在這一分支中，合浦絨鰲蟹又能夠單獨(dú)形成一支。這些結(jié)果表明，在分析的絨螯蟹樣本中，中華絨螯蟹和日本絨螯蟹親緣關(guān)系近，而與合浦絨螯蟹的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。

在DNA進(jìn)化過程中，堿基轉(zhuǎn)換發(fā)生的頻率要比顛換高得多，利用轉(zhuǎn)換與顛換比值，即R值，可以對序列的飽和度進(jìn)行分析，一般親緣關(guān)系越近的分類單元之間核苷酸發(fā)生顛換的頻率越低，表現(xiàn)為R值越大，由R值的大小可初步判斷所研究的分類單元之間的親緣關(guān)系[18]。本研究結(jié)果顯示，中華絨螯蟹七里海群體與日本絨螯蟹間的R值最大，表明兩者親緣關(guān)系最近；但中華絨螯蟹如東群體與七里海群體間的R值(9.96)小于中華絨螯蟹七里海群體與日本絨螯蟹間的R值(11.56)，可能與中華絨螯蟹如東群體存在物種混雜有關(guān)。理論上狹顎絨螯蟹與絨螯蟹其他群體間的R值應(yīng)比絨毛近方蟹與絨螯蟹其他群體間的R值要大，但本研究結(jié)果與之相反，不符合R值越大親緣關(guān)系越近這一規(guī)律，可能與狹顎絨螯蟹只具有一種序列單倍型有關(guān)，該問題今后將進(jìn)一步研究。

3.3 絨螯蟹屬物種的種質(zhì)資源

群體的核苷酸多樣性指數(shù)是衡量群體遺傳多樣性的重要指標(biāo)，核苷酸多樣性指數(shù)越大，群體的遺傳多樣性越高[30]。葛家春等[31]研究得出長江、遼河、甌江及其萊茵河4水系中華絨螯蟹樣本線粒體COⅠ序列的核苷酸多樣性指數(shù)分別為0.0028、0.0028、0.0243和0.0017，樣本總體的核苷酸多樣性指數(shù)為0.0169，認(rèn)為樣本總體的遺傳多樣性指數(shù)較高。閆龍等[32]分析得出采自丹東、盤錦、墾利和南京的4個群體中華絨螯蟹樣本的線粒體控制區(qū)的核苷酸多樣性指數(shù)分別為0.014、0.016、0.019和0.010，樣本總體的核苷酸多樣性指數(shù)為0.017；也指出分析樣本總體的遺傳多樣性指數(shù)較高。本研究測序的5個絨螯蟹群體的分析結(jié)果顯示，除狹顎絨螯蟹群體無多樣性外(核苷酸多樣性指數(shù)為0.00000)，日本絨螯蟹群體的多樣性最大(核苷酸多樣性指數(shù)為0.01336)，中華絨螯蟹如東群體次之(核苷酸多樣性指數(shù)為0.00612)，再次是中華絨螯蟹七里海群體(核苷酸多樣性指數(shù)為0.00275)，合浦絨螯蟹的多樣性最小(核苷酸多樣性指數(shù)為0.00156)。說明本研究的兩個中華絨螯蟹樣本具有一定的遺傳多樣性，且如東群體的遺傳多樣性高于七里海群體。群體的核酸序列單倍型多樣性指數(shù)是衡量群體遺傳多樣性的另一個指標(biāo)。本研究中出現(xiàn)了單倍型多樣性指數(shù)與核苷酸多樣性指數(shù)不一致的現(xiàn)象，如日本絨螯蟹的單倍型多樣性指數(shù)最小(0.593±0.144)，而核苷酸多樣性指數(shù)最大(0.01336)；中華絨螯蟹七里海群體單倍型多樣性指數(shù)最大(0.779±0.068)，但核苷酸多樣性指數(shù)較小(0.00275)。日本絨螯蟹的14個個體中多態(tài)位點(diǎn)數(shù)為33個、單倍型有5種，而七里海群體24個個體的序列多態(tài)位點(diǎn)為11個、單倍型有9種。楊帆等[17-18]的研究結(jié)果也顯示出單倍型多樣性和核苷酸多樣性不一致的現(xiàn)象。

本研究所測序的5個絨螯蟹群體，單倍型H4～H6為中華絨螯蟹如東群體所特有(占66.67%)，其中H6個體最多，占群體的57.14%；H7～H14為中華絨螯蟹七里海群體所特有(占75%)，其中H8個體最多，占群體的41.67%；H15～H18為日本絨螯蟹所特有(占92.86%)，其中H15個體最多，占群體的64.29%；H19～H22為合浦絨螯蟹所特有(占40%)；H23為狹顎絨螯蟹所特有(占100%)。在上述5個群體同時存在單倍型共享現(xiàn)象，中華絨螯蟹如東群體和日本絨螯蟹共享單倍型H1，該單倍型在如東群體占19.05%，而在日本絨螯蟹中占7.14%；中華絨螯蟹如東群體和合浦絨螯蟹共享單倍型H2，該單倍型在如東群體占4.76%，而在合浦絨螯蟹占60%；中華絨螯蟹如東群體與七里海群體共享單倍型H3，該單倍型在如東群體占9.52%，而在七里海群體占25%。由此推測中華絨螯蟹、日本絨螯蟹和合浦絨螯蟹的種質(zhì)資源存在混雜現(xiàn)象。邱高峰等[33]基于線粒體16S rDNA序列的研究結(jié)果表明，各個不同地域的中華絨螯蟹混雜在一起。孫紅英等[34]基于線粒體16S rDNA的PCR-RFLP和線粒體Cyt b序列分析顯示，長江水系中華絨螯蟹樣品中檢測出合浦亞種單元型，說明了中華絨螯蟹與合浦絨螯蟹存在種質(zhì)資源混雜現(xiàn)象。葛家春等[31]基于線粒體COⅠ序列以及閆龍等[32]基于線粒體控制區(qū)的序列分析，也證明各水系中華絨螯蟹種質(zhì)資源混雜確實存在。

由于絨螯蟹養(yǎng)殖的推廣，長江蟹苗的管理難度越來越大，再加之不注意保護(hù)親蟹資源，從各地引進(jìn)蟹苗，導(dǎo)致長江水系中華絨螯蟹養(yǎng)殖遺傳污染和種質(zhì)資源混雜及退化[35-37]。因此應(yīng)加強(qiáng)對長江水系中華絨螯蟹種質(zhì)資源的保護(hù)，以保護(hù)中華絨螯蟹的遺傳多樣性。

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DNABarcodingandGeneticDiversityinGenusEriocheirBasedonCOⅠGeneSequences

XU Jie1, WANG Xiaomei1, LI Jingjing2, CHEN Chi1, LI Zhuanzhuan1, ZHANG Lingying1

( 1.Tianjin Key Laboratory of Aqua-Ecology & Aquaculture, College of Fisheries, Tianjin Agricultural University, Tianjin 300384, China; 2. Tianjin Diseases Prevention and Control Centre of Aquatic Animals, Tianjin 300221, China )

A total of 80 mitochondrial COⅠ gene fragments from fiveEriocheirpopulations includingE.sinensisRudong and Qilihai populations,E.japonica,E.hepuensisandE.leptognathuswere amplified and sequenced, and then the 80 sequences were compared with that of 2 COⅠ gene sequences ofE.formosaand 19 COⅠ sequences ofHemigrapsuspenicillatusrecorded in GenBank. In this study, 44 haplotypes were detected from 101 individuals, and the base composition of sequences showed a significant bias. Based on the analysis of COⅠ gene sequences, the K2P distances betweenE.sinensisRudong population, Qilihai population andE.japonica, being 1.210% and 1.078%, respectively, were significant lower than 2%, which is the threshold of the DNA barcoding species identification, indicating thatE.sinensisandE.japonicawere the same species. However, the K2P distances betweenE.hepuensisand the twoE.sinensispopulations as well asE.japonicawere 4.823%, 5.101% and 5.011%, respectively, which were far beyond 2%, indicating thatE.hepuensiswas an independent species. UsingH.penicillatusas out group, based on K2P distances, neighbor-joining (NJ) method was employed for phylogenetic analysis. NJ trees revealed thatE.sinensisandE.japonicadid not form monophyletic clades, but disturbed, disorderly, whereasE.hepuensiswas clustered into a single branch. Five populations sequenced in our study, with the exception ofE.leptognathus, the rest 4 populations had genetic diversity, the haplotype diversity ranged from 0.593±0.144 to 0.779±0.068 and the nucleotide diversity ranged from 0.00156 to 0.01336. TheE.sinensisRudong population shared the haplotypes H1, H2 and H3 withE.japonica,E.hepuensisandE.sinensisQilihai population, respectively, which suggested that the germplasm resources of the economic crabs were mixed or the phenomenon might be due to the genetic pollution.

Eriocheir; COⅠ gene; DNA barcode; species identification; genetic diversity

10.16378/j.cnki.1003-1111.2017.04.013

Q783

A

1003-1111(2017)04-0480-08

2016-05-31；

2016-08-19.

天津市水產(chǎn)局科技發(fā)展計劃項目(J2013-21).

徐潔(1993-)，女，本科生；研究方向：水產(chǎn)養(yǎng)殖學(xué)．E-mail：xujie19937@163.com． 通訊作者：王曉梅(1962-)，女，教授；研究方向：水產(chǎn)動物遺傳育種及分子生物學(xué)．E-mail：xiaomeiw@tjau.edu.cn．