HBVrt A181T/V突變慢乙肝患者的抗病毒治療史、血清學特點及恩替卡韋挽救治療效果觀察

薛艷，王磊，張立新，劉峰，曲云東，楊保華，李濤，王巖，葉茜，高林

(山東大學第二醫(yī)院，濟南250033)

·論著·

HBVrt A181T/V突變慢乙肝患者的抗病毒治療史、血清學特點及恩替卡韋挽救治療效果觀察

薛艷，王磊，張立新，劉峰，曲云東，楊保華，李濤，王巖，葉茜，高林

(山東大學第二醫(yī)院，濟南250033)

目的觀察HBV逆轉錄酶區(qū)181位點T/V突變(HBV rtA181T/V)患者的抗病毒治療史、血清學特點、恩替卡韋挽救治療效果。方法連續(xù)入組71例已經(jīng)出現(xiàn)病毒學突破的核苷(酸)類似物(NAs)耐藥乙肝患者。均采用直接測序法行HBV測序，且證實存在HBV rtA181T/V，其中HBV rtA181T突變41例、HBV rtA181V突變30例?；仡?1例患者的NAs用藥史。檢測并比較rtA181T、rtA181V患者出現(xiàn)病毒學突破時的血清ALT、HBsAg、HBV-DNA水平。所有患者采用恩替卡韋為主的挽救方案治療，比較rtA181T、rtA181V患者治療24、52周時的病毒學應答情況。結果71例患者中既往應用單一NAs者為25例(以阿德福韋酯為主)，序貫或聯(lián)合應用多種NAs者46例。HBV rtA181T、rtA181V患者病毒學突破時中位血清ALT水平分別為55(15，474)、49(16，183)U/L,P>0.05;血清HBV-DNA的log10分別為5.71±1.02、6.04±0.97，P>0.05；血清HBsAg的log10分別為3.36±0.50、3.64±0.60，P<0.05。用以恩替卡韋為主的挽救方案治療24周，病毒學完全應答55例(77.5%)，病毒學不完全應答16例(22.5%)，其中HBV rtA181T、rtA181V患者分別有33(80.5%)、22例(73.3%)達到病毒學完全應答，HBV rtA181T、rtA181V患者病毒學完全應答率相比P>0.05；治療52周時病毒學完全應答62例(87.3%)，病毒學不完全應答9例(12.7%)，其中HBV rtA181T、rtA181V患者分別有37(90.2%)、25例(83.3%)達到病毒學完全應答，HBV rtA181T、rtA181V患者病毒學完全應答率相比P>0.05。結論HBV rtA181T/V突變患者多為序貫或聯(lián)合應用阿德福韋酯及拉米夫定等多種NAs。HBV rtA181V患者發(fā)生病毒學突破時血清HBsAg水平高于HBV rtA181T患者。HBV rtA181T/V突變患者應用恩替卡韋挽救治療效果滿意，但HBV rtA181T、rtA181V患者治療效果比較無統(tǒng)計學差異。

慢性乙型肝炎；乙型肝炎病毒；基因突變；逆轉錄酶區(qū)；拉米夫定；阿德福韋酯；替比夫定；恩替卡韋；病毒學應答

慢性乙型肝炎(慢乙肝)治療的關鍵是抗病毒治療。通過抗病毒治療可以持續(xù)抑制患者HBV復制，延緩患者病情進展，減少肝臟失代償、肝硬化、原發(fā)性肝細胞癌及其他并發(fā)癥的發(fā)生。核苷(酸)類似物(NAs)是慢乙肝抗病毒最重要的一類藥物，具有抑制病毒效力強、安全性好、適應證廣、價格低廉等優(yōu)點[1]，既往常用的有拉米夫定、阿德福韋酯、替比夫定等。然而，長期使用拉米夫定、阿德福韋酯、替比夫定等NAs抗病毒治療會誘導乙肝患者體內(nèi)的HBV發(fā)生耐藥突變，導致病毒學突破而發(fā)生耐藥[2]，這是NAs長期抗病毒治療失敗的重要因素之一。HBV逆轉錄酶區(qū)181位點突變是比較常見的耐藥突變之一，目前此類患者的NAs抗病毒治療史有何特點尚不明確。HBV逆轉錄酶區(qū)181位點突變有A→T突變(rtA181T)和A→V突變(rtA181V)兩種突變模式。HBV rtA181T、rtA181V患者發(fā)生病毒學突破時HBV的血清學特點(抗原性、復制能力、毒力)及患者應用恩替卡韋挽救治療的效果是否存在差異尚不清楚。為了解決上述問題，本研究回顧了出現(xiàn)HBV逆轉錄酶區(qū)A181位點突變患者NAs抗病毒治療史的特點，并比較了HBV rtA181T、rtA181V突變患者發(fā)生病毒學突破時的血清ALT、HBV DNA、HBsAg水平，以及用恩替卡韋挽救治療24 、52周時的病毒學應答情況。現(xiàn)報告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 連續(xù)入組山東大學第二醫(yī)院肝病科2009年10月～2016年7月收治的門診及住院慢乙肝及相關肝硬化患者?；颊呔现袊堵砸倚透窝追乐沃改稀?005版中的慢乙肝或乙肝肝硬化診斷標準，有明確的NAs抗病毒治療史，均已出現(xiàn)病毒學突破(患者治療依從性好、堅持抗病毒治療的情況下，血清HBV-DNA的log10值相比最低點上升1，或陰轉陽，相隔1個月后用相同試劑重復檢測仍如此)。HBV測序(由上海鉑誼生物科技有限公司采用PCR產(chǎn)物直接測序法完成)發(fā)現(xiàn)rtA181T或rtA181V突變。排除同時感染甲、丙、丁、戊型肝炎病毒或者人類免疫缺陷病毒者，合并肝細胞癌、肝衰竭等終末期肝病者，合并藥物性肝炎、酒精性肝炎、自身免疫性肝病或其他未知原因引起的肝功能異常者。共入組71例患者，其中男62例、女9例，年齡22～71歲、中位年齡42歲。28例合并肝硬化。其中rtA181T患者41例、rtA181V患者30例。本研究已獲山東大學第二醫(yī)院倫理委員會批準，患者均已簽署知情同意書。

1.2 NAs抗病毒治療史調(diào)查方法 回顧患者臨床資料，收集患者NAs應用情況。

1.3 血清HBV DNA、HBsAg、ALT的檢測方法 抽取入組患者病毒學突破時及再治療4、12、24、52周時靜脈血5 mL,分離血清，統(tǒng)一送山東大學第二醫(yī)院檢驗科檢測HBV DNA、HBsAg、ALT等生化值。采用美國Applied Biosystems的ABi7000實時PCR擴增儀檢測HBV DNA，試劑盒購自北京鑫諾美迪檢測技術有限公司，檢測下限為1 000 copies/mL。采用美國Abbott的ARCHITCT i2000型HBV血清標記物的定量檢測儀及配套試劑盒檢測血清HBsAg，采用日本HITACHI公司生產(chǎn)的7170A全自動生物化學分析儀及配套試劑檢測血清ALT。

1.4 恩替卡韋挽救治療及效果評價方法 根據(jù)《慢性乙型肝炎防治指南》2005版，所有患者采用以恩替卡韋為主的抗病毒治療方案，其中57例患者用單一恩替卡韋0.5 mg，1次/d口服，14例患者用恩替卡韋0.5 mg 聯(lián)合阿德福韋酯10 mg，1次/d口服。隨訪至少52周。治療24、52周時檢測血清HBV-DNA，方法同1.3。血清HBV-DNA低于檢測下限(即測不出)為完全病毒學應答；血清HBV- DNA值的log10較病毒學突破時下降2以上但仍可以檢測到為病毒學不完全應答，其余情況為病毒學無應答。

2 結果

2.1 NAs抗病毒治療史 71例患者中46例(64.79%)曾采用序貫或聯(lián)合應用多種 NAs抗病毒治療，其中主要為以下三種模式：序貫應用拉米夫定及阿德福韋酯15例、拉米夫定耐藥后采用拉米夫定聯(lián)合阿德福韋酯14例、阿德福韋酯耐藥后采用拉米夫定聯(lián)合阿德福韋酯11例。25例(35.21%)患者既往采用單一NAs抗病毒治療，其中22例采用阿德福韋酯，3例采用拉米夫定。

2.2 病毒學突破時間的血清ALT、HBV DNA、HBsAg水平 HBV rtA181T、rtA181V患者病毒學突破時血清ALT、HBV DNA、HBsAg水平見表1。HBV rtA181T、rtA181V患者病毒學突破時血清ALT、HBV-DNA相比P均>0.05； HBV rtA181V患者血清HBsAg水平高于HBV rtA181T患者(P均<0.05)。

表1 HBV rtA181T、rtA181V患者病毒學突破時血清ALT、HBV DNA、HBsAg、ALT水平比較

注：與rtA181T組相比，*P<0.05。

2.3 恩替卡韋挽救治療效果 用以恩替卡韋為主的挽救治療方案治療24周，病毒學完全應答55例(77.5%)，病毒學不完全應答16例(22.5%)，其中HBV rtA181T、rtA181V患者分別有33(80.5%)、22例(73.3%)達到病毒學完全應答，HBV rtA181T、rtA181V患者病毒學完全應答率相比P>0.05；治療52周時病毒學完全應答62例(87.3%)，病毒學不完全應答9例(12.7%)，其中HBV rtA181T、rtA181V患者分別有37例(90.2%)、25例(83.3%)達到病毒學完全應答，HBV rtA181T、rtA181V患者病毒學完全應答率相比P>0.05。

3 討論

Yeh等[4]對23例拉米夫定抗病毒治療失敗患者進行HBV基因測序時首次發(fā)現(xiàn)了3例rtA181T突變。一些臨床實驗證實，rtA181T變異與NAs耐藥相關。阿德福韋酯上市前的臨床實驗研究[5]發(fā)現(xiàn)有3例患者出現(xiàn)了rtA181V耐藥突變。替比夫定的全球性臨床研究[6]也發(fā)現(xiàn)在治療應答不佳的患者中，有16例患者HBV出現(xiàn)了rtA181T突變。國內(nèi)的一些臨床研究[7,8]也發(fā)現(xiàn)了拉米夫定及阿德福韋酯治療可以誘發(fā)rtA181位點突變，部分rtA181突變還同時伴有rtL180M或者rtN236T的變異，給這部分患者的再治療增加了難度。邵幼林等[9]研究了阿德福韋酯初治耐藥和阿德福韋酯挽救治療拉米夫定耐藥者再耐藥時HBV毒株逆轉錄酶區(qū)基因突變情況，結果也發(fā)現(xiàn)了rtA181V突變。這些研究結果說明拉米夫定、阿德福韋酯、替比夫定抗病毒治療可以誘發(fā)HBV逆轉錄酶區(qū)181位點基因突變，進而導致HBV對上述NAs耐藥。本研究71例NAs耐藥患者中46例既往序貫或聯(lián)合應用多種NAs抗病毒治療，說明HBV逆轉錄酶區(qū)181位點T/V突變主要是聯(lián)合應用多種NAs抗病毒治療導致的，與姬粉芝等[8]研究結果一致，提示臨床工作者在用NAs行慢乙肝抗病毒治療時，當既往應用拉米夫定、阿德福韋酯、替比夫定的患者考慮存在耐藥突變，需調(diào)整抗病毒方案時，應先行HBV基因測序明確HBV逆轉錄酶區(qū)181位點基因突變情況，并根據(jù)結果選擇合適治療方案。

HBV逆轉錄酶區(qū)181位點氨基酸丙氨酸(A)的編碼堿基為GCT，當?shù)谝晃粔A基G變異為A后，181為氨基酸變異為蘇氨酸(T)，產(chǎn)生rtA181T突變；當?shù)诙粔A基C變異為T后，181位氨基酸變異為纈氨酸(V)，產(chǎn)生rtA181V變異。由于在HBV基因組中，病毒聚合酶編碼基因與包膜蛋白編碼基因(S) 的開放讀碼框存在重疊，S基因完全被聚合酶基因覆蓋，核苷(酸)類似物治療誘導的聚合酶編碼基因的耐藥突變，可能使HBsAg的S基因發(fā)生，從而導致HBsAg抗原性、結構或病毒適應性發(fā)生變化，產(chǎn)生免疫逃逸突變株等[10，11]。rtA181T變異可引起S基因第172位氨基酸由色氨酸突變成終止密碼子，生成截短的S蛋白[12]；體外的細胞實驗已經(jīng)證實rtA181T變異后截短的HBsAg糖基化程度降低，不能分泌出細胞，導致細胞內(nèi)HBsAg、HBV-DNA聚集和血清HBsAg、HBV-DNA降低[12]。rtA181V則引起S基因第173位氨基酸由亮氨酸變異為苯丙氨酸，但不會影響HBV表達HBsAg和HBV-DNA。本研究結果顯示，rtA181T患者血清HBsAg水平低于rtA181V患者，與上述研究結果相符合。但本研究中rtA181T、rtA181V 患者血清ALT水平比較差異無統(tǒng)計學意義，提示rtA181T、rtA181V HBV病毒株毒力差異不大，此結論是否在正確有待進一步大樣本量的研究驗證。rtA181T患者血清HBV-DNA水平低于rtA181V患者，但二者比較差異無統(tǒng)計學意義，可能與本研究樣本量較小有關。發(fā)生rtA181T、rtA181V突變后，HBV的復制能力往往下降，應用NAs挽救治療患者仍可獲得病毒學應答[13]。我國慢乙肝患者的抗病毒治療，存在許多不規(guī)范的情況，包括隨意序貫治療，頻繁換藥、加藥及隨意停藥等，這些不規(guī)范治療的后果將造成患者出現(xiàn)HBV耐藥，增加了治療的復雜性和難度。目前對HBV rtA181T/V耐藥患者的再治療干預，尚無循證醫(yī)學證據(jù)推薦最佳的方案，也無臨床實驗對目前的治療方法進行評價，僅有一些臨床治療的經(jīng)驗報道。2009年歐洲肝病學會慢性乙型肝炎(CHB)臨床指南[14]提示rtAl81T/V耐藥突變株對恩替卡韋及替比夫定敏感性下降。Cho等[15]報道，存在rtAl81T/V突變的24例慢乙肝患者采用恩替卡韋聯(lián)合阿德福韋酯進行治療療效滿意。Patterson等[16]對拉米夫定和阿德福韋酯聯(lián)合治療失敗的患者換用或加用替諾福韋進行挽救治療，結果顯示療效滿意。本研究中對HBV rtA181T、rtA181V的NAs耐藥患者主要采取以恩替卡韋為主的再治療方法，結果顯示大部分患者于治療24周及52周時都取得了完全病毒學應答，效果滿意，且HBV rtA181T、rtA181V患者治療24、52周時病毒學完全應答率比較差異無統(tǒng)計學意義，說明對已經(jīng)明確存在HBV rtA181T/V突變的NAs耐藥慢乙肝患者，可以選用恩替卡韋單藥或聯(lián)合阿德福韋酯作為挽救治療好方案，且有較好的治療效果。但本研究樣本量不大，今后還需繼續(xù)積累病例資料。

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Antiviraltherapyhistory,serologicalcharacteristics,andentecavirsalvagetherapeuticeffectinHBVrtA181T/VmutantpatientswithchronichepatitisB

XUEYan,WANGLei,ZHANGLixin,LIUFeng,QUYundong,YANGBaohua,LITao,WANGYan,YEQian,GAOLin

(TheSecondHospitalofShandongUniversity,Jinan250033,China)

ObjectiveTo observe the history of antiviral therapy, serological characteristics, and entecavir salvage therapeutic effect in the hepatitis B virus (HBV) reverse transcriptase (RT) 181 site T/V mutant patients with chronic hepatitis B.MethodsSeventy-one patients with virological breakthrough of nucleoside (acid) analogues (NAs)-resistant hepatitis B were continuously enrolled. Using direct sequencing for HBV sequencing, and we confirmed the presence of HBV reverse transcriptase region 181 site mutation of T/V, including 41 cases of HBV reverse transcriptase region 181 site mutation of T (rtA181T), and 30 cases of HBV reverse transcriptase region 181 site mutation of V (rtA181V). The medication history of NAs in 71 patients was reviewed. The levels of serum ALT, HBsAg, and HBV-DNA were detected and compared in rtA181T and rtA181V patients during virological breakthrough. All patients were treated with entecavir-based antiviral therapy, and then we compared the virological response of rtA181T and rtA181V patients at 24 and 52 weeks.ResultsOf the 71 patients, 25 patients were treated with a single antiviral drug (adefovir dipivoxil), and 46 patients with sequential or combined use of multiple NA. When the HBV rtA181T and rtA181V patients had virological breakthrough, the levels of serum ALT were 55 (15, 474) and 49 (16,183) U/mL, respectively,P>0.05; the log10 of HBV-DNA were 5.71±1.02 and 6.04±0.97, respectively,P<0.05; the log10 of serum HBsAg were 3.36±0.50 and 3.64±0.60,P<0.05. Salvage therapy with entecavir was mainly for 24 weeks. The complete virologic response was found in 55 cases (77.5%), including 33 cases (80.5%) of HBV rtA181T patients and 22 cases (73.3%) of HBV rtA181V patients; incomplete virologic response was found in 16 cases (22.5%). After 52 weeks of treatment, the complete virologic response was found in 62 cases (87.3%), including 37 cases (90.2%) of HBV rtA181T patients and 25 cases (83.3%) of HBV rtA181V patients; incomplete virologic response was found in 9 cases (12.7%), and no significant difference was found in the virologic response between the HBV rtA181T and rtA181V patients (P>0.05).ConclusionsPatients with HBV rtA181T/V mutation are mostly treated with sequential or combined with adefovir dipivoxil, lamivudine and other NAs. Serum HBsAg is higher in HBV rtA181V patients than in patients with HBV rtA181T. The treatment effect of HBV rtA181T/V patients treated with entecavir salvage is satisfactory, but the treatment effect is not different between HBV rtA181T and HBV rtA181V patients.

chronic hepatitis B; hepatitis B virus; gene mutation; reverse transcriptase; lamivudine; adefovir dipivoxil; entecavir; telbivudine; virological response

山東省自然科學基金資助項目(ZR2014HL088);濟南市臨床醫(yī)學科技創(chuàng)新計劃(201506004)；山東大學第二醫(yī)院青年基金資助項目(Y2014010014)。

薛艷(1982-)，女，醫(yī)學碩士，主治醫(yī)師，主要研究方向：各種類型病毒性肝炎，脂肪性肝病，藥物性肝病，自身免疫性肝病等。E-mail: yoyoxue820308@126.com

王磊(1962-)，男，醫(yī)學博士，主任醫(yī)師，主要研究方向：各種類型病毒性肝炎，脂肪性肝病，藥物性肝病，自身免疫性肝病等。E-mail: wlcrb@sdu.edu.cn

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.40.001

R512.6

A

1002-266X(2017)40-0001-04

2017-04-09)