艾灸治療后帕金森病大鼠黑質(zhì)p-mtor、p-4EBP1及α-syn表達(dá)變化

王述菊，王琪，馬駿，余沛豪，王中明，王彬

(湖北中醫(yī)藥大學(xué)針灸骨傷學(xué)院/針灸治未病湖北省協(xié)同創(chuàng)新中心，武漢430065)

·基礎(chǔ)研究·

艾灸治療后帕金森病大鼠黑質(zhì)p-mtor、p-4EBP1及α-syn表達(dá)變化

王述菊，王琪，馬駿，余沛豪，王中明，王彬

(湖北中醫(yī)藥大學(xué)針灸骨傷學(xué)院/針灸治未病湖北省協(xié)同創(chuàng)新中心，武漢430065)

目的觀察艾灸治療對帕金森病大鼠黑質(zhì)磷酸化雷帕霉素靶蛋白(p-mtor)、磷酸化真核細(xì)胞起始因子4E結(jié)合蛋白1(p-4EBP1)及α-突觸核蛋白(α-syn)表達(dá)的影響，探討艾灸治療帕金森病的作用機(jī)制。方法健康雄性SD大鼠60只，隨機(jī)分為正常組、假手術(shù)組、帕金森病組、帕金森病艾灸組，每組15只。帕金森病組、帕金森病艾灸組采用頸背部皮下注射魚藤酮法制備帕金森病模型，假手術(shù)組注射等濃度不含魚藤酮的葵花油乳液，正常組不做處理。正常組、假手術(shù)組、帕金森病組不予艾灸；帕金森病艾灸組造模成功后選取足三里(雙側(cè))、關(guān)元、風(fēng)府穴施予艾灸治療，1次/d，每次10 min，7 d為1個療程，連續(xù)治療2個療程。然后對各組大鼠進(jìn)行行為學(xué)評分；Western blotting檢測各組大鼠黑質(zhì)p-mtor、p-4EBP1,免疫組化法檢測各組大鼠黑質(zhì)α-syn。結(jié)果帕金森病組大鼠行為學(xué)評分與正常組和假手術(shù)組相比明顯升高(P均lt;0.01)；帕金森病艾灸組大鼠行為學(xué)評分較帕金森病組顯著降低(Plt;0.01)。與正常組、假手術(shù)組相比，帕金森病組大鼠黑質(zhì)p-mtor、p-4EBP1、α-syn表達(dá)量明顯升高(P均lt;0.01)；與帕金森病組相比，帕金森病艾灸組大鼠黑質(zhì)p-mtor、p-4EBP1、α-syn表達(dá)量明顯下降(P均lt;0.01)。結(jié)論艾灸足三里、關(guān)元、風(fēng)府穴治療帕金森病的作用機(jī)制可能是抑制了雷帕霉素靶蛋白/真核細(xì)胞起始因子4E結(jié)合蛋白通路的過度活化，遏止α-syn的過度表達(dá)，從而減輕過度表達(dá)的α-syn對多巴胺能神經(jīng)元的毒性。

艾灸；帕金森??；雷帕霉素靶蛋白/真核細(xì)胞起始因子4E結(jié)合蛋白通路；磷酸化雷帕霉素靶蛋白；磷酸化真核細(xì)胞起始因子4E結(jié)合蛋白1；α-突觸核蛋白

帕金森病(PD)是黑質(zhì)退行性改變導(dǎo)致紋狀體通路多巴胺(DA)含量減少所引發(fā)的一種疾病。其基本病理學(xué)標(biāo)志為黑質(zhì)DA能神經(jīng)元的進(jìn)行性丟失和殘余DA能神經(jīng)元中嗜酸性包涵體——路易小體(LB)的堆積[1]。研究[2]表明，哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mtor)與PD的關(guān)系復(fù)雜而密切，在神經(jīng)退行性疾病如阿爾茨海默病、PD、亨廷頓舞蹈癥等疾病中均表現(xiàn)出mtor介導(dǎo)的信號通路的異常。在哺乳動物中，mtor激活后[即磷酸化mtor(p-mtor)]可刺激活化其下游的直接底物之一真核細(xì)胞起始因子4E結(jié)合蛋白1(4EBP1)，使其磷酸化，磷酸化的4EBP1(p-4EBP1)則失去與真核細(xì)胞翻譯啟動因子4E(eIF4E)結(jié)合的能力，從而降低了對翻譯起始的抑制作用[3]。有研究[4]發(fā)現(xiàn)，在α-突觸核蛋白(α-syn)突變動物體中抑制mtor活性可以顯著降低4EBP1磷酸化水平，改變動物的病理表現(xiàn)，包括肌肉變性、線粒體損害和運(yùn)動能力。近年來，艾灸療法被越來越多的應(yīng)用于PD的防治中，最近的一份臨床系統(tǒng)評價[5]顯示，灸法治療對PD患者肌強(qiáng)直及運(yùn)動功能的改善有良好療效，但其作用機(jī)制目前尚不清楚。基于此，2016年3月1日～2017年5月1日，我們以艾灸為干預(yù)手段，選取足三里(雙)、關(guān)元、風(fēng)府三穴對PD大鼠施以治療，觀察大鼠黑質(zhì)p-mtor、p-4EBP1及α-syn表達(dá)變化，探討艾灸治療PD的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物及其分組 SPF級健康雄性SD大鼠60只，體質(zhì)量180～220 g，購于湖北省實(shí)驗(yàn)動物研究中心，許可證號為SCXK(鄂)2015-0018。所有大鼠在通風(fēng)良好的條件下分籠飼養(yǎng)，自由攝食及飲水，適應(yīng)性喂養(yǎng)2周后，隨機(jī)分為正常組、假手術(shù)組、PD組、PD艾灸組，每組15只。實(shí)驗(yàn)過程中對動物的處理符合《Ethical issues in animal experimentation》[6]中的倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)。

1.2 艾條、主要試劑及儀器 十年陳黃金艾條(直徑為0.7 cm，河南南陽泊汐商貿(mào)有限公司)。 魚藤酮、葵花油乳液(美國Sigma公司)，磷酸酶抑制劑、RIPA裂解液、兔抗α-syn(武漢三鷹生物技術(shù)有限公司)，小鼠抗β-actin(武漢博士德生物工程有限公司)，p-mtor、p-4EBP1多克隆抗體(美國bioword生物公司)，免疫組化試劑盒(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)，BCA蛋白濃度測定試劑盒(碧云天)，濃縮型DAB試劑盒(北京索萊寶科技有限公司)，TEMED(Amresco)，顯影定影試劑盒(天津市漢中攝影材料廠)。垂直電泳槽(北京六一儀器廠)，電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)，ECL顯色系統(tǒng)(Thermo)。

1.3 PD模型制作及鑒定 PD組、PD艾灸組采用頸背部皮下注射魚藤酮法制備PD模型[7],參照陳忻等[8]的行為學(xué)評分標(biāo)準(zhǔn)對所有造模大鼠進(jìn)行評分,行為學(xué)評分2～8分視為造模合格。假手術(shù)組頸背部皮下注射與模型組同等濃度的不含魚藤酮的葵花油乳液，1次/d，連續(xù)28 d。正常組未做任何處理。

1.4 艾灸方法 造模完成后，PD艾灸組大鼠施以艾灸治療，參照《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)》[9]中大鼠常用的針灸穴位定位方法，取足三里(雙)、關(guān)元、風(fēng)府三穴，每日相同時間點(diǎn)施灸，1次/d，每次灸10 min，7 d為1個療程，共治療2個療程。其余三組大鼠不予艾灸。各組大鼠同步喂養(yǎng)。

1.5 大鼠行為學(xué)評分及標(biāo)本采集 艾灸結(jié)束后，對各組大鼠進(jìn)行行為學(xué)評分，然后各組大鼠稱重后用10%水合氯醛行腹腔注射麻醉。每組隨機(jī)選取半數(shù)大鼠行左心室多聚甲醛內(nèi)固定，取大鼠中腦黑質(zhì)組織塊，并用4%多聚甲醛固定過夜，石蠟包埋，切片備檢；每組另半數(shù)大鼠麻醉后快速斷頭取腦，于冰面上迅速分離中腦黑質(zhì)組織塊后置于凍存管中于-80 ℃冰箱中保存?zhèn)錂z。

1.6 大鼠黑質(zhì)組織p-mtor、p-4EBP1蛋白檢測 采用Western blotting法。 ①蛋白樣品制備：將上述-80 ℃保存?zhèn)錂z的少量黑質(zhì)組織塊加入裂解液(含PMSF)進(jìn)行勻漿，30 min后移至1.5 mL離心管中，4 ℃下12 000 r/min離心5 min，取上清分裝于0.5 mL離心管中并于-20 ℃保存；測蛋白濃度后，將提取的蛋白上清與5ⅹ蛋白上樣緩沖液按4∶1混勻，沸水浴中變性10 min。②電泳分離：各樣品按40 μg總蛋白上樣，10%凝膠電泳。③轉(zhuǎn)膜(濕轉(zhuǎn)法)：p-mtor轉(zhuǎn)膜條件為200 mA、120 min，300 mA、60 min；p-4EBP1轉(zhuǎn)膜條件為200 mA、70 min；β-actin轉(zhuǎn)膜條件為200 mA、90 min；④封閉：用含5% 脫脂奶粉的TBST(封閉液)浸泡PVDF膜，室溫?fù)u床封閉2 h。⑤一抗：用封閉液稀釋相應(yīng)的一抗，使PVDF膜浸泡于一抗孵育液中，4 ℃孵育過夜。其中p-mtor采用1∶800比例稀釋，p-4EBP1采用1∶5 000比例稀釋，β-actin采用1∶200比例稀釋。⑥二抗：TBST充分洗滌PVDF膜5～6次，5 min/次。用TBST稀釋相應(yīng)的HRP標(biāo)記二抗，使PVDF膜浸泡于二抗孵育液中，37 ℃搖床孵育2 h。⑦顯色曝光：TBST充分洗滌PVDF膜5～6次，5 min/次。每張膜滴加適量的ECL底物液，孵育數(shù)分鐘，X線膠片壓片后依次放入顯影液顯影、定影液定影。采用BandScan軟件對目標(biāo)圖像進(jìn)行灰度分析，p-mtor、p-4EBP1蛋白的相對表達(dá)量用目標(biāo)灰度/β-actin灰度來表示。

1.7 大鼠黑質(zhì)組織α-syn檢測 采用免疫組化法。 將上述大鼠黑質(zhì)組織切片進(jìn)行常規(guī)脫蠟處理后依次放入二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ、無水乙醇Ⅰ、無水乙醇Ⅱ、95%酒精、90%酒精-80%酒精-70%酒精，然后入蒸餾水浸泡2 min。采用微波進(jìn)行抗原修復(fù)；用蒸餾水新鮮配置的3% H2O2滴加于切片組織上以阻斷內(nèi)源性過氧化物酶，PBS沖洗3次，每次3 min；加一抗單克隆鼠抗α-syn于4 ℃濕盒中孵育過夜；加二抗，37 ℃孵育20 min;PBS沖洗切片3次，每次3 min；加DAB顯色液，Harris蘇木素復(fù)染，脫水，封片，顯微鏡下觀察，采集圖像。選定大鼠中腦黑質(zhì)區(qū)域，采用IPP6.0軟件對免疫組化照片進(jìn)行光密度分析，每張切片選取3張400倍照片，計算其平均光密度。

2 結(jié)果

造模完成后，排除死亡、行為學(xué)評分不合格的大鼠，每組各有12只納入檢測統(tǒng)計。

2.1 各組大鼠行為學(xué)評分比較 艾灸結(jié)束后，正常組、假手術(shù)組、PD組、PD艾灸組大鼠行為學(xué)評分分別為0、0、(7.10±0.738)、(3.50±0.863)分；PD組評分與正常組和假手術(shù)組相比明顯升高(P均lt;0.01)，PD艾灸組評分較PD組顯著降低(Plt;0.01)。

2.2 各組大鼠黑質(zhì)p-mtor、p-4EBP1的表達(dá)量比較 各組大鼠黑質(zhì)p-mtor、p-4EBP1的表達(dá)量比較見表1。

表1 各組大鼠黑質(zhì)p-mtor、p-4EBP1的相對表達(dá)量比較

注：與正常組、假手術(shù)組相比，*Plt;0.01；與PD組相比，#Plt;0.01。

2.3 各組大鼠黑質(zhì)α-syn表達(dá)比較 正常組、假手術(shù)組、PD組、PD艾灸組大鼠黑質(zhì)α-syn光密度值分別為0.006 5±0.000 7、0.008 9±0.000 9、0.028 5±0.003 1、0.017 8±0.001 8；與正常組和假手術(shù)相比，PD組大鼠黑質(zhì)α-syn表達(dá)顯著升高(Plt;0.01)；與PD組相比，PD艾灸組α-syn顯著減少(Plt;0.01)。

3 討論

PD是一種多因素的疾病，目前尚不能被治愈，臨床治療以左旋多巴類藥物為主，其短期療效明顯，但長期應(yīng)用不僅療效減弱，且不良反應(yīng)明顯[10]。近年來，艾灸療法被越來越多的應(yīng)用于PD的防治中，其在改善患者癥狀方面取得較好的療效[11]。

PD在中醫(yī)學(xué)中屬于“顫證、痙證”范疇，屬本虛標(biāo)實(shí)之證，腎虧脾虛是其發(fā)病之本，痰濁瘀血痹阻腦絡(luò)及肝風(fēng)內(nèi)動為其發(fā)病之標(biāo)[12]。本病患者以老年人居多，概因年老體衰，肝腎不足，髓?？仗摚荒苠︷B(yǎng)四肢所致?；谏鲜霾C(jī)，我們選取足三里、關(guān)元穴同用，其中足三里為胃經(jīng)合穴，胃腑下合穴，可調(diào)理脾胃，補(bǔ)益氣血生化之源，顧護(hù)后天之本；關(guān)元為任脈腧穴，也是足三陰經(jīng)與任脈的交會穴，為元陰、元陽關(guān)藏出入之所，可益精補(bǔ)氣，扶助人體先天之本。風(fēng)府為督脈腧穴，如《行針指要賦》中言“或針風(fēng)，先向風(fēng)府”，且督脈從風(fēng)府穴處入屬于腦，故針刺風(fēng)府不僅可以直達(dá)病所，祛風(fēng)止顫，還有填精益髓之妙。

mtor是一種進(jìn)化上相對保守的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，可受生長因子、營養(yǎng)物質(zhì)、能量等多種因素的影響，通過磷酸化其下游的靶蛋白，參與基因的轉(zhuǎn)錄和蛋白的表達(dá)，進(jìn)而影響自噬、凋亡等生物活動[13]。mtor的直接靶點(diǎn)主要包括p70核糖體S6蛋白激酶和4EBP1。當(dāng)mtor磷酸化4EBP1后，p-4EBP1與真核細(xì)胞翻譯啟動因子4E(eIF4E)的親和力會降低并從中釋放出來，降低了對翻譯起始的抑制作用，間接激活了帽依賴性翻譯，從而使細(xì)胞中蛋白合成加快，加速細(xì)胞生長和惡化[14]。α-syn是細(xì)胞內(nèi)LB的主要成分，目前認(rèn)為中腦黑質(zhì)神經(jīng)元中α-syn異常聚集與PD的病理過程密切相關(guān)[15]。已有證據(jù)[16]表明α-syn在細(xì)胞內(nèi)含量增加和聚集會產(chǎn)生細(xì)胞毒性，從多途徑來影響細(xì)胞的功能,最終導(dǎo)致細(xì)胞的死亡。因此抑制α-syn的過度表達(dá)以減少其聚集成為治療PD的方向之一。

本研究結(jié)果顯示，PD組大鼠黑質(zhì)p-mtor、p-4EBP1及α-syn表達(dá)均明顯增加，而用艾灸治療后的PD艾灸組大鼠黑質(zhì)p-mtor、p-4EBP1及α-syn表達(dá)顯著減少，且行為學(xué)異常得到改善。因此推測mtor/4EBP1途徑可能通過過度活化調(diào)節(jié)α-syn蛋白翻譯表達(dá)而參與PD的發(fā)病。艾灸足三里、關(guān)元、風(fēng)府穴可以降低PD大鼠黑質(zhì)α-syn的水平及有效改善大鼠的異常行為學(xué)表現(xiàn)，其機(jī)制之一可能是抑制了mtor/4EBP1通路的過度活化，通過抑制蛋白翻譯的起始水平，減少α-syn蛋白的過度表達(dá)，從而減輕了其對DA能神經(jīng)元的毒性作用；同時由于自噬是細(xì)胞內(nèi)降解異常聚集蛋白的重要途徑，而mtor又是自噬的關(guān)鍵調(diào)節(jié)位點(diǎn)，抑制mtor的活性可以增強(qiáng)α-syn的自噬性降解。

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10.3969/j.issn.1002-266X.2017.43.009

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A

1002-266X(2017)43-0029-03

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81403456，81473788)；針灸治未病湖北省協(xié)同創(chuàng)新中心項(xiàng)目(HBPCIC-2016-003)。

王述菊(E-mail: 361786273@qq.com)

2017-06-26)