廣西壯族自治區(qū)壯族人群MACROD2基因rs2208454位點(diǎn)單核苷酸多態(tài)性與缺血性腦卒中發(fā)病的關(guān)系

江東東，羅曼

(廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院，南寧530021 )

廣西壯族自治區(qū)壯族人群MACROD2基因rs2208454位點(diǎn)單核苷酸多態(tài)性與缺血性腦卒中發(fā)病的關(guān)系

江東東，羅曼

(廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院，南寧530021 )

目的探討廣西壯族自治區(qū)壯族人群MACROD2基因rs2208454位點(diǎn)單核苷酸多態(tài)性(SNP)與缺血性腦卒中(IS)發(fā)病的關(guān)系。方法采用SNaPshot法對(duì)101例廣西壯族IS患者(IS組)及104例健康體檢者(對(duì)照組)的MACROD2基因rs2208454位點(diǎn)單核苷酸進(jìn)行檢測(cè)分析。結(jié)果兩組MACROD2基因rs2208454位點(diǎn)GG、GT、TT基因型及G、T等位基因分布相比，P均gt;0.05；在顯性(TT+GT和GG)、隱性(TT和GT+GG)及加性(TT和GG)三種遺傳模型下，MACROD2基因rs2208454位點(diǎn)SNP與IS患病風(fēng)險(xiǎn)無(wú)關(guān)聯(lián)(P均gt;0.05)。結(jié)論廣西壯族人群MACROD2基因rs2208454位點(diǎn)SNP與IS發(fā)病可能不相關(guān)。

MACROD2基因；MACROD2基因rs2208454位點(diǎn)；單核苷酸多態(tài)性；腦卒中；缺血性腦卒中

腦卒中是臨床常見(jiàn)的腦血管疾病之一，盡管其發(fā)病率和死亡率隨著醫(yī)療保健水平的提高已有所下降，但隨著全球人口老齡化加劇，該病患者的絕對(duì)數(shù)仍呈逐年上升趨勢(shì)，不僅嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量，也給社會(huì)帶來(lái)沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)[1, 2]。缺血性腦卒中(IS)作為腦卒中最為常見(jiàn)的類型，盡管其發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明，但研究[3, 4]顯示遺傳易感基因在IS的病因?qū)W及發(fā)病機(jī)制中扮演重要角色。全基因組關(guān)聯(lián)研究(GWAS)的出現(xiàn)，為候選易感基因的選擇提供了重要依據(jù)，也使得從全基因組范圍的視角篩查與疾病相關(guān)聯(lián)的易感基因成為近年的研究熱點(diǎn)之一。2010年的一項(xiàng)GWAS[5]表明，MACROD2基因單核苷酸多態(tài)性(SNP)與靜默型腦梗死的發(fā)病顯著相關(guān)，其中 rs2208454位點(diǎn)的SNP與靜默型腦梗死的發(fā)病關(guān)系最密切。本研究對(duì)101例廣西壯族人群IS患者及104例健康體檢者的MACROD2基因rs2208454位點(diǎn)的SNP進(jìn)行了觀察，旨在探討廣西壯族人群MACROD2基因rs2208454位點(diǎn)SNP與IS發(fā)病的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 2014年1月～2015年12月就診于崇左市人民醫(yī)院及扶綏縣人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科的IS患者101例(IS組)，男69例，女32例；年齡33～95歲；均符合第四屆全國(guó)腦血管病學(xué)術(shù)會(huì)議修訂的IS診斷標(biāo)準(zhǔn)，并經(jīng)顱腦CT或磁共振成像、DSA檢查確診；排除短暫性腦缺血發(fā)作和腦動(dòng)靜脈畸形，以及蛛網(wǎng)膜下腔出血、木僵、嚴(yán)重感染、惡性腫瘤、嚴(yán)重肝腎功能異?；颊?。同期收集104例健康體檢者(對(duì)照組)作對(duì)照，男70例，女34例；年齡34～91歲；排除腦血管疾病、嚴(yán)重感染、惡性腫瘤、嚴(yán)重肝腎功能異常、內(nèi)分泌疾病患者。兩組性別、年齡相匹配，具有可比性。受試者均為廣西壯族自治區(qū)崇左地區(qū)無(wú)親緣關(guān)系的常住壯族居民，至少三代直系親屬內(nèi)無(wú)其他民族，受試者均知情同意。兩組BMI、血壓、血脂水平比較見(jiàn)表1。

表1 兩組BMI、血壓、吸煙史、血脂水平比較

注：與對(duì)照組相比，*Plt;0.01。

1.2 MACROD2基因rs2208454位點(diǎn)單核苷酸檢測(cè)及基因分型 ①DNA提取及擴(kuò)增：于早晨空腹抽取受試者外周靜脈血2 mL，EDTA抗凝。使用DNA提取試劑盒(北京天根生化科技公司提供)提取全血細(xì)胞基因組DNA，具體操作按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。PCR擴(kuò)增引物設(shè)計(jì)使用Primer3軟件，上游引物序列為5′-GCCACACCTTTGTACCGTGTGT-3′，下游引物序列為5′-TCTCCAAAATAAACCAGCAACCAAAA-3′，引物由上海生物工程公司合成。PCR反應(yīng)體系：1×GC緩沖液I，0.3 mmoL/L的dNTP，3.0 mmoL/L的氯化鎂，1μL樣本基因組DNA，1 μL的PCR引物，1 U的 Taq DNA聚合酶，反應(yīng)總體積20 μL。PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性2 min；此后11個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)94 ℃變性20 s，65 ℃退火40 s，72 ℃延伸1.5 min；繼續(xù)24個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)94 ℃變性20 s，59 ℃退火30 s，72 ℃延伸1.5 min；最后以72 ℃延伸2 min。PCR產(chǎn)物4 ℃保存?zhèn)溆?。②單核苷酸檢測(cè)及基因分型：取PCR產(chǎn)物20 μL，加入5 U蝦堿酶、2 U外切酶， 37 ℃溫浴1 h，75 ℃滅活15 min。此后進(jìn)行SNaPshot多重單堿基延伸反應(yīng)。延伸引物序列為TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTAAACAAAC-CATCTAGTTAGGCCAA，引物由上海生物工程公司合成。延伸反應(yīng)體系：純化后PCR產(chǎn)物2 μL，SNaPshot反應(yīng)試劑5 μL，延伸引物1 μL，超純水2 μL，反應(yīng)總體積10 μL。反應(yīng)條件：96 ℃預(yù)變性1 min；隨后28個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)96 ℃變性10 s，55 ℃退火5 s，60 ℃延伸30 s；延伸產(chǎn)物4 ℃保存?zhèn)溆?。為純化延伸產(chǎn)物，于10 μL延伸產(chǎn)物中加入蝦堿酶1 U，37 ℃溫浴1 h，75 ℃滅活15 min。取0.5 μL純化后的延伸產(chǎn)物，95 ℃變性處理后在ABI3730XL測(cè)序儀上樣，用GeneMapper 4.1分析檢出GG、GT、TT三種基因型。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)數(shù)資料比較及Hardy-Weinberg平衡用χ2檢驗(yàn)；用單因素非條件Logistic回歸分析法分析MACROD2基因rs2208454位點(diǎn)SNP與IS的關(guān)聯(lián)，用多因素非條件Logistic回歸分析法對(duì)混雜因素進(jìn)行校正，計(jì)算比值比(OR)和95%可信區(qū)間(95%CI)。所有檢驗(yàn)為雙側(cè)，Plt;0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

對(duì)照組及IS組各基因型頻率符合Hardy-Weinberg平衡(對(duì)照組：χ2=0.395，P=0.530；IS組：χ2=0.052，P=0.820)，均有群體代表性；兩組MACROD2基因rs2208454位點(diǎn)GG、GT、TT基因型及G、T等位基因分布相比，P均gt;0.05，結(jié)果詳見(jiàn)表2。

表2 兩組SNP rs2208454位點(diǎn)基因型及等位基因分布

多因素非條件Logistic回歸分析顯示，在顯性(TT+GT和GG)、隱性(TT和GT+GG)及加性(TT和GG)三種遺傳模型下，MACROD2基因rs2208454位點(diǎn)SNP與IS患病風(fēng)險(xiǎn)無(wú)關(guān)聯(lián)[OR分別為0.989(95%CI為0.568～1.721)、0.877(95%CI為0.394～1.949)、0.887(95%CI為0.378～2.082)，P均gt;0.05]。為調(diào)整多重因素對(duì)IS的影響，以IS為因變量，將收縮壓、舒張壓、TG及HDL-C作為混雜因素進(jìn)行校正后，進(jìn)一步行多因素非條件Logistic回歸分析顯示，在顯性(TT+GT和 GG)、隱性(TT和GT+GG)及加性(TT和GG)三種遺傳模型下，MACROD2基因rs2208454位點(diǎn)SNP與IS患病風(fēng)險(xiǎn)也無(wú)關(guān)聯(lián)[OR分別為1.210(95%CI為0.555～2.637)、0.726(95%CI為0.241～2.187)、0.734(95%CI為0.223-2.415)，P均gt;0.05]。

3 討論

MACROD2基因定位于人類20號(hào)染色體上的20p12區(qū)域，rs2208454位點(diǎn)嵌于該基因第3內(nèi)含子上。由MACROD2基因編碼的相應(yīng)蛋白質(zhì)的功能目前仍未完全闡明。有研究[5]顯示，MACROD2基因包含一段在胎兒及成人腦組織中均有表達(dá)的宏觀結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域與腺苷二磷酸(ADP)-核糖相聯(lián)結(jié)，推測(cè)其可能在ADP-核糖基化過(guò)程中發(fā)揮了重要作用。ADP-核糖基化是一種將ADP-核糖基團(tuán)連接到相關(guān)受體蛋白上的翻譯后修飾過(guò)程，其廣泛存在于DNA損傷修復(fù)、轉(zhuǎn)錄激活與抑制、端粒及核染色質(zhì)生物調(diào)控等過(guò)程中，是生物體遺傳信息傳遞、表達(dá)和蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)、功能轉(zhuǎn)換的主要調(diào)控手段之一。既往研究[6～9]顯示，MACROD2基因SNP與自閉癥、癡呆及高血壓等多種疾病的發(fā)病有關(guān)。也有研究[5]認(rèn)為，MACROD2基因rs2208454位點(diǎn)T等位基因攜帶可降低靜默型腦梗死的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。另一項(xiàng)研究[10]表明，MACROD2基因rs2208454位點(diǎn)TT型基因攜帶者IS的患病風(fēng)險(xiǎn)顯著升高。新近一項(xiàng)研究[11]指出，MACROD2基因rs2208454位點(diǎn)SNP與腦出血不相關(guān)。本研究結(jié)果顯示，廣西壯族人群IS組與對(duì)照組MACROD2基因rs2208454位點(diǎn)GG、GT、TT三種基因型及G、T等位基因分布差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，其MACROD2基因rs2208454位點(diǎn)SNP與IS發(fā)病也無(wú)關(guān)。

本研究發(fā)現(xiàn)，廣西壯族人群MACROD2基因的T等位基因頻率為36%，有研究[5, 10]顯示廣東漢族人群T等位基因頻率為25%，歐美人群T等位基因頻率為20%，提示MACROD2基因點(diǎn)突變的發(fā)生在不同地域及不同民族、種族的人群中存在顯著差異。有關(guān)MACROD2基因rs2208454位點(diǎn)SNP與IS的關(guān)系，目前研究結(jié)果不同，可能與民族、種族、地域不同及飲食、環(huán)境、生活習(xí)慣不同等有一定關(guān)系。同時(shí)，不同的IS亞型，其發(fā)病機(jī)制、病理特征及影響因素存在較大差異，樣本采集方式、病例納入和排除標(biāo)準(zhǔn)的選擇及不同的病例分組對(duì)研究結(jié)果也有一定影響。

綜上所述，本研究結(jié)果顯示廣西壯族人群MACROD2基因rs2208454位點(diǎn)SNP與IS發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)無(wú)關(guān)。IS作為一種多基因遺傳、多因素參與的復(fù)雜性疾病，不同民族、種族、地域人群間的遺傳異質(zhì)性廣泛存在，不同環(huán)境因素間存在交互作用，不同IS亞型的發(fā)病機(jī)制間存在差異，可能單一基因特定位點(diǎn)的突變不足以導(dǎo)致IS事件的發(fā)生。鑒于本研究樣本量的限制及樣本民族、種族、地域等客觀因素的局限性，我們認(rèn)為在MACROD2基因rs2208454位點(diǎn)SNP與IS的相關(guān)性研究中，仍需進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量，對(duì)多民族、多地域、多種族進(jìn)行綜合比較研究，對(duì)多組候選基因進(jìn)行多位點(diǎn)關(guān)聯(lián)分析，對(duì)IS的不同亞型進(jìn)一步比較分析，統(tǒng)一病例入選和排除標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)入選對(duì)象的飲食、環(huán)境、生活習(xí)慣等因素進(jìn)行嚴(yán)格匹配，以進(jìn)一步驗(yàn)證相關(guān)研究結(jié)果。

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Relationshipbetweenrs2208454singlenucleotidepolymorphismofMACROD2geneandischemicstrokeinZhuangpopulationofGuangxiZhuangautonomousregion

JIANGDongdong,LUOMan

(TheFirstAffiliatedHospitalofGuangxiMedicalUniversity,Nanning530021,China)

ObjectiveTo explore the relationship between single nucleotide polymorphism (SNP) of rs2208454 in MACROD2 gene and ischemic stroke (IS) in Zhuang population of Guangxi Zhuang autonomous region.MethodsThe rs2208454 single nucleotide of MACROD2 gene was detected by SNaPshot technique in 101 cases of Guangxi Zhuang IS patients (IS group) and 104 healthy subjects (control group).ResultsThe GG, GT, TT genotypes and G, T allele distribution of rs2208454 locus of MACROD2 gene were not statistically different between these two groups (allPgt;0.05). The rs2208454 locus SNP of MACROD2 gene was not associated with the risk of IS in dominant (TT+GT and GG), recessive (TT and GT+GG) and additive (TT and GG) genetic models (allPgt;0.05).ConclusionThe rs2208454 locus SNP of MACROD2 gene has no correlation with the pathogenesis of IS in Guangxi Zhuang population.

MACROD2 gene; MACROD2 gene rs2208454; single nucleotide polymorphism; stroke; ischemic stroke

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.43.004

R743

A

1002-266X(2017)43-0011-03

廣西壯族自治區(qū)自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(2013GXNSFBA019131， 2015GXNSFAA139171)。

江東東(1987-)，男，在讀碩士研究生，主治醫(yī)師，主要研究方向?yàn)槟X血管病的診治。E-mail: jiangdodong@126.com

羅曼(1980-)，女，博士，副主任醫(yī)師，主要研究方向?yàn)槟X血管病。E-mail: manro130@126.com

2017-07-07)