仙靈骨葆膠囊對(duì)去勢(shì)大鼠股骨組織形態(tài)計(jì)量學(xué)和OCN、Cbfα1 mRNA的影響

孫偉珊　霍少川　王曉東　孫平　王海彬

【摘要】 目的 探討仙靈骨葆膠囊對(duì)去勢(shì)大鼠股骨形態(tài)計(jì)量學(xué)和成骨相關(guān)基因骨鈣素（OCN）、核心結(jié)合因子（Cbfα1） mRNA的影響。方法 50只6月齡雌性SD大鼠， 隨機(jī)分為A組（作為空白對(duì)照）、B組

（作為模型）、C組（給予高劑量仙靈骨葆膠囊）、D組（給予低劑量仙靈骨葆膠囊）、E組[給予阿侖膦酸鈉維D3片（福美加）]， 每組10只。藥物干預(yù)3個(gè)月后， 采用X線顯微斷層顯像儀檢測(cè)左側(cè)離體股骨骨密度（BMD）和骨小梁數(shù)量（TbN）， 逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-PCR）檢測(cè)右側(cè)股骨組織OCN、Cbfα1 mRNA表達(dá)， 比較各組檢測(cè)結(jié)果。結(jié)果 干預(yù)3個(gè)月后， B組左側(cè)股骨BMD、TbN明顯低于A組， 差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；與B組比較， C、E組左側(cè)股骨BMD明顯增高， E組左側(cè)股骨TbN明顯增高， 差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；與E組比較， C、D組左側(cè)股骨BMD、TbN明顯降低， 差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；五組左側(cè)股骨BMD、TbN比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=86.400、28.027， P<0.05）。干預(yù)3個(gè)月后， 與A組比較， B組右側(cè)股骨Cbfα1、OCN mRNA表達(dá)量明顯降低， 差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；與B組比較， C、D、E組右側(cè)股骨Cbfα1 mRNA表達(dá)量明顯增高（P<0.05）， C、E組右側(cè)股骨OCN mRNA表達(dá)量明顯增高， 差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；與E組比較， C組右側(cè)股骨Cbfα1和OCN mRNA表達(dá)量明顯增高（P<0.05）， D組右側(cè)股骨Cbfα1 mRNA表達(dá)量明顯降低， 差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；五組大鼠右側(cè)股骨Cbfα1、OCN mRNA比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=13.233、48.338， P<0.05）。結(jié)論 仙靈骨葆膠囊提高去勢(shì)大鼠股骨BMD可能是通過(guò)提高OCN、Cbfα1 mRNA表達(dá)量發(fā)揮作用， TbN和BMD及成骨基因OCN、Cbfα1之間的關(guān)系尚需要進(jìn)一步研究。

【關(guān)鍵詞】 仙靈骨葆膠囊；去勢(shì)大鼠；骨質(zhì)疏松；骨鈣素；核心結(jié)合因子

DOI：10.14163/j.cnki.11-5547/r.2017.34.112

Effect of Xianling Gubao capsule on femoral histomorphometry and OCN and Cbfα1 mRNA in ovariectomized rats SUN Wei-shan， HUO Shao-chuan， WANG Xiao-dong， et al. First Affiliated Hospital of Guangdong Medical University， Guangzhou 510080， China

【Abstract】 Objective To discuss the effect of Xianling Gubao capsule on femoral histomorphometry and osteocalcin （OCN） and core binding factor （Cbfα1） mRNA in ovariectomized rats. Methods A total of 50 6-month-old female SD rats were randomly divided into group A （blank control）， group B （model）， group C （high-dose of Xianling Gubao capsule）， group D （low-dose Xianling Gubao capsule） and group E [alendronate sodium and vitamin D3 tablets （Fumega）]， with 10 rats in each group. After 3 months of drug intervention， the left femur bone mineral density （BMD） and trabecular number （TbN） were measured by X-ray microscopy， and the expression of OCN and Cbf α1 mRNA in right femurs was detected by reverse transcription polymerase chain reaction （RT-PCR）. The results of each group were compared. Results After 3 months of drug intervention， group B had obviously lower left femur BMD， TbN than group A， and the difference was statistically significant （P<0.05）. Compared with group B， group C and E had obviously higher left femur BMD and group E had obviously higher left femur TbN. Their difference was statistically significant （P<0.05）. Compared with group E， group C and E had obviously lower left femur BMD and TbN， and their difference was statistically significant （P<0.05）. Five groups had statistically significant difference in left femur BMD and TbN （F=86.400， 28.027， P<0.05）. After 3 months of drug intervention， group B had obviously lower right femur Cbfα1 and OCN mRNA expression than group A， and the difference was statistically significant （P<0.05）. Compared with group B， group C， D and E had obviously higher right femur Cbfα1 mRNA expression （P<0.05）， and group C and E had obviously higher right femur OCN mRNA expression. Their difference was statistically significant （P<0.05）. Compared with group E， group C had obviously higher right femur Cbfα1 and OCN mRNA expression （P<0.05）， and group D had obviously lower right femur Cbfα1 mRNA expression. Their difference was statistically significant （P<0.05）. Five groups had statistically significant difference in right femur Cbfα1 and OCN mRNA expression （F=13.233， 48.338， P<0.05）. Conclusion Xianling Gubao capsule may increased femoral BMD in ovariectomized rats may by increasing expression of OCN and Cbf mRNA α1. The relationship between TbN and BMD and osteogenic genes OCN and Cbfα1 may be further studied.endprint

【Key words】 Xianling Gubao capsule； Ovariectomized rats； Osteoporosis； Osteocalcin； Core binding factor

骨質(zhì)疏松（osteoporosis， OP）是一種全身性疾病， 其特征具有低骨量和骨微結(jié)構(gòu)的退化， 并且導(dǎo)致骨的脆性增加和骨折風(fēng)險(xiǎn)[1]。世界衛(wèi)生組織認(rèn)為OP是僅次于心血管疾病的一個(gè)重要健康問(wèn)題， 因此OP的預(yù)防及治療具有重要的意義。目前經(jīng)FDA批準(zhǔn)應(yīng)用于臨床的抗OP藥物雖然可有效降低OP性骨折的風(fēng)險(xiǎn)[2]， 但長(zhǎng)期持續(xù)應(yīng)用， 大多數(shù)都有一定的副作用[3]。中醫(yī)藥治療OP能夠緩解疼痛， 改善功能， 提高患者生活質(zhì)量。仙靈骨葆膠囊屬于中成藥， 能夠有效調(diào)節(jié)骨代謝， 改善骨骼強(qiáng)度， 防治OP[4]。為了進(jìn)一步探討仙靈骨葆膠囊的作用機(jī)制， 作者以骨形成相關(guān)基因骨鈣素（osteocalcin， OCN）和核心結(jié)合因子（core binding factor apha 1， Cbfα1）為切入點(diǎn)， 探討仙靈骨葆膠囊對(duì)去勢(shì)SD大鼠股骨形態(tài)的影響， 以揭示仙靈骨葆膠囊防治OP的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1. 1 材料

1. 1. 1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 選用6月齡SPF級(jí)雌性SD大鼠50只， 平均體重（447.24±59.57）g， 購(gòu)于廣州中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心[許可證號(hào)：SYXK（粵）2013-0001]。所有SD大鼠均在恒溫、恒濕的清潔環(huán)境中飼養(yǎng)， 室濕控制在23～25℃， 濕度50%左右， 標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng)， 自由攝食飲水， 通風(fēng)良好， 適應(yīng)喂養(yǎng)1周后建立骨質(zhì)疏松模型。

1. 1. 2 實(shí)驗(yàn)藥物 仙靈骨葆膠囊[國(guó)藥集團(tuán)同濟(jì)堂（貴州）制藥有限公司， 國(guó)藥準(zhǔn)字Z20025337]。福美加（杭州默沙東制藥有限公司， 國(guó)藥準(zhǔn)字J20130085）。

1. 1. 3 主要儀器和試劑 X線顯微斷層顯像儀（Skyscan公司）， 熒光定量PCR儀器（Bio-rad公司）， 多功能酶標(biāo)儀（Thermo公司）， 離心機(jī)（eppendorf公司）， 逆轉(zhuǎn)錄儀（Bio-Rad公司）， 全能型凝膠成像系統(tǒng)（Bio-Rad公司）， 熒光定量PCR檢測(cè)試劑盒（Genecopies公司）， 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（DBI公司）。引物設(shè)計(jì)為：OCN（上游：5-TGACTGCATTCTGCCTCTG-3， 下游：5-CGGAGTCTATTCACCACCTTAC-3）、Cbfa1（上游：CCAAGA

AGGCACAGACAGAA， 下游：5-CGGGACACCTACTCTCATAC

T-3）， GAPDH（上游：5-GCAAGGATACTGAGAGCAAGAG-3， 下游：5- GGATGGAATTGTGAGGGAGATG-3）， 由廣州四和生物科技有限公司提供。

1. 2 實(shí)驗(yàn)方法

1. 2. 1 分組與造模 將50只大鼠隨機(jī)分為A組（作為空白對(duì)照）、B組（作為模型）、C組（給予高劑量仙靈骨葆膠囊）、D組（給予低劑量仙靈骨葆膠囊）、E組（給予福美加）， 每組10只。五組大鼠用10%水合氯醛水溶液按 0.35 ml/100 g 腹腔注射麻醉大鼠， 在脊柱兩側(cè)約 1.5 cm 處作縱行切口， 切開皮膚、皮下組織及深筋膜， 在腹腔中找到梅花狀的卵巢， B、C、D、E組切除卵巢， 并用 1 號(hào)絲線在卵巢底部結(jié)扎， 觀察切口處滲血情況， 待無(wú)滲血時(shí)將脂肪回納腹腔， 縫合背部筋膜層， 生理鹽水沖洗后縫合皮膚；A組僅切除周圍少量脂肪組織。造模后大鼠置于鼠籠中單獨(dú)飼養(yǎng)， 術(shù)后連續(xù)3 d給予注射用青霉素鈉（北京悅康凱悅制藥有限公司， 國(guó)藥準(zhǔn)字H11020456）肌內(nèi)注射（5萬(wàn)U/d）， 預(yù)防感染。

1. 2. 2 藥物干預(yù) 造模3 d后， C、D組給藥劑量分別為30.85、15.43 mg/（100 g·d）， 1次/d， 每周給藥6 d；E組給藥劑量為0.72 mg/（100 g·d）， 每周給藥1次。

1. 2. 3 指標(biāo)檢測(cè) 干預(yù)3個(gè)月后， 處死各組大鼠， 取雙側(cè)股骨進(jìn)行BMD、TbN及OCN、Cbfa1 mRNA檢測(cè)。從-80℃冰箱中取出左側(cè)離體股骨， 置于恒溫水浴箱解凍后采用X線顯微斷層顯像儀檢測(cè)BMD和TbN。從液氮中取出右側(cè)股骨， 取30～50 mg組織加入1 ml TRIzol Reagent， 用勻漿儀進(jìn)行勻漿處理， 獲取總RNA， 按照熒光定量PCR試劑盒說(shuō)明書操作， 通過(guò)RT-PCT檢測(cè)OCN、Cbfa1 mRNA表達(dá)。

1. 3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（ x-±s）表示， 多組比較首先進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)， 方差齊采用單因素方差分析， 若不齊時(shí)采用非參數(shù)方差分析， 多組間兩兩比較采用單因素方差分析LSD法。P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2. 1 五組大鼠左側(cè)股骨BMD、TbN比較 干預(yù)3個(gè)月后， B組左側(cè)股骨BMD、TbN明顯低于A組， 差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；與B比較， C、E組左側(cè)股骨BMD明顯增高， E組左側(cè)股骨TbN明顯增高， 差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；與E組比較， C、D組左側(cè)股骨BMD、TbN明顯降低， 差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；五組左側(cè)股骨BMD、TbN比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=86.400、28.027， P<0.05）。見(jiàn)表1。不同干預(yù)方法的大鼠股骨BMD、TbN情況見(jiàn)圖1。

2. 2 五組大鼠右側(cè)股骨Cbfα1、OCN mRNA比較 干預(yù)3個(gè)月后， 與A組比較， B組右側(cè)股骨Cbfα1、OCN mRNA表達(dá)量明顯降低， 差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；與B組比較， C、D、E組右側(cè)股骨Cbfα1 mRNA表達(dá)量明顯增高（P<0.05）， C、E組右側(cè)股骨OCN mRNA表達(dá)量明顯增高， 差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；與E組比較， C組右側(cè)股骨Cbfα1和OCN mRNA表達(dá)量明顯增高（P<0.05）， D組右側(cè)股骨Cbfα1 mRNA表達(dá)量明顯降低， 差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；五組大鼠右側(cè)股骨Cbfα1、OCN mRNA比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=13.233、48.338， P<0.05）。見(jiàn)表2。endprint

3 討論

OP的發(fā)病機(jī)制就是由于在骨重建的過(guò)程中失去了成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞的動(dòng)態(tài)平衡， 出現(xiàn)骨吸收速度超過(guò)骨形成速度， 新生骨量少于被吸收骨量即發(fā)生負(fù)平衡， 導(dǎo)致骨總量的丟失， 引起骨質(zhì)疏松癥[5]。目前治療的西藥主要分為減少骨吸收藥物、促進(jìn)骨形成藥物。阿侖膦酸鈉是治療OP的常用藥物， 能快速緩解患者疼痛， 但是遠(yuǎn)期療效較差[6]。目前開發(fā)的部分針對(duì)OP發(fā)病機(jī)制的靶向藥物還處于臨床試驗(yàn)階段， 其安全性、有效性還需要長(zhǎng)期臨床觀察[7]。

從中醫(yī)角度來(lái)說(shuō)， OP 屬于“骨痿”范疇， 主要是由于腎虛引起， 造成肝、脾等臟器功能發(fā)生紊亂。仙靈骨葆膠囊主要由淫羊藿、續(xù)斷、丹參、知母、補(bǔ)骨脂、地黃等多味中藥組成。方中， 淫羊藿具有補(bǔ)腎、堅(jiān)筋骨的功效[8]；續(xù)斷具有補(bǔ)肝腎、行血脈、強(qiáng)筋骨的功效[9]；丹參具有活血化瘀、理氣止痛的功效；補(bǔ)骨脂具有溫腎助陽(yáng)、提高機(jī)體免疫的功效， 能夠增強(qiáng)OCN mRNA 的表達(dá)[10]；地黃具有清熱涼血、滋陰生津的功效。諸藥共用， 具有活血化瘀、滋補(bǔ)肝腎之功效， 能增加骨強(qiáng)度， 改善局部血液供應(yīng)， 通絡(luò)止痛， 緩解患者的癥狀。本研究中， 仙靈骨葆膠囊高劑量和福美加明顯提高去勢(shì)大鼠BMD， 仙靈骨葆膠囊高、低劑量未提高TbN表達(dá)量， 福美加明顯提高TbN表達(dá)量， BMD影響因素較多， 如組織容量、骨小梁厚度等， 中醫(yī)藥是否能夠提高BMD的同時(shí)提高TbN表達(dá)量尚需要深入探討。

OCN是由成熟的骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞合成與分泌， 是成骨細(xì)胞的標(biāo)志， 在骨組織礦化和成骨細(xì)胞分化增加時(shí)， OCN也隨之特異增加[11]。張洪躍等[12]研究發(fā)現(xiàn)， 大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化過(guò)程中OCN蛋白的表達(dá)隨著補(bǔ)骨脂素濃度的升高而升高。張哲等[13]研究發(fā)現(xiàn)小鼠骨髓基質(zhì)干細(xì)胞成骨誘導(dǎo)第7天時(shí)， 老鸛草素各劑量組OCN含量較對(duì)照組顯著升高， 呈劑量依賴性。Cbfα1屬于runt 結(jié)構(gòu)基因家族的轉(zhuǎn)錄因子， 調(diào)控成骨細(xì)胞活性和分化， 是成骨細(xì)胞最早且最具有特異性的標(biāo)志。李楠等[14]研究發(fā)現(xiàn)巴戟天水提物與巴戟天多糖均能顯著提高成骨細(xì)胞Cbfα1mRNA 的表達(dá)。劉國(guó)巖等[15]研究骨碎補(bǔ)對(duì)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞增殖分化及Cbfα1表達(dá)的影響， 結(jié)果發(fā)現(xiàn)體外中藥骨碎補(bǔ)可促進(jìn)大鼠BMSCs 增殖及成骨分化， 加強(qiáng)Cbfα1 表達(dá)。巴戟天和骨碎補(bǔ)屬于補(bǔ)腎陽(yáng)中藥， 以上研究說(shuō)明補(bǔ)腎中藥能夠促進(jìn)和OCN、Cbfα1表達(dá)量。本研究結(jié)果顯示， 干預(yù)3個(gè)月后， B組左側(cè)股骨BMD、TbN明顯低于A組， 差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；與B組比較， C、E組左側(cè)股骨BMD明顯增高， E組左側(cè)股骨TbN明顯增高， 差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；與E組比較， C、D組左側(cè)股骨BMD、TbN明顯降低， 差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；五組左側(cè)股骨BMD、TbN比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=86.400、28.027， P<0.05）。干預(yù)3個(gè)月后， 與A組比較， B組右側(cè)股骨Cbfα1、OCN mRNA表達(dá)量明顯降低， 差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；與B組比較， C、D、E組右側(cè)股骨Cbfα1 mRNA表達(dá)量明顯增高（P<0.05）， C、E組右側(cè)股骨OCN mRNA表達(dá)量明顯增高， 差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；與E組比較， C組右側(cè)股骨Cbfα1和OCN mRNA表達(dá)量明顯增高（P<0.05）， D組右側(cè)股骨Cbfα1 mRNA表達(dá)量明顯降低， 差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；五組大鼠右側(cè)股骨Cbfα1、OCN mRNA比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=13.233、48.338， P<0.05）。說(shuō)明仙靈骨葆膠囊能夠提高OCN、Cbfα1 mRNA表達(dá)量， 與上述研究一致。

綜上分析， 仙靈骨葆膠囊能夠提高去勢(shì)大鼠BMD、OCN和Cbfα1 mRNA表達(dá)量， 但未發(fā)現(xiàn)提高TbN。因此有理由相信仙靈骨葆膠囊能夠提高去勢(shì)大鼠BMD可能是通過(guò)提高OCN、Cbfα1 mRNA表達(dá)量發(fā)揮作用， TbN和BMD及成骨基因OCN、Cbfα1之間的關(guān)系尚需要進(jìn)一步研究。

參考文獻(xiàn)

[1] Qin L， Choy WY， Hung VWY， et al. Age-related vessel calcification at distal extremities is a risk factor of osteoporosis. Journal of Orthopaedic Translation， 2014， 2（1）：43-48.

[2] Rachner TD， Khosla S， Hofbauer LC. Osteoporosis： now and the future. Lancet， 2011， 377（9773）：1276-1287.

[3] Siris ES， Selby PL， Saag KG， et al. Impact of osteoporosis treatment adherence on fracture rates in North America and Europe. American Journal of Medicine， 2009， 122（2 Suppl）：S3.

[4] 吳劍靜， 溫利平， 吳云剛， 等. 仙靈骨葆膠囊治療糖皮質(zhì)激素性骨質(zhì)疏松癥的臨床療效觀察. 中國(guó)骨傷， 2009， 22（3）：193-195.

[5] Li X， Ominsky MS， Warmington KS， et al. Sclerostin antibody treatment increases bone formation， bone mass， and bone strength in a rat model of postmenopausal osteoporosis. Journal of Bone & Mineral Research， 2009， 24（4）：578-588.endprint

[6] 唐海， 陳浩， 王炳強(qiáng)， 等. 椎體后凸成形術(shù)治療重度骨質(zhì)疏松性椎體壓縮骨折. 中華骨科雜志， 2010， 30（10）：978-983.

[7] Hofbauer LC， Neubauer A， Heufelder AE. Receptor activator of nuclear factor-kappaB ligand and osteoprotegerin： potential implications for the pathogenesis and treatment of malignant bone diseases. Cancer， 2001， 92（3）：460.

[8] 康學(xué)， 劉仁慧， 王秀娟. 淫羊藿、女貞子抗骨質(zhì)疏松癥的應(yīng)用與機(jī)制研究進(jìn)展. 中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志， 2012， 18（21）：331-334.

[9] 牛銀波， 潘亞磊， 李晨睿， 等. 續(xù)斷防治骨質(zhì)疏松的研究進(jìn)展. 中國(guó)藥理學(xué)通報(bào)， 2013， 29（7）：892-894.

[10] 徐廣飛， 陳霞. 絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥中醫(yī)藥治療進(jìn)展. 山東中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)， 2011（2）：191-192.

[11] Gordon JAR， Tye CE， Sampaio AV， et al. Bone sialoprotein expression enhances osteoblast differentiation and matrix mineralization in vitro. Bone， 2007， 41（3）：462.

[12] 張洪躍， 周潘宇， 汪洋， 等. 補(bǔ)骨脂素對(duì)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨及成脂分化的影響. 現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進(jìn)展， 2017， 17（15）：2813-2816.

[13] 張哲， 徐秀娟， 劉欣， 等. 老鸛草素通過(guò)Wnt/β-catenin信號(hào)通路影響小鼠骨髓基質(zhì)干細(xì)胞的增殖和成骨分化. 中華中醫(yī)藥學(xué)刊， 2017（1）：215-218.

[14] 李楠， 王和鳴， 郭素華， 等. 巴戟天多糖對(duì)體外培養(yǎng)成骨細(xì)胞核心結(jié)合因子α1mRNA表達(dá)的影響. 中華中醫(yī)藥雜志， 2007， 22（8）：517-519.

[15] 劉國(guó)巖， 徐展望， 徐琬梨. 骨碎補(bǔ)提取物對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化及Cbfα1表達(dá)的影響. 山東醫(yī)藥， 2013， 53（25）：10-12.

[收稿日期：2018-10-18]endprint