排卵后給予米非司酮對雌性大鼠動情周期、黃體功能的影響及意義

周伯如，戴佳軒，徐建亞，周惠芳

(南京中醫(yī)藥大學(xué)，南京210023)

排卵后給予米非司酮對雌性大鼠動情周期、黃體功能的影響及意義

周伯如，戴佳軒，徐建亞，周惠芳

(南京中醫(yī)藥大學(xué)，南京210023)

目的探討排卵后給予米非司酮對雌性大鼠動情周期、黃體功能的影響及其意義。方法選擇具有規(guī)律周期性變化、動情周期為4天的雌性大鼠40只，隨機(jī)分為空白組、單周期組、兩周期組及三周期組，每組10只。單周期組、兩周期組及三周期組分別于排卵后灌胃給予米非司酮1 mL/100 g，分別用藥1、2、3個(gè)周期；空白組灌胃給予等體積生理鹽水。記錄各組給藥前后動情后期及動情周期的持續(xù)時(shí)間，統(tǒng)計(jì)出現(xiàn)動情周期紊亂的大鼠數(shù)量。末次給藥后第2天(給藥后D2)及給藥后進(jìn)入下一動情周期的第2天(下一周期D2)采用放射免疫分析法檢測血清雌二醇(E2)、孕酮(P)、促卵泡生成素(FSH)、促黃體生成素(LH)水平，處死后計(jì)數(shù)卵巢組織中生長卵泡、黃體及閉鎖卵泡數(shù)，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測子宮組織雌激素受體(ER)、孕激素受體(PR)mRNA表達(dá)。結(jié)果空白組、單周期組動情周期均保持規(guī)律性，兩周期組、三周期組中分別有1只(10%)、5只(50%)出現(xiàn)動情周期紊亂。各組給藥前后動情周期持續(xù)時(shí)間無明顯變化(P均>0.05)；兩周期組、三周期組動情后期持續(xù)時(shí)間均明顯短于給藥前及空白組、單周期組給藥后(P均<0.05)。單周期組、兩周期組、三周期組給藥后D2、下一周期D2血清E2均高于空白組，且三周期組升高更明顯(P均<0.05)。單周期組、兩周期組、三周期組給藥后D2血清FSH均低于空白組，LH均高于空白組(P均<0.05)。兩周期組、三周期組下一周期D2血清FSH均低于空白組與單周期組，血清LH均高于空白組與單周期組(P均<0.05)。各組給藥后D2、下一周期D2血清P水平比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。單周期組、兩周期組及三周期組閉鎖卵泡數(shù)均多于空白組，黃體數(shù)、生長卵泡數(shù)均少于空白組(P均<0.05)。兩周期組與三周期組生長卵泡數(shù)、黃體數(shù)及閉鎖卵泡數(shù)比較均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P均>0.05)。單周期組、兩周期組、三周期組子宮組織ER mRNA相對表達(dá)量均高于空白組，且兩周期組、三周期組升高更明顯(P均<0.05)。單周期組、兩周期組、三周期組子宮組織PR mRNA相對表達(dá)量均高于空白組，且三周期組升高更明顯(P均<0.05)。結(jié)論雌性大鼠排卵后給予兩個(gè)周期米非司酮可通過提高子宮組織PR基因表達(dá)而縮短其動情后期持續(xù)時(shí)間并導(dǎo)致黃體功能不全，可用于建立有效、穩(wěn)定的黃體功能不全大鼠模型。

黃體功能不全；米非司酮；多周期排卵；動情周期；大鼠

米非司酮為高效孕激素拮抗劑，多用于排卵后避孕及早期妊娠的藥物流產(chǎn)。女性排卵后單次使用米非司酮不會對月經(jīng)正常規(guī)律造成影響[1]，但其生殖內(nèi)分泌水平已發(fā)生變化，可出現(xiàn)黃體功能不全(LPD)等表現(xiàn)[2]。近年來，米非司酮亦被諸多學(xué)者用于構(gòu)建LPD動物模型[3]。前期研究發(fā)現(xiàn)，單次排卵后給予米非司酮可使雌性SD大鼠出現(xiàn)LPD的病理學(xué)特征與生殖內(nèi)分泌變化，但存在造模后有效時(shí)間較短、給藥時(shí)間限制較大等缺點(diǎn)[4]。2016年7～8月，本研究觀察了多周期排卵后給予米非司酮對雌性大鼠動情周期及黃體功能的影響，旨在為建立穩(wěn)定的動物模型提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 動物：SPF級雌性SD大鼠50只，8周齡，體質(zhì)量(200±20)g，購于南京中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心。飼養(yǎng)條件：分籠飼養(yǎng)于SPF環(huán)境中，室內(nèi)溫度22～25 ℃，相對濕度40%～70%，12 h明暗交替，自由攝食、飲水。藥物：米非司酮片(25 mg/片)購于上海新華聯(lián)制藥有限公司，充分研磨后配置成濃度為1 mg/mL的均一混懸液，4 ℃保存?zhèn)溆?，給藥前復(fù)溫至25～28 ℃。主要試劑：雌二醇(E2)、孕酮(P)、促卵泡生成素(FSH)、促黃體生成素(LH)放射免疫試劑盒購于北京華英生物技術(shù)研究所，RNAiso Plus提取液、cDNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR Green熒光定量PCR試劑盒均購于日本Takara公司。主要儀器：r-911全自動放免計(jì)數(shù)儀購于中國科技大學(xué)實(shí)業(yè)總公司，蛋白核酸分析儀購于德國Eppendorf公司，QuantStudio7 Flex實(shí)時(shí)熒光定量PCR系統(tǒng)購于美國Thermo公司。

1.2 動物分組與干預(yù) 雌性SD大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，每日8:00、15:00、21:00進(jìn)行陰道脫落細(xì)胞涂片(以下稱陰道涂片)，置于倒置生物顯微鏡下觀察大鼠陰道脫落細(xì)胞形態(tài)，以明確大鼠動情周期變化。篩選陰道涂片具有規(guī)律周期性變化、動情周期為4天的雌性大鼠40只，隨機(jī)分為空白組、單周期組、兩周期組及三周期，每組10只。各組每日8:00進(jìn)行陰道涂片，發(fā)現(xiàn)典型動情期表現(xiàn)的時(shí)間即記為D1。按照《人和動物間按體表面積折算的等效劑量比值表》中的方法進(jìn)行劑量換算，單周期組、兩周期組及三周期組D1上午9:00～11:00灌胃給予米非司酮1 mL/100 g，空白組灌胃給予生理鹽水1 mL/100 g。單周期組僅在第1個(gè)動情周期的D1給予米非司酮，兩周期組與三周期組參照上法分別給藥2、3個(gè)動情周期。

1.3 動情周期檢測 各組大鼠給藥前及給藥后每日進(jìn)行陰道涂片，參照楊麗娟等[4]的方法記錄大鼠完整動情周期及動情后期的持續(xù)時(shí)間。

1.4 血清E2、P、FSH、LH水平檢測 采用放射免疫分析法。末次給藥后第2天(記為給藥后D2)及給藥后進(jìn)入下一動情周期的第2天(記為下一周期D2)14:00～16:00(相當(dāng)于人的黃體中期)，各組大鼠于眼底靜脈叢取血0.5～1 mL，常溫靜置1～2 h，4 ℃條件下3 000 r/min離心15 min，取血清-20 ℃保存?zhèn)溆谩２捎梅派涿庖叻治龇z測血清E2、P、FSH、LH水平，嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。

1.5 子宮、卵巢組織形態(tài)學(xué)觀察 各組血清E2、P、FSH、LH水平檢測完成后，給予10%水合氯醛按0.35 mL/100 g行腹腔麻醉，斷頭處死后迅速取出子宮、卵巢組織。解剖顯微鏡下觀察、分離輸卵管等多余組織，濾紙吸凈血液。各組隨機(jī)選擇3只大鼠的子宮、卵巢組織(其余組織-80 ℃凍存)，4%多聚甲醛固定，常規(guī)脫水、透明、浸蠟、包埋、5 μm厚切片。常規(guī)行HE染色，奧林巴斯BX40光學(xué)顯微鏡下觀察子宮、卵巢組織形態(tài)學(xué)改變，采用體視學(xué)細(xì)胞計(jì)數(shù)系統(tǒng)隨機(jī)各選擇5個(gè)視野，計(jì)數(shù)卵巢組織中的生長卵泡、黃體及閉鎖卵泡數(shù)，取平均值。

1.6 子宮組織雌激素受體(ER)、孕激素受體(PR)mRNA表達(dá)檢測 采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法。取各組凍存的子宮組織，按照RNAiso Plus提取試劑盒說明書采用常規(guī)一步法提取子宮組織總RNA，測定RNA樣品含量及純度合格，使用SYBR?Premix Ex TapTMⅡ試劑盒對cDNA樣本進(jìn)行處理，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)。大鼠ER、PR及內(nèi)參GAPDH引物均由上海生工生物工程股份有限公司設(shè)計(jì)完成。ER引物序列：上游引物：5′-CGACTATGCCTCTGGCTACC-3′，下游引物：5′-CGATGGTGCATTGGTTTGTA-3′，引物長度：122 bp。PR引物序列：上游引物：5′-CTGCTCTTCTCTCGGTCCTG-3′，下游引物：5′-CTGGGATTTCTGCTTCTTCG-3′，引物長度：131 bp。GAPDH引物序列：上游引物：5′-TGATTCTACCCACGGCAAGTT-3′，下游引物：5′-TGATGGGTTTCCCATTGATGA-3′，引物長度：77 bp。PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃變性5 s，60 ℃擴(kuò)增34 s，40個(gè)循環(huán)。各樣本均設(shè)3個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。采用QuantStudio7 Flex系統(tǒng)進(jìn)行數(shù)據(jù)采集與分析，采用2-ΔΔCt法計(jì)算目的基因相對表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 各組動情周期及動情后期持續(xù)時(shí)間比較 空白組、單周期組動情周期均保持規(guī)律性，兩周期組、三周期組中分別有1只(10%)、5只(50%)動情周期規(guī)律性變化消失(表現(xiàn)為持續(xù)性動情間期)。各組給藥前后動情周期及動情后期持續(xù)時(shí)間比較見表1。

表1 各組給藥前后動情周期、動情后期持續(xù)時(shí)間比較

注：與同組給藥前比較，*P<0.05；與空白組給藥后比較，#P<0.05；與單周期組給藥后比較，△P<0.05。

2.2 各組血清E2、P、FSH、LH水平比較 見表2。

2.3 各組子宮、卵巢組織形態(tài)學(xué)變化 HE染色結(jié)果：①子宮：空白組子宮固有層組織疏松，子宮腺體多，間質(zhì)血管豐富，單周期組、兩周期組、三周期組子宮內(nèi)膜層明顯菲薄，腺體數(shù)減少，腺腔偏小，間質(zhì)膠原纖維增多，以三周期組變化更明顯。②卵巢：空白組生長卵泡數(shù)量較多，黃體發(fā)育好，體積大，顆粒細(xì)胞層較厚；單周期組、兩周期組、三周期組卵巢內(nèi)閉鎖卵泡數(shù)量增多，顆粒細(xì)胞排列松散，卵母細(xì)胞放射冠減少或消失。各組卵巢組織生長卵泡、黃體及閉鎖卵泡數(shù)量比較見表3。

表2 各組給藥前后血清E2、P、FSH、LH水平比較

注：與同組給藥后D2比較，*P<0.05；與空白組同時(shí)間點(diǎn)比較，#P<0.05；與單周期組同時(shí)間點(diǎn)比較，△P<0.05；與兩周期組同時(shí)間點(diǎn)比較，▲P<0.05。

表3 各組卵巢組織生長卵泡、黃體及閉鎖卵泡數(shù)量比較(個(gè)

注：與空白組比較，#P<0.05；與單周期組比較，△P<0.05。

2.4 各組子宮組織ER、PR mRNA表達(dá)比較 見表4。

表4 各組子宮組織ER、PR mRNA相對表達(dá)量比較

注：與空白組比較，#P<0.05；與單周期組比較，△P<0.05；與兩周期組比較，▲P<0.05。

3 討論

研究證實(shí)，米非司酮競爭性拮抗P與其受體結(jié)合，其受體親和力是P的4～5倍，能夠顯著抑制P的正常生物學(xué)效應(yīng)，對卵泡發(fā)育、排卵期LH峰形成以及黃體功能具有抑制作用[5,6]。女性在非孕黃體期一次口服100 mg米非司酮可于1 h內(nèi)達(dá)到血藥濃度峰值，消除半衰期為12～24 h，100～800 mg并無明顯的血藥濃度差異，不易產(chǎn)生蓄積效應(yīng)[7,8]。由于米非司酮可造成LPD的發(fā)生，因此近年來多被應(yīng)用于LPD動物模型的構(gòu)建。目前常用的造模方案主要有兩種：①根據(jù)雌性大鼠妊娠第5天受精卵著床這一特點(diǎn)，在其著床前2～3天使用米非司酮，拮抗孕激素，使其子宮內(nèi)膜容受性受損以致受精卵無法著床，達(dá)到模擬LPD的目的[9]；②對未受孕大鼠連續(xù)使用米非司酮，造成生殖內(nèi)分泌水平紊亂，出現(xiàn)卵泡發(fā)育障礙，進(jìn)而影響黃體功能[10]。米非司酮雖然滿足了LPD相關(guān)實(shí)驗(yàn)的需求，但隨著研究的深入，以上兩種方案均出現(xiàn)了一定的局限性：第一種方案雖能模擬妊娠期黃體功能異常，但臨床上絕大多數(shù)患者就診時(shí)并未妊娠，其黃體分泌水平與妊娠期有所區(qū)別，不能更好地模擬臨床；第二種方案則因連續(xù)使用米非司酮可抑制大鼠排卵，造成動情周期紊亂，導(dǎo)致造模失敗。

研究表明，正常大鼠的動情期、動情后期、動情間期、動情前期平均時(shí)長分別為14、18、60、12 h，其動情期末段與動情后期相當(dāng)于人的黃體中前期，在動情間期中前段黃體萎縮，而下一周期的卵泡發(fā)育從動情間期前段即開始。雌性SD大鼠的動情期一般于晚間22時(shí)至次日1時(shí)出現(xiàn)，排卵發(fā)生于動情期出現(xiàn)后的6～8 h[11]。本課題組雖未在夜間對大鼠陰道涂片進(jìn)行觀察(夜間操作有導(dǎo)致大鼠正常節(jié)律紊亂的不利影響)，但所有在前一日陰道涂片表現(xiàn)為動情前期的大鼠，均于次日8:00出現(xiàn)典型動情期特征。大鼠動情期的陰道涂片可見大量脫落堆疊角化細(xì)胞，此時(shí)比較容易判斷。因此，我們認(rèn)為對于LPD大鼠模型，在上午8:00陰道涂片發(fā)現(xiàn)動情期后2 h內(nèi)使用米非司酮，既能在黃體形成后對其功能產(chǎn)生影響，又可減小對卵泡發(fā)育與排卵產(chǎn)生的直接影響，是較為可靠且便捷的用藥方式。本研究結(jié)果顯示，給予米非司酮可導(dǎo)致大鼠動情后期持續(xù)時(shí)間縮短，其中以兩周期組、三周期組變化更明顯。但LPD的前提是有卵泡發(fā)育及排卵(排卵后形成黃體)，因此動情周期規(guī)律性變化消失(表現(xiàn)為長時(shí)間動情間期)的大鼠并不符合實(shí)驗(yàn)要求。本研究結(jié)果顯示，空白組、單周期組動情周期均保持規(guī)律性，兩周期組、三周期組中分別有1只(10%)、5只(50%)動情周期規(guī)律性變化消失。以上結(jié)果提示，給予兩周期米非司酮更符合構(gòu)建LPD大鼠模型的要求。

研究顯示，子宮ER、PR在月經(jīng)周期中具有規(guī)律性變化，其在黃體前、中期的降調(diào)是子宮內(nèi)膜容受性建立的主要標(biāo)志之一，可反映黃體功能[12,13]。本研究結(jié)果顯示，單周期組、兩周期組、三周期組子宮組織ER mRNA相對表達(dá)量均高于空白組，且兩周期組、三周期組升高更明顯；單周期組、兩周期組、三周期組子宮組織PR mRNA相對表達(dá)量均高于空白組，這與相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道的LPD變化特征一致[12]。研究表明，米非司酮可抑制FSH的合成與分泌，其機(jī)制可能與外周循環(huán)中瘦素水平降低有關(guān)，瘦素減少可導(dǎo)致雌激素水平升高，引起促性腺激素釋放激素(GnRH)分泌，導(dǎo)致LH分泌增加[14,15]。以往認(rèn)為血清LH水平偏低是LPD的特征之一，但越來越多的研究發(fā)現(xiàn)LPD患者黃體期血清LH水平并不一定偏低，F(xiàn)SH/LH可能是影響卵巢分泌功能的重要因素。FSH/LH過高可出現(xiàn)卵巢儲備功能下降、卵巢早衰的表現(xiàn)；FSH/LH過低可導(dǎo)致卵巢反應(yīng)性下降，雌孕激素分泌異常，導(dǎo)致子宮內(nèi)膜容受性低下，還可引起下一周期卵泡發(fā)育障礙、小卵泡排卵，從而導(dǎo)致下一周期黃體發(fā)育不良，連續(xù)出現(xiàn)LPD[16]。本研究結(jié)果顯示，兩周期組、三周期組下一周期D2血清FSH水平均低于空白組與單周期組，血清LH水平均高于空白組與單周期組，與上述結(jié)論基本一致。其原因可能與下丘腦GnRH分泌的脈沖變化密切相關(guān)[17,18]，而調(diào)節(jié)GnRH分泌的機(jī)制則較為復(fù)雜，仍有待于進(jìn)一步研究。

綜上所述，雌性大鼠排卵后給予兩個(gè)周期米非司酮可導(dǎo)致其動情后期持續(xù)時(shí)間縮短及黃體功能不全，有助于建立有效、穩(wěn)定的黃體功能不全大鼠模型。

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國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81473713)；江蘇省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(BK20141463)；江蘇省普通高校研究生科研創(chuàng)新計(jì)劃項(xiàng)目(KYLX15_0991)；中國和歐洲醫(yī)療保健發(fā)展合作研究計(jì)劃(CHETCH)。

周惠芳(E-mail： zhouhuifang201301@163.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.44.009

R714.21

A

1002-266X(2017)44-0032-04

2017-01-20)