血清miR-122作為藥物肝損傷生物標(biāo)志物的敏感性和特異性比較

湯納平，陳 潔，王 雁，葛 帥，馬 璟，梅其炳

（1.西北工業(yè)大學(xué)生命學(xué)院，陜西西安710072；2.中國(guó)醫(yī)藥工業(yè)研究總院國(guó)家上海新藥安全評(píng)價(jià)研究中心，上海 201203）

·論 著·

血清miR-122作為藥物肝損傷生物標(biāo)志物的敏感性和特異性比較

湯納平1，2，陳 潔2，王 雁2，葛 帥2，馬 璟2，梅其炳1

（1.西北工業(yè)大學(xué)生命學(xué)院，陜西西安710072；2.中國(guó)醫(yī)藥工業(yè)研究總院國(guó)家上海新藥安全評(píng)價(jià)研究中心，上海 201203）

目的比較研究血清微RNA-122（miR-122）作為藥物肝損傷生物標(biāo)志物的敏感性和特異性，為miR-122用于早期藥物肝毒性評(píng)價(jià)提供依據(jù)。方法采用對(duì)乙酰氨基酚（APAP，1250 mg·kg-1，ig）、α-萘異硫氰酸酯（ANIT，150 mg·kg-1，ig）、蛋氨酸-膽堿缺乏飲食（MCDD，自由攝食）以及四氯化碳（CCl4，50%，ip）分別制備大鼠肝細(xì)胞損傷模型、膽汁淤積模型、脂肪肝模型以及肝纖維化模型，用于評(píng)價(jià)miR-122作為藥物肝損傷生物標(biāo)志物的敏感性。采用鹽酸異丙腎上腺素（IH，2.5 mg·kg-1，iv）和慶大霉素（GM，80 mg·kg-1，im）分別制備大鼠心肌損傷模型和腎損傷模型，用于評(píng)價(jià)miR-122作為藥物肝損傷生物標(biāo)志物的特異性。于不同時(shí)間點(diǎn)采集大鼠血清和肝組織，采用全自動(dòng)生化儀檢測(cè)血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶（GPT）和谷草轉(zhuǎn)氨酶（GOT）活性及總膽紅素（TBIL）濃度，采用實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)血清miR-122，并采用HE染色對(duì)肝組織進(jìn)行組織病理檢查。結(jié)果與溶媒對(duì)照組相比，肝細(xì)胞損傷模型、膽汁淤積模型、脂肪肝模型和肝纖維化模型組血清miR-122明顯升高（＞2倍）的時(shí)間分別為給藥后1.5 h，3 h，2周和4周，均早于傳統(tǒng)生物標(biāo)志物GPT，GOT和TBIL〔給藥后6 h，12 h，3周和6周均未見(jiàn)明顯升高（＜2倍）〕，同時(shí)其升高幅度（最大升高倍數(shù)分別為235.8，202.7，73.8和600.3倍）也高于傳統(tǒng)生物標(biāo)志物GPT，GOT和TBIL（GPT最大升高倍數(shù)分別為9.5，3.9，2.5和6.6倍，GOT為6.0，2.4，1.4和3.5倍，TBIL為2.6，2.3，1.2和1.8倍）。在心肌損傷模型中，GOT活性明顯升高（2.1倍），而血清miR-122無(wú)明顯改變；在腎損傷模型中，血清miR-122無(wú)明顯改變。結(jié)論血清miR-122可作為藥物肝損傷生物標(biāo)志物，且與傳統(tǒng)肝損傷生物標(biāo)志物如GPT，GOT和TBIL相比有更高的敏感性和特異性。

肝損傷；生物標(biāo)志物；miR-122；敏感性；特異性

藥物誘導(dǎo)性肝損傷（drug-induced liver injury，DILI）是導(dǎo)致藥物研發(fā)終止和撤市的主要原因之一［1］。谷丙轉(zhuǎn)氨酶（glutamic-pyruvic transaminase，GPT）和谷草轉(zhuǎn)氨酶（glutamic-oxaloacetic transaminase，GOT）作為目前肝損傷評(píng)價(jià)的經(jīng)典指標(biāo)，在臨床前和臨床工作中廣泛應(yīng)用，但它們的靈敏度和特異性尚不甚理想。最近幾十年，雖然大量研究都在致力于尋找可靠靈敏的肝損傷生物標(biāo)志物，然而迄今仍未明確比GPT和GOT更具有特異性和敏感性的生物標(biāo)志物。

微RNA（microRNA，miRNA）miR-122最早由Lagos-Quintana等［2］在2002年從小鼠肝組織中成功鑒定，隨后發(fā)現(xiàn)也存在于人肝、原代肝細(xì)胞和肝癌細(xì)胞Huh7中［3］。miR-122在肝發(fā)育過(guò)程中持續(xù)表達(dá)，是一個(gè)調(diào)節(jié)肝發(fā)育的“肝特異性miRNA”，占所克隆的肝miRNA總量的72%，而在其他組織中幾乎檢測(cè)不到［2］。通過(guò)對(duì)不同物種之間miR-122序列比對(duì)分析發(fā)現(xiàn)，miR-122從魚(yú)類(lèi)到人類(lèi)物種之間的序列高度保守［4］。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨床試驗(yàn)均表明，血液循環(huán)miR-122與肝損傷關(guān)系密切。肝損傷后，血液循環(huán)miR-122的升高與血清GPT的峰值有很好的相關(guān)性，并且與肝組織病理改變一致［5-6］。本研究擬通過(guò)制備不同類(lèi)型的大鼠肝損傷模型以及心肌損傷和腎損傷模型，比較研究miR-122作為藥物肝損傷生物標(biāo)志物的敏感性和特異性，為其應(yīng)用于臨床前藥物肝毒性評(píng)價(jià)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器

對(duì)乙酰氨基酚（acetaminophen，APAP）（批號(hào)：20160512）、α-萘異硫氰酸酯（α-naphthyl isothiocyanate，ANIT）（批號(hào)：STBG2348V）和焦碳酸二乙酯（diethylpyrocarbonate，DEPC）（批號(hào)：BCBN2300V）購(gòu)自美國(guó)Sigma-Aldrich公司；蛋氨酸-膽堿缺乏飼料（methionine choline-deficient diet，MCDD）（批號(hào)：16072109）購(gòu)自北京科澳協(xié)力飼料有限公司；鹽酸異丙腎上腺素（isoprenaline hydrochloride，IH）（批號(hào)：41150101）注射液購(gòu)自上海禾豐制藥有限公司；慶大霉素（gentamicin，GM）（批號(hào)：20110406）購(gòu)自湖北制藥有限公司；四氯化碳（carbon tetrachloride，CCl4）（批號(hào)：20160321）和羧甲纖維素鈉（sodium carboxyl methyl cellulose，CMC-Na）（批號(hào)：20150210）購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；玉米油購(gòu)自金龍魚(yú)集團(tuán)股份有限公司；橄欖油購(gòu)自西班牙法伊吉斯有限公司；GPT、GOT、總膽紅素（total bilirubin，TBIL）和肌酐（creatinine，CREA）測(cè)定試劑盒購(gòu)自日本和光純藥工業(yè)株式會(huì)社；血尿素氮（blood urea nitrogen，BUN）測(cè)定試劑盒購(gòu)自德國(guó)羅氏診斷有限公司；大鼠腎損傷分子-1（kidney injury molecule-1，Kim-1）免疫試劑盒購(gòu)自美國(guó)R&D Systems公司；心肌肌鈣蛋白I（cardiac troponin-I，cTn I）檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó)貝克曼庫(kù)爾特有限公司；mirVanaTMmiRNA分離試劑盒購(gòu)自美國(guó)Ambion公司；miScriptSYBR?Green PCR試劑盒和miScript逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自德國(guó)Qiagen公司；miRNA特異引物（miR-103-F：5′-AGCAGCATTGTACAGGGCT-3′；miR-122-F：5′-TGGAGTGTGACAATGGTGTTTG-3′）和Trizol LS購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司。Hitachi 7060全自動(dòng)生化分析儀（日本Hitachi集團(tuán)）；Excelsior ES組織脫水機(jī)、Histocentre 3型組織包埋機(jī)、NanoDrop 1000分光光度儀和臺(tái)式高速低溫離心機(jī)（美國(guó)Thermo公司）；RM2135型旋轉(zhuǎn)石蠟切片機(jī)和ST5020HE染色儀（美國(guó)Leica公司）；PHY-III病理組織漂烘儀（常州市中威電子儀器有限公司）；Axioscope A1熒光顯微鏡（德國(guó)Zeiss公司）；實(shí)時(shí)定量PCR儀（美國(guó)Applied Biosystems公司）；SpectraMax 340PC酶標(biāo)儀（美國(guó)Molecular Devices公司）；Access 2免疫化學(xué)發(fā)光儀（美國(guó)貝克曼庫(kù)爾特有限公司）。

1.2 動(dòng)物

雄性SD大鼠，6～8周齡，SPF級(jí)，140只，體質(zhì)量180～220 g，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供，動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK（京）2012-0001。大鼠飼養(yǎng)溫度20～26℃，相對(duì)濕度40%～70%，12/12 h明暗交替，SPF環(huán)境自由進(jìn)食、飲水。動(dòng)物適應(yīng)約5 d后開(kāi)始實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)前至少禁食12 h（MCDD組除外，該組大鼠自由攝食），不禁水，給藥后正常進(jìn)食和進(jìn)水。

1.3 動(dòng)物分組、給藥和樣本采集

肝細(xì)胞損傷模型：SD大鼠ig給予APAP 1250 mg·kg-1［4］（n=25），分別于給藥后1.5，3，6，12和24 h各取5只大鼠采集血清和肝組織用于指標(biāo)檢測(cè)。溶媒對(duì)照組（n=5）給予0.5%CMC-Na，在給藥后24 h解剖采集樣品用于檢測(cè)。

肝內(nèi)膽汁淤積模型：SD大鼠ig給予ANIT 150 mg·kg-1［4］（n=25），分別于給藥后1.5，3，6，12和24 h各取5只大鼠采集血清和肝組織用于指標(biāo)檢測(cè)。溶媒對(duì)照組（n=5）給予玉米油，在給藥后24 h解剖采集樣品用于檢測(cè)。

脂肪肝模型：SD 大鼠喂食 MCDD［4，7］（n=25），分別于開(kāi)始喂食后3 d，1周，2周，3周和4周各取5只大鼠采集血清和肝組織用于指標(biāo)檢測(cè)。正常飼料對(duì)照組（n=5）喂食含蛋氨酸-膽堿的飼料（除蛋氨酸-膽堿外，其余成分與MCDD相同），在喂食4周后解剖采集樣品用于檢測(cè)。

肝纖維化模型：SD大鼠ip給予50%CCl4（橄欖油稀釋?zhuān)?］〔（n=25），1 mL·kg-1，每周給藥2次（每周的第1天和第4天給藥）〕，連續(xù)給藥8周；分別于給藥后第2，4，6，7和8周各取5只大鼠采集血清和肝組織用于指標(biāo)檢測(cè)。溶媒對(duì)照組（n=5）給予橄欖油，給藥方式同CCl4，在給藥第8周末解剖采集樣品用于檢測(cè)。

心肌損傷模型：SD大鼠尾靜脈單次iv給予IH 2.5 mg·kg-1［8］（n=5），10 mL·kg-1，給藥后4 h采集血清用于指標(biāo)檢測(cè)。溶媒對(duì)照組（n=5）給予0.9%氯化鈉注射液，給藥方式同IH。

腎損傷模型：SD大鼠im給予GM 80 mg·kg-1［9］，2 mL·kg-1，每天1次，每次每只大鼠左右后肢各注射1 mL·kg-1（n=5），連續(xù)給藥14 d，給藥后第15天采集血清用于指標(biāo)檢測(cè)。溶媒對(duì)照組（n=5）給予0.9%氯化鈉注射液，給藥方式同GM。

1.4 肝組織病理檢查

經(jīng)ip給予3%戊巴比妥鈉（40～50 mg·kg-1）麻醉大鼠，經(jīng)腹主動(dòng)脈采血后放血處死，解剖取肝，用生理鹽水洗滌，4%甲醛固定，隨后修樣、脫水、石蠟包埋，制成5 μm的切片，HE染色后光鏡下觀(guān)察肝組織病理變化。

1.5 血清生化指標(biāo)檢測(cè)

根據(jù)試劑盒說(shuō)明書(shū)使用Hitachi 7060全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)大鼠血清GPT，GOT，TBIL，CREA和BUN水平；采用SpectraMax 340PC酶標(biāo)儀檢測(cè)大鼠血清Kim-1水平；采用Access 2免疫化學(xué)發(fā)光儀檢測(cè)大鼠血清cTn I水平。

1.6 血清RNA提取

參考Zhang等［5］方法，將全血凝集后經(jīng)1600×g，4℃離心10 min收集血清，隨后將收集到的血清于16 000×g，4℃再次離心10 min，取上清500 μL置于無(wú)RNA和DNA酶的離心管中，加入Trizol LS 625 μL，混勻，室溫靜置5 min；在上述混合液中加入氯仿 167 μL，混勻，室溫放置 10 min，隨后在12 000×g，4℃離心15 min，使水相和有機(jī)相分離，并小心取上層水相液體，移至新的EP管中。之后參照miRNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)提取RNA，并采用NanoDrop 1000分光光度儀測(cè)定RNA的吸光度（absorbance，A），以A260nm/A280nm及A260nm/A230nm評(píng)估所提取RNA的濃度和質(zhì)量。只有A260nm/A280nm在1.7～2.0之間，A260nm/A230nm接近2.0的樣品用于逆轉(zhuǎn)錄qPCR定量分析。

1.7 逆轉(zhuǎn)錄及實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)

采用miScript逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。在20 μL逆轉(zhuǎn)錄體系中包括5×逆轉(zhuǎn)錄緩沖液4 μL，逆轉(zhuǎn)錄混合液1 μL，DEPC水5 μL，RNA模板10 μL，混勻后置于37℃60 min，95℃ 5 min，得到的產(chǎn)物（cDNA）于-80℃保存或用于下一步反應(yīng)。逆轉(zhuǎn)錄合成的cDNA用于實(shí)時(shí)定量PCR，其20 μL反應(yīng)體系包括2×SYBR Green Mix 10 μL，反向引物0.5 μL（試劑盒中提供），正向引物1 μL，DEPC水7.5 μL，cDNA模板1 μL。反應(yīng)條件：95℃酶化15 min；95℃變性15 s，60℃退火延伸1 min，共40個(gè)循環(huán)。以?xún)?nèi)源性miR-103為內(nèi)參［10］，并參考文獻(xiàn)［11］方法用2-ΔΔCt表示miR-122的相對(duì)表達(dá)水平。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

實(shí)驗(yàn)結(jié)果數(shù)據(jù)以±s表示，采用SPSS 21.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。組間比較采用t檢驗(yàn)、單因素方差分析或Kruskal-Wallis檢驗(yàn)，多重比較采用Dunnettt檢驗(yàn)。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 4種肝損傷模型大鼠肝功能和組織形態(tài)改變及miR-122敏感性比較

2.1.1 肝細(xì)胞損傷模型肝功能和組織形態(tài)改變

ig給予APAP 1250 mg·kg-1后24 h，大鼠血清GPT，GOT和TBIL水平顯著高于溶媒對(duì)照組（P＜0.01），分別是溶媒對(duì)照組的9.5，6.0和2.6倍（表1）。組織病理學(xué)觀(guān)察（圖1A）發(fā)現(xiàn)，溶媒對(duì)照組大鼠肝小葉結(jié)構(gòu)正常，肝板呈放射狀排列，肝細(xì)胞形態(tài)正常；模型組大鼠肝板排列紊亂，并見(jiàn)肝細(xì)胞肥大和壞死，提示肝細(xì)胞損傷模型制備成功。

2.1.2 肝內(nèi)膽汁淤積模型肝功能和組織形態(tài)改變

ig給予ANIT 150 mg·kg-1后24 h，大鼠血清GPT，GOT及TBIL顯著高于溶媒對(duì)照組，分別是溶媒對(duì)照組的3.9，2.4和2.3倍（P＜0.01）（表1）。組織病理學(xué)觀(guān)察（圖1B）發(fā)現(xiàn)，溶媒對(duì)照組大鼠肝小葉結(jié)構(gòu)正常，肝細(xì)胞形態(tài)正常；模型組大鼠肝內(nèi)膽管增生，提示大鼠肝內(nèi)膽汁淤積模型制備成功。另外，本模型TBIL水平與APAP誘導(dǎo)的肝細(xì)胞損傷模型接近，主要是由于除了在膽汁淤積時(shí)TBIL明顯升高外，在肝細(xì)胞腫脹、壞死等肝實(shí)質(zhì)性損傷中TBIL也可顯著升高。

Tab.1 Changes of glutamic pyruvic transaminase（GPT），glutamic oxaloacetic transaminase（GOT）and total bilirubin（TBlL）in different liver injury models in rats

Fig.1 Liver histopathological changes in different liver injury models in rats（HE staining）.See Tab.1 for the rat treatment.1：vehicle or normal diet control；2：liver injury model.A：hepatocellular injury model（×400），yellow arrows show centrilobular hepatocellular hypertrophy and necrosis with inflammatory reaction；B：cholestasis model（×200），yellow arrows show intrahepatic bile duct hyperplasia；C：hepatic steatosis model（×200），yellow arrows show steatosis（vacuolization）；D：hepatic fibrosis model（×200），yellow arrows show hepatocellular necrosis and fibrosis.

2.1.3 脂肪肝模型肝功能和組織形態(tài)改變

MCDD飼料喂食4周后，大鼠GPT和GOT活性顯著高于正常飼料對(duì)照組（含蛋氨酸-膽堿飼料組），分別是對(duì)照組的2.5和1.4倍（P＜0.01，P＜0.05）（表1）。組織病理學(xué)觀(guān)察（圖1C）發(fā)現(xiàn)，對(duì)照組大鼠肝小葉結(jié)構(gòu)正常，肝細(xì)胞形態(tài)正常；模型組大鼠肝組織可見(jiàn)大量空泡變性，提示大鼠脂肪肝模型制備成功。

2.1.4 肝纖維化模型肝功能和組織形態(tài)改變

ip給予50%CCl48周后，大鼠GPT，GOT及TBIL顯著高于溶媒對(duì)照組，分別是溶媒對(duì)照組的6.6，3.5和1.8倍（P＜0.01，P＜0.01，P＜0.05）（表1）。組織病理學(xué)觀(guān)察（圖1D）發(fā)現(xiàn)，溶媒對(duì)照組大鼠肝小葉結(jié)構(gòu)正常，肝細(xì)胞形態(tài)正常；模型組大鼠可見(jiàn)散在肝細(xì)胞壞死和纖維化，提示大鼠肝纖維化模型制備成功。

2.1.5 miR-122與傳統(tǒng)肝損傷生化指標(biāo)敏感性比較

肝細(xì)胞損傷模型、肝內(nèi)膽汁淤積模型、脂肪肝模型以及肝纖維化模型中，不同時(shí)間點(diǎn)血清miR-122和傳統(tǒng)生物標(biāo)志物GPT，GOT以及TBIL水平的變化見(jiàn)圖2。

在肝細(xì)胞損傷模型中，在給藥后1.5～6 h，GPT，GOT以及TBIL的改變均＜2倍。而血清miR-122在給藥后1.5 h即升高到溶媒對(duì)照組的3.6倍；隨后逐漸升高，至給藥后12 h達(dá)高峰，是溶媒對(duì)照組的235.8倍；給藥后24 h開(kāi)始下降，為溶媒對(duì)照組的67.3倍（圖2A）。由此可見(jiàn)，在APAP誘導(dǎo)的肝細(xì)胞損傷模型中，血清miR-122升高的時(shí)間早于傳統(tǒng)指標(biāo)，且升高倍數(shù)也明顯高于傳統(tǒng)指標(biāo)。

在肝內(nèi)膽汁淤積模型中，ANIT給藥后12 h內(nèi)，GPT，GOT和TBIL開(kāi)始逐漸升高，但在12 h內(nèi)各時(shí)間點(diǎn)與溶媒對(duì)照組相比的升高倍數(shù)均＜2倍。而血清miR-122在給藥后3 h即升高到溶媒對(duì)照組的3.9倍，隨后逐漸升高，至給藥后24 h達(dá)高峰，為溶媒對(duì)照組的202.7倍（圖2B）。由此可見(jiàn)，在ANIT誘導(dǎo)的肝內(nèi)膽汁淤積模型中，血清miR-122出現(xiàn)升高的時(shí)間早于傳統(tǒng)指標(biāo)，且升高倍數(shù)也明顯高于傳統(tǒng)指標(biāo)。

在大鼠脂肪肝模型中，與正常飼料對(duì)照組相比，GPT在MCDD處理3周后出現(xiàn)升高，但至第3周升高倍數(shù)仍＜2倍（為1.7倍）；在MCDD喂食過(guò)程中，GOT和TBIL升高倍數(shù)均＜2倍。而血清miR-122在喂食第2周起即逐漸升高，達(dá)對(duì)照組的4倍；至第4周達(dá)高峰，為正常飼料對(duì)照組的73.8倍（圖2C）。由此可見(jiàn)，在MCDD誘導(dǎo)的大鼠脂肪肝模型中，血清miR-122出現(xiàn)升高的時(shí)間和倍數(shù)均早于或高于傳統(tǒng)指標(biāo)。

在大鼠肝纖維化模型中，GPT和GOT在給藥第6周開(kāi)始逐漸升高，但6周內(nèi)升高倍數(shù)均＜2倍。TBIL在給藥第7和8周與溶媒對(duì)照組相比有升高，但均＜2倍。而血清miR-122在給藥第4周即升高到溶媒對(duì)照組的2.2倍；隨后逐漸升高，至第8周達(dá)高峰，為溶媒對(duì)照組的600.3倍（圖2D）。由此可見(jiàn)，在CCl4誘導(dǎo)的大鼠肝纖維化模型中，血清miR-122出現(xiàn)升高的時(shí)間和倍數(shù)均早于或高于傳統(tǒng)指標(biāo)。

Fig.2 Fold changes of GPT，GOT，TBlL and microRNA-122（miR-122）in different liver injury models in rats.See Tab.1 for the rat treatment.A：hepatocellular injury model，serum was collected at 1.5，3，6，12 and 24 h after APAP administration.B：cholestasis model，serum was collected at 1.5，3，6，12 and 24 h after ANIT administration.C：hepatic steatosis model，serum was collected at 3，7，14，21 and 28 d after MCDD feeding.D：hepatic fibrosis model，serum was collected at 2，4，6，7 and 8 week after CCl4administration.±s，n=5.

2.2 心肌和腎損傷模型大鼠臟器功能和形態(tài)的改變及miR-122特異性比較

2.2.1 心肌損傷模型大鼠心肌GOT，cTn l和形態(tài)表現(xiàn)

模型組大鼠給藥后4 h GOT和cTn I均顯著高于溶媒對(duì)照組（P＜0.01，P＜0.05）（表2）。組織病理學(xué)觀(guān)察（圖3A）發(fā)現(xiàn)，溶媒對(duì)照組大鼠心肌細(xì)胞形態(tài)正常，IH組大鼠心肌細(xì)胞出現(xiàn)變性壞死，提示大鼠心肌損傷模型制備成功。

Tab.2 Changes of GOT and cardiac troponin-l（cTn l）in isoprenaline hydrochloride（lH）-induced myocardial injury model in rats

2.2.2 腎損傷模型大鼠腎功能及形態(tài)表現(xiàn)

模型組大鼠給藥后15 d，BUN，CREA和Kim-1顯著高于溶媒對(duì)照組（P＜0.01）（表3）。組織病理學(xué)觀(guān)察（圖3B）發(fā)現(xiàn)，溶媒對(duì)照組大鼠腎小球和腎小管形態(tài)正常，GM組大鼠腎小管出現(xiàn)變性壞死，提示腎損傷模型建立成功。

2.2.3 miR-122作為肝損傷生物標(biāo)志物的特異性比較

Fig.3 Myocardial and renal histopathological changes in lH-induced myocardial injury model rats（A）and in GM-induced renal injury model rats（B）（HE staining）.See Tab.2 and Tab.3 for the rat treatment.1：vehicle control；2：model.A：yellow arrows show myocardial degeneration and necrosis（×100）；B：yellow arrows show tubular degeneration and necrosis（×200）.

Tab.3 Changes of creatinine（CREA），blood urea nitrogen（BUN）and kidney injury molecule-1（Kim-1）in gentamicin（GM）-induced renal injury model rats

由表4可見(jiàn)，在IH誘導(dǎo)的大鼠心肌損傷模型中，可見(jiàn)GOT明顯升高，是溶媒對(duì)照組的2.1倍。另外，盡管心肌損傷模型組GPT與溶媒對(duì)照組相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，但仍可見(jiàn)GPT有升高趨勢(shì)。但血清miR-122在模型組和溶媒對(duì)照組間無(wú)差異，提示在心肌損傷模型中，miR-122的特異性?xún)?yōu)于傳統(tǒng)指標(biāo)。在GM誘導(dǎo)的大鼠腎損傷模型中，GPT和GOT與溶媒對(duì)照組相比無(wú)明顯差異，同時(shí)miR-122在模型組和溶媒對(duì)照組間也無(wú)明顯差異，提示在無(wú)肝損傷模型中，miR-122未出現(xiàn)假陽(yáng)性改變。

Tab.4 Changes of GPT，GOT and miR-122 in lH-induced myocardial model and GM-induced renal injury model in rats

3 討論

無(wú)論在臨床前還是臨床試驗(yàn)中，藥物誘導(dǎo)的肝損傷是目前導(dǎo)致藥物開(kāi)發(fā)失敗的主要原因之一。本研究采用國(guó)內(nèi)外公認(rèn)的方式［4，7］成功制備了不同類(lèi)型的大鼠肝損傷模型，包括急性肝損傷模型（如APAP誘導(dǎo)的肝細(xì)胞損傷模型和ANIT誘導(dǎo)的肝內(nèi)膽汁淤積模型）以及慢性肝損傷模型（如MCDD誘導(dǎo)的脂肪肝模型和CCl4誘導(dǎo)的肝纖維化模型）。在這些模型中，血清miR-122出現(xiàn)升高的時(shí)間均早于傳統(tǒng)生物標(biāo)志物GPT，GOT和TBIL。另外，在出現(xiàn)改變的同一時(shí)間點(diǎn)，血清miR-122的升高程度均顯著高于GPT，GOT和TBIL，提示血清miR-122作為肝損傷生物標(biāo)志物的敏感性高于傳統(tǒng)指標(biāo)。

上述情況的出現(xiàn)可能與miRNA的特性相關(guān)。miRNA主要通過(guò)與靶mRNA的3’-或5’-非翻譯區(qū)以及編碼區(qū)的堿基互補(bǔ)配對(duì)調(diào)整靶mRNA的穩(wěn)定性，在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控靶基因的表達(dá)［12-13］。因此，在miRNA水平的改變通常會(huì)早于蛋白水平的改變。另外，miRNA除了可以通過(guò)組織、細(xì)胞損傷進(jìn)而導(dǎo)致其被動(dòng)漏出的方式（與傳統(tǒng)生物標(biāo)志物進(jìn)入血循環(huán)相似）進(jìn)入血液循環(huán)［14］外，還可以通過(guò)微泡（包括外泌體和脫落的囊泡等膜性結(jié)構(gòu)）主動(dòng)分泌［15-16］，以RNA結(jié)合蛋白形式主動(dòng)分泌入血液循環(huán)［17］。因此，在未出現(xiàn)細(xì)胞損傷進(jìn)而被動(dòng)漏出的情況下，高表達(dá)的miR-122可能會(huì)通過(guò)其他途徑提前進(jìn)入血循環(huán)中。肝損傷發(fā)生時(shí)，血清miR-122的升高水平要顯著高于傳統(tǒng)肝損傷生物標(biāo)志物，這可能與miRNA檢測(cè)方法（實(shí)時(shí)定量PCR）的高敏感和高特異相關(guān)。

在急性肝損傷模型中，給藥后12和24 h，血清miR-122均有明顯升高，但在APAP誘導(dǎo)的肝細(xì)胞損傷模型中，給藥后24 h血清miR-122水平開(kāi)始逐漸下降，提示對(duì)于急性肝損傷，血清miR-122的檢測(cè)可以考慮在給藥后12～24 h內(nèi)進(jìn)行。而在慢性肝損傷模型中，血清miR-122一直呈現(xiàn)升高態(tài)勢(shì)，定期檢測(cè)將有助于慢性肝損傷的確定。

在采用IH制備的心肌損傷模型中，傳統(tǒng)指標(biāo)GOT也出現(xiàn)顯著升高，這與GOT在心肌中的活性較高密切相關(guān)。而在心肌損傷模型中血清miR-122水平與對(duì)照組水平相當(dāng)，這與miR-122的肝組織特異性分布相關(guān)。據(jù)報(bào)道，在小鼠、大鼠和人肝組織中miR-122高度表達(dá)，在其他組織表達(dá)很低甚至檢測(cè)不到，而且miR-122表達(dá)量占肝中所有miRNA的70% 以上［2-3，18］。

在腎損傷模型中，血清miR-122與傳統(tǒng)肝損傷生物標(biāo)志物一樣均未見(jiàn)明顯改變，提示在無(wú)肝損傷情況下，血清miR-122不會(huì)出現(xiàn)假陽(yáng)性改變，這也進(jìn)一步體現(xiàn)miR-122表達(dá)的肝組織特異性。

綜上所述，血清miR-122無(wú)論是敏感性還是特異性均優(yōu)于傳統(tǒng)肝損傷生物標(biāo)志物。在急性肝損傷中，血清miR-122的檢測(cè)可以考慮在給藥后12～24 h內(nèi)進(jìn)行；而在慢性肝損傷模型中，定期檢測(cè)血清miR-122將有助于慢性肝損傷的診斷。

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2017-04-20 接受日期：2017-07-19）

（本文編輯：齊春會(huì)）

Comparison on sensitivity and specificity of serum miR-122 as biomarkers of drug-induced liver injury

TANG Na-ping1,2,CHEN Jie2,WANG Yan2,GE Shuai2,MA Jing2,MEI Qi-bing1
(1.School of Life Sciences,Northwestern Polytechnical University,Xi′an 710071,China;2.China National Shanghai Center for New Drug Safety Evaluation and Research,China State Institute of Pharmaceutical Industry,Shanghai 201203,China)

OBJECTlVETo make a comparison of sensitivity and specificity between serum miR-122 and traditional biomarkers of drug-induced liver injury.METHODSAcetaminophen(APAP,1250 mg·kg-1,ig),α-naphthylisothiocyanate(ANIT,150 mg·kg-1,ig),methionine-choline deficient diet(MCDD,free feeding)and carbon tetrachloride(CCl4,50%,ip)were used to establish hepatocellular injury,cholestasis,steatosis and fibrosis models,respectively,which were used to evaluate the sensitivity of serum miR-122 as a biomarker of drug-induced liver injury,when compared with the traditional biomarkers.Isoprenaline hydrochloride(IH)and gentamicin(GM)were used to establish myocardial and renal injury models,respectively,which were used to evaluate the specificity of serum miR-122,when compared with the traditional biomarkers.Serum and liver tissues were collected at different time points during the study.Traditional biomarkers such as glutamic-pyruvic transaminase(GPT),glutamic-oxaloacetic transaminase(GOT)and total bilirubin(TBIL)were measured with an automatic biochemistry analyzer.MiR-122 was detected with real-time quantitative PCR.Histopathological examination with HE staining was performed for liver tissues.RESULTSSerum miR-122 increased significantly earlier[miR-122 was significantly increased(＞2 fold)at 1.5 h,3 h,2 weeks and 4 weeks after treatment in the four models respectively,while no significant increase(＜2 fold)was observed for GPT,GOT and TBIL at 6 h,12 h,3 weeks and 6 weeks after treatment in the four models respectively]and more signficantly(the maximum fold change for miR-122 was 235.8,202.7,73.8 and 600.3 for the four models,respectively.For the GPT,the maximum fold change was 9.5,3.9,2.5 and 6.6,respectively;6.0,2.4,1.4 and 3.5 respectively for GOT;2.6,2.3,1.2 and 1.8 respectively for TBIL)than that of traditional biomarkers in hepatocellular injury,cholestasis,steatosis and fibrosis models,when compared with the control group.In the myocardial injury model,a significant increase of GOT was observed after IH treatment(2.1 fold),while no change was observed for serum miR-122.In the renal injury model,no false positive results were observed for serum miR-122.CONCLUSlONSerum miR-122 can be used as a biomarker of drug-induced liver injury and serum miR-122 is more sensitive and specific than traditional biomarkers(such as GPT,GOT and TBIL).

liver injury;biomarkers;miR-122;sensitivity;specificity

The project supported by National Natural Science Foundation of China(81273603);Shanghai Rising-Star Program(14QB1400400);and Specified Fund of Laboratory Animal Study of the Science and Technology Commission of Shanghai Municipality(14140900900)

TANG Na-ping,E-mail:nptang@ncdser.com,Tel:(021)60211999

R963

A

1000-3002-（2017）07-0714-08

DOl：10.3867/j.issn.1000-3002.2017.07.003

國(guó)家自然科學(xué)基金（81273603）；上海市青年科技啟明星計(jì)劃（14QB1400400）；上海科委實(shí)驗(yàn)動(dòng)物專(zhuān)項(xiàng)基金（14140900900）

湯納平，男，博士研究生，主要從事微RNA相關(guān)作用研究。

湯納平，E-mail：nptang@ncdser.com，Tel：（021）60211999