基于高效液相色譜-串級質(zhì)譜法研究肝微粒體中T-2毒素代謝的種屬差異性

林妮妮，郭 磊，陳 佳，謝劍煒

（軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院毒物藥物研究所毒物分析實(shí)驗(yàn)室，抗毒藥物與毒理學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100850）

基于高效液相色譜-串級質(zhì)譜法研究肝微粒體中T-2毒素代謝的種屬差異性

林妮妮，郭 磊，陳 佳，謝劍煒

（軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院毒物藥物研究所毒物分析實(shí)驗(yàn)室，抗毒藥物與毒理學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100850）

目的比較T-2毒素在不同種屬動物肝微粒體中代謝的差異性。方法將T-2毒素與小鼠、大鼠、比格犬、猴和人肝微粒體37℃孵育不同時(shí)間，孵育液經(jīng)蛋白沉淀后采用高效液相色譜-質(zhì)譜法檢測，比較T-2毒素在不同種屬動物中代謝動力學(xué)參數(shù)及代謝產(chǎn)物生成量的差異。結(jié)果T-2毒素在人肝微粒體中半衰期（t1/2）＜1 mim，在小鼠和猴肝微粒體中為2～4 min，在比格犬肝微粒體中為13 min，在大鼠肝微粒體中為39 min。5種動物對T-2毒素的肝清除能力可分為3組，即人、比格犬和大鼠為1組；猴和小鼠各為1組。其中小鼠組對T-2毒素的肝清除率是人、比格犬和大鼠組的3～4倍。不同種屬的肝微粒體對T-2毒素的親和力存在顯著差異，其中T-2毒素在小鼠肝微粒體中的親和力最高，其余依次為人、比格犬、大鼠和猴。酶的轉(zhuǎn)化速率以在猴肝微粒體中最大，大鼠和比格犬中略小，而人和小鼠肝微粒體中酶轉(zhuǎn)化速率僅為猴肝微粒體中轉(zhuǎn)化速率的1/106。T-2毒素在猴肝微粒體中主要代謝產(chǎn)物為3′-OH-T-2和新茄病鐮刀菌烯醇，在人和大鼠肝微粒體中為T-2三醇和HT-2毒素，在比格犬肝微粒體中以HT-2毒素和3′-OH-T-2毒素為主，在小鼠中則以T-2三醇和3′-OH-T-2毒素為主。T-2毒素在小鼠、大鼠、比格犬和人肝微粒體中主要以水解代謝轉(zhuǎn)化為主，而在猴肝微粒體中則以羥基化代謝為主。結(jié)論T-2毒素的代謝參數(shù)、代謝產(chǎn)物及其生成量、代謝途徑均存在種屬差異性。

T-2毒素；種屬差異；肝微粒體；液質(zhì)聯(lián)用法

近年來，毒理學(xué)研究中體外測試方法發(fā)展迅速。盡管體外測試尚不能完全代替動物試驗(yàn)，但在毒性篩選以及作用機(jī)制等研究方面具有很大的優(yōu)勢和發(fā)展前景。藥物或毒物的動物種屬差異性研究是體外測試關(guān)注的重點(diǎn)之一，可為動物的毒理學(xué)數(shù)據(jù)外推至人體以及動物模型提供重要數(shù)據(jù)支持。

T-2毒素屬于單端孢霉烯族類毒素中的A類毒素，是該類毒素中毒性最強(qiáng)的真菌毒素，并且極易污染農(nóng)作物，其中玉米、燕麥、小麥和大麥等糧食作物受污染最為嚴(yán)重，帶來一系列食品安全問題。世界糧農(nóng)組織和世界衛(wèi)生組織把T-2毒素列為自然界存在的最危險(xiǎn)的食品污染源［1］。歐盟食品科學(xué)委員會在2001年頒布了一項(xiàng)臨時(shí)標(biāo)準(zhǔn)，限制每日T-2毒素與HT-2毒素之和的允許限量為0.06 μg·kg-1。已有研究表明，T-2毒素結(jié)構(gòu)中，環(huán)氧環(huán)和雙鍵是其毒性作用的關(guān)鍵基團(tuán)，環(huán)氧環(huán)打開或雙鍵還原均可使T-2毒素毒性下降［2］。T-2毒素代謝產(chǎn)物與原型具有相同的母核結(jié)構(gòu)，大多數(shù)代謝產(chǎn)物仍然保留環(huán)氧環(huán)和雙鍵，與原型具有相似的毒性。因此，T-2毒素代謝產(chǎn)物的毒性亦是人們關(guān)注的重點(diǎn)。本研究在建立高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用分析方法的基礎(chǔ)上，研究T-2毒素在體內(nèi)主要毒性靶器官肝微粒體中的代謝動力學(xué)、代謝產(chǎn)物和代謝途徑等的種屬差異性，為合理選擇毒理學(xué)動物研究模型提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑和儀器

玉米赤霉酮（zearalanone，ZAN）、新茄病鐮刀菌烯醇（neosolaniol，NEO）、3′-羥基-T-2 毒素（3′-OH-T-2 toxin）、T-2 三醇（T-2 triol，TRIOL）、HT-2毒素、T-2毒素和乙?；疶-2毒素（acetyl T-2 toxin）標(biāo)準(zhǔn)品及甲醇和乙腈（色譜純）購自美國Sigma Aldrich公司；還原型輔酶Ⅱ四鈉鹽（NADPHNa4）購自瑞士Roche公司；甲酸銨和乙酸銨購自美國Fisher公司；小鼠、大鼠、比格犬、猴和人肝微粒體（蛋白質(zhì)濃度20 g·L-1）均購自于北京匯智泰康醫(yī)藥技術(shù)有限公司；實(shí)驗(yàn)用水為Milli-Q超純水購自美國Millipore公司。Agilent 1200型高效液相色譜儀、6430型三重四極桿質(zhì)譜儀和XDB-C18反相色譜柱（50 mm×4.6 mm，ID1.8 μm）（Agilent公司，美國）；RVC 2-33 CD plus型冷阱-隔膜泵-離心蒸發(fā)濃縮儀（Christ公司，德國）；HW.SY11-K2型電熱恒溫水浴鍋（北京長風(fēng)儀器公司）；PL203型電子天平（Mettler Toledo公司，德國）；Eppendorf Centrifuge 5418型高速離心機(jī)（Eppendorf公司，德國）。

1.2 液相色譜-質(zhì)譜條件

液相色譜條件：A相為5 mmol·L-1乙酸銨水溶液，B相為5 mmol·L-1乙酸銨甲醇溶液。梯度條件為：0～0.5 min，65%B；0.5～3.5 min，65%B～100%B；3.5～6.0 min，100%B；6.0～6.1 min，100%B～65%B；6.1～7.0min，65%B。柱溫40℃，流速0.5mL·min-1，進(jìn)樣5 μL。

質(zhì)譜條件：離子源，電噴霧離子源；模式，正離子模式；檢測方式，多反應(yīng)監(jiān)測（multiple reaction monitoring，MRM）模式；霧化氣35 psi，干燥氣8 L·min-1，源溫350℃。6種分析物及內(nèi)標(biāo)的定量離子對及質(zhì)譜參數(shù)見表1。

Tab.1 Mass spectrometry（MS）parameters of 6 analytes and internal standard（lS）

1.3 不同種屬動物肝微體中T-2毒素代謝產(chǎn)物生成量的比較

固定 T-2 毒 素 濃度 為 20 μmol·L-1，孵 育120 min，其余按1.2方法操作，考察不同種屬動物中代謝產(chǎn)物的生成量。

1.4 不同種屬動物肝微粒體中T-2毒素的代謝

配制濃度為20 mmol·L-1的T-2毒素乙腈溶液（-20℃可穩(wěn)定儲存3個月），以PBS溶液稀釋至0.1，0.5，1，10，20，50，100，200和1000 μmol·L-1。冰浴條件下，分別取上述溶液100 μL，加入蛋白質(zhì)終濃度為0.5 g·L-1的肝微粒體80 μL中，37℃預(yù)孵育5 min后加入NADPHNa4（10 mmol·L-1）溶液20 μL，再于37℃孵育一定時(shí)間，然后加入200 μL終止液（V甲醇∶V乙腈=3∶1，含內(nèi)標(biāo)ZAN）終止反應(yīng)，渦旋2 min，以14 243×g離心10 min，取上清液進(jìn)樣，LC-MS/MS分析。每個時(shí)間點(diǎn)平行制備3份樣品。另外，分別取上述溶液100 μL，首先加入終止液，再加入肝微粒體80 μL。以PBS液代替NADPHNa4溶液，其余同上述操作，作為肝微粒體失活對照。按失活對照方法，采用不同濃度的T-2毒素進(jìn)行同法操作，進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證。

依據(jù)測得的半衰期（t1/2），小鼠、大鼠、比格犬、猴和人肝微粒體孵育時(shí)間分別為20，30，20，5和2 min。

1.5 數(shù)據(jù)處理與分析

以T-2毒素在0時(shí)的濃度為100%，其他時(shí)間點(diǎn)的濃度與0時(shí)濃度比較得到T-2毒素的剩余百分比。將各時(shí)間點(diǎn)的剩余百分比的自然對數(shù)與對應(yīng)的孵育時(shí)間作圖，經(jīng)直線回歸求得斜率-k，由式①求得T-2毒素微粒體代謝的t1/2（min），應(yīng)用Well Stirred模型［3］式②和式③對微粒體實(shí)驗(yàn)的相關(guān)數(shù)據(jù)進(jìn)行外推可得到T-2毒素在小鼠、大鼠、比格犬、猴和人肝中的固有清除率Clint（mL·min-1·kg-1）和肝清除率Clh（mL·min-1·kg-1），其中相關(guān)的理化參數(shù)經(jīng)驗(yàn)值見表2［3-5］。應(yīng)用SigmaPlot（10.0）軟件擬合得到米氏常數(shù)（Km）和酶轉(zhuǎn)化數(shù)（Vmax）值［6］。

Tab.2 Physiological parameters used for calculation on Clintand Clhin liver microsomes

2 結(jié)果

2.1 分析方法驗(yàn)證

研究表明，分析物在不同種屬肝微粒體中的基質(zhì)效應(yīng)無明顯差異（圖略）。因此，本研究采用SD大鼠肝微粒體繪制校正工作曲線。通過對10份不同批次的大鼠肝微粒體平行測定，結(jié)果表明其對分析物無明顯干擾（圖1）。

Fig.1 Multiple reaction monitoring（MRM）chromatograms of incubating samples of blank liver microsomes（A）and liver microsomes mixed standards（B）.The chromatograms were attained under the following conditions：water with 5 mmol·L-1ammonium acetate（mobile phase A）and methanol with 5 mmol·L-1（mobile phase B）in the gradient of 0-0.5 min，65%B；0.5-3.5 min，65%B-100%B；3.5-6.0 min，100%B；6.0-6.1 min，100%B-65%B；6.1-7.0 min，65%B.Column temperature was 40℃，and MS model was MRM.1：NEO；2：3′-OH-T-2 toxin；3：TRIOL；4：HT-2 toxin；5：T-2 toxin；6：ZAN；7：acetyl T-2 toxin.

各分析物在0.005～20 mmol·L-1的濃度范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系，其R2＞0.990，檢出限為0.001～0.02 mmol·L-1，回收率為82.2%～119.1%。提示本方法快速且靈敏，可應(yīng)用于T-2毒素及其代謝物的檢測。

2.2 T-2毒素在不同種屬動物肝微粒體中的代謝差異

2.2.1 T-2毒素的代謝產(chǎn)物

將T-2毒素在不同種屬動物肝微粒體中進(jìn)行孵育，采用液相色譜-質(zhì)譜進(jìn)行產(chǎn)物鑒定和產(chǎn)物生成量的測定，結(jié)果如表3所示。

2.2.2 T-2毒素的代謝動力學(xué)參數(shù)

圖2系半對數(shù)作圖法計(jì)算消除速率所得。以不同時(shí)間T-2毒素剩余濃度百分比的對數(shù)與孵育時(shí)間作圖法計(jì)算消除速率。T-2毒素在不同種屬動物肝微粒體中呈線性消除，由此得到T-2毒素的消除參數(shù)（表4）。

Fig.2 Semi-logarithm plot of remaining percentage of T-2 toxin-incubation time in liver microsomes of mice，rats，Beagle dogs，monkeys and humans.Semilog plot for the estimates of elimination rate constants.The semilog plots were conventionally used to convert the exponential decay to the linear first order process facilitating the k determination.Ctwas the concentration of T-2 toxin at time t，C0was the initial incubation concentration.

Tab.3 Results of T-2 toxin biotransformaton in liver microsomes of mice，rats，Beagle dogs，monkeys and humans

3 討論

T-2毒素在各種屬動物肝微粒體中孵育120 min后，均檢測不到其原型，表明其已完全代謝，同時(shí)均可檢測到包含3′-OH-T-2毒素、HT-2毒素、NEO和TRIOL等在內(nèi)的多種代謝產(chǎn)物，但其生成量依種屬不同而呈現(xiàn)出較大差異。在比格犬肝微粒體中，T-2毒素轉(zhuǎn)化生成上述4種代謝物的比例高達(dá)89.1%，在其他種屬肝微粒體中其轉(zhuǎn)化比例均較低，在小鼠肝微粒體中的轉(zhuǎn)化比例最低，為38.9%。通過分析3′-OH-T-2毒素、HT-2毒素、NEO和TRIOL等4種主要代謝產(chǎn)物之間的含量可知，該4種代謝產(chǎn)物在比格犬肝微粒體中的轉(zhuǎn)化生成量相近，在猴肝微粒體中主要代謝產(chǎn)物為3′-OHT-2毒素和NEO，而在人和大鼠肝微粒體中主要代謝產(chǎn)物為TRIOL和HT-2毒素，表現(xiàn)出顯著的種屬差異性。

本研究結(jié)果表明，T-2毒素在人肝微粒體中迅速代謝，1 min內(nèi)呈線性消除。小鼠和猴肝微粒體中T-2毒素代謝也較快，t1/2在2～4 min之間。在比格犬肝微粒體中的t1/2為13 min，而大鼠肝微粒體中T-2毒素代謝最慢，t1/2為39 min。T-2毒素在不同種屬肝微粒體中代謝速率順序?yàn)榇笫螅急雀袢己锖托∈螅既恕?/p>

在研究的5種動物中，人肝微粒體中T-2毒素的固有清除率（Clint）最高，但外推獲得的肝清除率（Clh）最低，說明雖然人肝微粒體對T-2毒素的清除較快，但T-2毒素在其中的駐留時(shí)間長，表明其對人肝損傷時(shí)間最久。綜合肝中血流（Qh）等參數(shù)，也可輔證T-2毒素在人肝中的清除率較低這一結(jié)果。其他4種動物肝微粒體中，小鼠中T-2毒素的t1/2較短，但Clint較高，外推的Clh也最大，說明小鼠肝對T-2毒素消除較快。依據(jù)Clh的大小，可以將5種動物對T-2毒素的肝清除能力分為3組，即人、比格犬和大鼠為1組；猴和小鼠各為1組。其中小鼠對T-2毒素的肝清除率是人、比格犬和大鼠的3～4倍。

Km是酶的特征性參數(shù)，1/Km近似表示酶與底物的親和力大小，1/Km越大，親和力越大。Vmax為酶的轉(zhuǎn)化速率，Vmax越大，單位時(shí)間內(nèi)對某種底物轉(zhuǎn)化效率越高。本研究結(jié)果表明，不同種屬的肝微粒體對T-2毒素的親和力存在顯著差異，T-2毒素在小鼠肝微粒體中的親和力最高，其余依次為人、比格犬、大鼠和猴，表明在小鼠和人肝微粒體中不需要很高的底物濃度便可達(dá)到最大反應(yīng)速度。酶的轉(zhuǎn)化速率以在猴肝微粒體中為最大，大鼠和比格犬肝微粒體中略小，而人和小鼠肝微粒體中Vmax與猴肝微粒體中Vmax存在數(shù)量級上的差異，僅為猴的1/106。

一般將動物實(shí)驗(yàn)結(jié)果外推至人，必須考慮不同藥物或毒物在人和動物之間種屬及性別差異性的表現(xiàn)形式及可能存在的規(guī)律［7］。通常種屬差異可分為2類：一是某種動物出現(xiàn)的生理作用或毒性在其他動物不出現(xiàn)，即質(zhì)的種屬差異，這種差異一般是由于代謝酶的有無而引起的；二是不同動物之間藥物作用的持續(xù)時(shí)間或強(qiáng)度不同，即量的種屬差異［8］。綜合上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果推測，T-2毒素在不同種屬動物肝微粒體中的主要代謝途徑及產(chǎn)物生成量雖呈現(xiàn)一定的差異性，但其主要代謝途徑均涉及水解和羥基化（圖3，以人肝微粒中代謝為例）。通過產(chǎn)物分析鑒定可知，T-2毒素在小鼠、大鼠、比格犬和人肝微粒體中主要以水解代謝轉(zhuǎn)化為主，由于這些水解代謝產(chǎn)物的毒性均較低［9-10］，故該途徑可使T-2毒素減毒；而在猴肝微粒體中則以毒性較高的羥基化產(chǎn)物3′-OH-T-2毒素為主，呈現(xiàn)出一定的增毒作用［11］。對引起這種代謝差異性的原因，本研究依據(jù)T-2毒素的酶解實(shí)驗(yàn)結(jié)果［10，12］推測，不同種屬動物中含有的羧酸酯酶量及其活性的差別可能是其主要原因。

綜上所述，本研究通過建立的高靈敏度肝微粒體中T-2毒素及其代謝物的高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜分析方法，比較研究了T-2毒素在不同種屬動物肝微粒體中的Ⅰ相代謝性質(zhì)。結(jié)果表明，不同動物種屬間呈現(xiàn)種屬差異性，在小鼠、大鼠、比格犬和人肝微粒體中以水解轉(zhuǎn)化減毒途徑為主，而在猴肝微粒體中以羥基化的增毒代謝途徑為主。T-2毒素在大鼠肝微粒體中的各代謝參數(shù)與人的較為接近，為動物實(shí)驗(yàn)結(jié)果外推至人提供了有益的參考數(shù)據(jù)。

Fig.3 Major metabolic pathways of T-2 toxin.HLM：human liver microsomes,A：NEO；B：HT-2 toxin；C：T-2 triol；D：T-2 tetraol；E：T-2 toxin；F：3′-OH-T-2 toxin；G：3′-OH-HT-2 toxin；H：3′-OH-T-2 triol.

［1］ Wang MH，Li LM，Ding XL.Research advances on T-2 toxin［J］.Chin J Anim Nutr（動物營養(yǎng)學(xué)報(bào)），2011，23（1）：20-24.

［2］Peng SQ，Dong JY，Yang JS.Studies on relationship between toxicity of trichothecene toxin T-2 and its structure［J］.Chin J Prev Med（中華預(yù)防醫(yī)學(xué)雜志），1996，30（3）：141-143.

［3］Obach RS.Prediction of human clearance of twentynine drugs from hepatic microsomal intrinsic clearance data：An examination ofin vitrohalf-life approach and nonspecific binding to microsomes［J］.DrugMetab Dispos，1999，27（11）：1350-1359.

［4］Davies B，Morris T.Physiological parameters in laboratory animals and humans［J］.Pharm Res，1993，10（7）：1093-1095.

［5］Zhou JJ.Effects of metabolism and interaction on efficacy and/or safety-in vitrostudies（天然產(chǎn)物/中藥的代謝相互作用與藥效和安全的體外研究）［D］.Shanghai：Fudan University（復(fù)旦大學(xué)），2010.

［6］ Zhang DL，Zhu MS.Griffith Humphreys W.Drug Metabolism in Drug Design and Development［M］.Hoboken，New Jersey：John Wiley&Sons，Inc.2008：424-430.

［7］Li JT.Clinical Pharmacology（臨床藥理學(xué)）［M］.2nd ed.Beijing：People′s Medical Publishing House，2001：78-79.

［8］Liu CX.Drug Evaluation（藥物評價(jià)學(xué)）［M］.Beijing：Chemical Industry Press ，2006：145-149.

［9］ Swanson SP，Rood HD Jr，Behrens JC，Sanders PE.Preparation and characterization of the deepoxy trichothecenes：deepoxy HT-2，deepoxy T-2 triol，deepoxy T-2 tetraol，deepoxy 15-monoacetoxyscirpenol，and deepoxy scirpentriol［J］.Appl Environ Microbiol，1987，53（12）：2821-2826.

［10］ K?nigs M， Mulac D， Schwerdt G， Gekle M，Humpf HU.Metabolism and cytotoxic effects of T-2 toxin and its metabolites on human cells in primary culture［J］.Toxicology，2009，258（2-3）：106-115.

［11］ Knupp CA，Swanson SP，Buck WB.Comparativein vitrometabolism of T-2 toxin by hepatic microsomes prepared from phenobarbital-induced or control rats，mice，rabbits and chickens［J］.Food Chem Toxicol，1987，25（11）：859-865.

［12］ Lin NN，Chen J，Xu B，Wei X，Guo L，Xie JW.The roles of carboxylesterase and CYP isozymes on thein vitrometabolism of T-2 toxin［J］.Mil Med Res，2015，2：13.

2016-12-09 接受日期：2017-07-06）

（本文編輯：齊春會）

Species difference of T-2 toxin metabolism in liver microsomes by high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry

LIN Ni-ni,GUO Lei,CHEN Jia,XIE Jian-wei
(Laboratory of Toxicant Analysis,Institute of Pharmacology and Toxicology,Academy of Military Medical Sciences,State Key Laboratory of Toxicology and Medical Countermeasures,Beijing 100850,China)

OBJECTlVETo compare the species difference of T-2 toxin metabolism in liver microsomes of different animals.METHODST-2 toxin was incubated with liver microsomes from mice,rats,Beagle dogs,monkeys and humans,respectively,at 37℃for some time.Then,the incubation liquid was detected by high liquid chromatography-mass spectrometry method after albumen precipitation.RESULTSThe half-life(t1/2)of T-2 toxin was less than 1 min,2-4 min in mouse and monkey liver microsomes,13 min in dog liver microsomes,and 39 min in rat liver microsomes.The hepatic clearance(Clh)of T-2 toxin was divided into three groups among the five species of animals：humans,dogs and rats were in one group,monkeys a second group,and mice in another group.The Clhof mouse group was 3-4 times that of the human,dog and rat group.The affinity to T-2 toxin was different between the liver microsomes of these five species.The affinity of mouse liver microsomes was the strongest,followed by that of humans,dogs,rats and monkeys.The enzyme transfer rate of T-2 toxin was the highest in monkey liver microsomes followed by that of rats and dogs.It was one million times higher in monkey liver microsomes than in human and mouse liver microsomes.The major metabolites were 3′-hydroxyl-T-2 toxin and neosolaniol.T-2 triol and HT-2 toxins were the major metabolites in human and rat liver microsomes.HT-2 toxin and 3′-OH-T-2 toxin were the dominating metabolites in dog liver microsomes and T-2 triol and 3′-OH-T-2 toxin in mouse liver microsomes.T-2 toxin metabolited by hydrolysis effect in mouse,rat,dog and human liver microsomes,but through hydroxylation in monkey liver microsomes.CONCLUSlONThere are species differences in metabolic parameters,metabolites,amounts of metabolites,metabolic pathways of T-2 toxin in mouse,rat,dog,monkey and human liver microsomes.

T-2 toxin;species difference;liver microsomes;high performance liquid chromatographytandem mass spectrometry

The project supported by National"Twelfth Five-Year"Plan for Science&Technology(2011BAK10B07);and National Science and Technology Major Project of China(2012ZX09301003-001-010)

XIE Jian-wei,E-mail:xiejw@bmi.ac.cn

A

1000-3002-（2017）07-0754-06

DOl：10.3867/j.issn.1000-3002.2017.07.008

“十二五”國家科技支撐計(jì)劃（2011BAK10B07）；國家科技重大專項(xiàng)（2012ZX09301003-001-010）

林妮妮，博士，助理研究員，主要從事毒素代謝研究。

謝劍煒，E-mail：xiejw@bmi.ac.cn