一氧化氮供體JS-K對H22荷瘤小鼠腫瘤能量代謝的調節(jié)作用

劉 玲，黃紫樂，慎會娜，王 靜，劉沐辰，花昌林

（河南科技大學醫(yī)學院藥學系，河南洛陽 471003）

一氧化氮供體JS-K對H22荷瘤小鼠腫瘤能量代謝的調節(jié)作用

劉 玲，黃紫樂，慎會娜，王 靜，劉沐辰，花昌林

（河南科技大學醫(yī)學院藥學系，河南洛陽 471003）

目的研究新型一氧化氮（NO）供體O2-（2，4-二硝基苯基）1-〔（4-乙氧羰基）哌嗪-1-yl〕偶氮-1-鎓-1，2-二醇（JS-K）對H22荷瘤小鼠腫瘤能量代謝的調節(jié)作用。方法BALB/c小鼠皮下接種H22細胞建立荷瘤小鼠模型，并隨機分為模型組、氟尿嘧啶（5-FU）組、JS-K 0.75和1.50 mg·kg-1組。JS-K組和模型組小鼠每3 d尾靜脈注射不同劑量JS-K或生理鹽水，連續(xù)14 d（共給藥5次）；5-FU組每天1次ip給予5-FU 20 mg·kg-1。給藥后第15天將小鼠處死，分離胸腺、脾和完整瘤體，并稱取其質量，計算抑瘤率和臟器系數(shù)。比色法檢測瘤組織中己糖激酶（HK）、丙酮酸激酶（PK）、磷酸果糖激酶（PFK）、琥珀酸脫氫酶（SDH）和腺苷三磷酸酶（ATPase）活性，以及乳酸和ATP水平；Western蛋白印跡法檢測各組瘤組織中缺氧誘導因子-1α（HIF-1α）和己糖激酶Ⅱ（HKⅡ）蛋白表達。結果與模型組比較，JS-K 0.75和1.50 mg·kg-1組瘤質量顯著下降（P＜0.01），抑瘤率分別為23.9%和50.3%。JS-K 0.75和1.50 mg·kg-1組小鼠胸腺系數(shù)和脾系數(shù)與模型組無明顯差異。比色法檢測結果顯示，JS-K 1.50 mg·kg-1組瘤組織中HK，PFK，SDH，PK和ATPase活性較模型組的〔22.6±3.7，14.4±2.6，（10.5±2.6）U·g-1蛋白，（12.9±3.2）kU·g-1蛋白和（0.70±0.10）mmolPi·g-1蛋白·h-1〕分別下降了42.0%，26.6%，23.3%，22.7%和21.7%（P＜0.01，P＜0.05）；JS-K 1.50 mg·kg-1組瘤組織中ATP水平較模型組下降16.6%（P＜0.01）；JS-K 0.75和1.50 mg·kg-1組瘤組織中乳酸水平較模型組分別下降38.7%和59.4%（P＜0.01）。Western蛋白印跡檢測結果顯示，與模型組比較，JS-K 1.50 mg·kg-1組瘤組織中HIF-1α蛋白表達顯著降低（P＜0.01）；JS-K 0.75和1.50 mg·kg-1組HKⅡ蛋白表達均顯著降低（P＜0.05，P＜0.01）。結論JS-K能抑制H22荷瘤小鼠腫瘤生長，其機制可能與抑制糖酵解和有氧氧化途徑從而調節(jié)腫瘤能量代謝有關。

一氧化氮供體；偶氮鎓二醇鹽；腫瘤；能量代謝

原發(fā)性肝癌是臨床上最常見的惡性腫瘤之一，肝癌發(fā)病率居我國惡性腫瘤發(fā)病率第4位，而在惡性腫瘤致死率中居第2位，僅次于肺癌。在我國，肝癌多在乙肝和肝硬變基礎上發(fā)展而來，其中90%為肝細胞肝癌，手術是肝癌首選的治療方法，但對于一些體質較弱、出現(xiàn)了廣泛肝外轉移或腫瘤較大的患者則不適宜手術，因此藥物治療仍是肝癌治療的主要手段之一。

一氧化氮（nitric oxide，NO）是生物體內重要的信號分子，在體內生理和病理過程中發(fā)揮重要作用，如血管擴張、神經信號傳導和腫瘤發(fā)生與轉移等。研究表明，NO對腫瘤生長具有雙重作用，低濃度NO通過參與血管形成、增加血管通透性和減少淋巴內皮細胞的黏附等效應改善血液供應而促進腫瘤生長，而高濃度NO可通過抑制血管生成和轉移、誘導細胞凋亡等機制抑制腫瘤細胞增殖［1］。由于NO在體內半衰期較短，在水溶液中不穩(wěn)定，因此開發(fā)NO供體型抗腫瘤藥物成為研究的熱點。NO供體是指在體內經酶或非酶作用釋放NO的化合物，它可作為一種NO體內運輸形式，又可作為一種貯存形式，延長NO半衰期?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)多種結構類型的NO供體，如有機硝酸酯類、亞硝基硫醇、呋咱氮氧化合物和偶氮鎓二醇鹽等，其中偶氮鎓二醇鹽類在靶向性釋放NO方面優(yōu)勢明顯［2］。O2-（2，4-二硝基苯基）1-〔（4-乙氧羰基）哌嗪-1-yl〕偶氮-1-鎓-1，2-二醇（JS-K），是在偶氮二醇鹽O2端以硝基芳香取代基進行取代，在體內某些特定酶作用下在腫瘤細胞釋放NO而發(fā)揮抗腫瘤作用。Shami等［3-4］發(fā)現(xiàn)，JS-K可選擇性地在急性粒細胞白血病HL-60細胞內釋放NO，殺滅癌細胞，而不傷害正常細胞；對免疫缺陷型小鼠體內植入的HL-60細胞及前列腺癌細胞PC-3，JS-K均能抑制其生長，且不導致小鼠血壓下降等副作用。前期研究顯示，JS-K可誘導HepG2細胞凋亡，提高Bax/Bcl-2比值，釋放細胞色素c（cytochrome c，Cyt c），升高胞漿中Ca2+水平，降低線粒體膜電位，激活胱天蛋白酶9和3［5］。為進一步研究JS-K的抗腫瘤作用，本研究通過制備H22荷瘤小鼠模型，觀察JS-K對H22荷瘤小鼠腫瘤生長的抑制作用，為該化合物的臨床應用提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 動物、藥品、試劑和主要儀器

健康雄性BALB/c小鼠40只，體質量22～24 g，由河南科技大學醫(yī)學院實驗動物中心提供，動物許可證號：SCXK（鄂）2010-0007。飼養(yǎng)環(huán)境通風良好，室溫18～25℃，光照12 h（7∶00-19∶00），相對濕度45%～55%，自由攝食飲水。

JS-K（純度≥97%，相對分子質量384），美國Santa Cruz公司。氟尿嘧啶注射液（規(guī)格10 mL∶0.25 g，批號100605），上海旭東海普藥業(yè)有限公司。己糖激酶（hexokinase，HK）、磷酸果糖激酶（phosphofructokinase，PFK）、丙酮酸激酶（pyruvate kinase，PK）、琥珀酸脫氫酶（succinate dehydrogenase，SDH）和腺苷三磷酸酶（adenosinetriphosphatase，ATPase）活性檢測試劑盒，以及乳酸和ATP含量檢測試劑盒均為南京建成生物工程研究所產品；缺氧誘導因子-1α（hypoxia-inducible factor 1 alpha，HIF-1α）和己糖激酶Ⅱ（hexokinaseⅡ，HKⅡ）兔多克隆抗體和辣根過氧化物酶（HRP）標記的羊抗兔IgG為武漢三鷹生物技術有限公司產品；其他化學試劑均為分析純。UV1901PC紫外分光光度計（上海奧析科學儀器有限公司）；酶標儀（美國Molecular Devices公司）；Mini Trans-blot電轉膜系統(tǒng)（美國Bio-Rad公司）；熒光及化學發(fā)光成像系統(tǒng)Clinx Chemi Scope2850（上海勤翔科學儀器有限公司）。

1.2 H22荷瘤小鼠模型的制備和實驗分組

H22細胞株復蘇后，以無菌生理鹽水配成濃度為1.0×107L-1，取0.2 mL接種于小鼠腹腔，7 d后選擇腹水飽滿小鼠，在超凈臺內里消毒鼠腹，無菌條件下用1mL的一次性注射器抽取乳白色腹水，置于無菌器皿內，以1∶3生理鹽水稀釋后勻漿制成瘤細胞懸液，調整瘤細胞密度為1.0×107L-1。用無菌注射器從細胞懸液中取0.2 mL，接種于經乙醇消毒后的小鼠右側腋窩皮下，整個實驗操作在1 h內完成，術后觀察動物行為無異常。接種次日，稱重，將小鼠隨機分為4組，每組8只，即模型組、5-FU組、JS-K 0.75和1.50 mg·kg-1組。JS-K組和模型組每3 d尾靜脈注射不同劑量JS-K或同體積生理鹽水，連續(xù)給藥14 d（共給藥5次），給藥容積為10 mL·kg-1。5-FU組每天1次ip給予5-FU 20 mg·kg-1，連續(xù)給藥14 d。期間每天記錄各組小鼠的體質量、進食量和生存狀態(tài)。

1.3 腫瘤抑制率和臟器系數(shù)計算

開始給藥后第15天將小鼠處死，摘取小鼠胸腺、脾及完整瘤組織，用電子天平分別稱取各組織質量，并計算抑瘤率及臟器系數(shù)。抑瘤率（%）=（模型組平均瘤質量-給藥組平均瘤質量）/模型組平均瘤質量×100%；臟器系數(shù)=臟器質量（g）/體質量（g）×100。

1.4 比色法檢測瘤組織中能量代謝相關酶活性以及乳酸和ATP含量

取部分瘤組織置于離心管中，按體積比1∶9加入生理鹽水，冰浴下用勻漿機制成組織勻漿，1368×g離心10 min，取上清液，按試劑盒操作步驟，在酶標儀上測定HK，PFK，PK，SDH和ATPase活性，及乳酸和ATP含量。采用BCA試劑盒于562 nm處測定樣品蛋白含量。

1.5 Western蛋白印跡法檢測瘤組織HlF-1 α和HKⅡ蛋白水平

將瘤組織剪碎，加裂解液裂解提取總蛋白，BCA法測定蛋白含量。用12%SDS-PAGE電泳分離蛋白，電轉印至PVDF膜上，5%脫脂奶粉常溫封閉1 h，加入一抗（稀釋倍數(shù)均為1∶1000）于封閉袋中4℃孵育過夜；二抗室溫孵育2 h。ECL化學發(fā)光法顯影，凝膠成像系統(tǒng)拍照，并對蛋白條帶進行半定量分析。以目的蛋白條帶與內參蛋白條帶積分吸光度值的比值表示目的蛋白相對表達水平。

1.6 統(tǒng)計學分析

實驗結果數(shù)據以x±s表示，經SPSS13.0軟件進行統(tǒng)計學分析，總體均數(shù)比較采用單因素方差分析，兩組間均數(shù)比較采用Dunnett t檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 JS-K對H22荷瘤小鼠腫瘤生長的影響

如表1所示，與模型組比較，JS-K 0.75和1.50 mg·kg-1組瘤質量顯著減少（P＜0.01），腫瘤生長抑制率分別達23.9%和50.3%；5-FU 20 mg·kg-1組瘤質量顯著減少（P＜0.01），腫瘤生長抑制率為60.0%。

Tab.1 lnhibition of JS-K on tumor growth in H22 tumorbearing mice

2.2 JS-K對H22荷瘤小鼠胸腺和脾系數(shù)的影響

與模型組比較，JS-K 0.75和1.50 mg·kg-1組對小鼠脾系數(shù)和胸腺系數(shù)均無顯著影響；5-FU組小鼠脾和胸腺系數(shù)顯著降低（P＜0.05，P＜0.01）（表2）。

Tab.2 Effect of JS-K on thymus and spleen coeffient in H22 tumor-bearing mice

2.3 JS-K對H22荷瘤小鼠瘤組織HK，PFK和PK活性和乳酸水平的影響

模型組小鼠瘤組織中糖酵解途徑相關的HK，PFK和PK活性分別為22.6±3.7，（14.4±2.6）U·g-1蛋白和（12.9±3.2）kU·g-1蛋白，JS-K 1.50 mg·kg-1組上述激酶活性分別下降42.0%（P＜0.01）（圖1A），26.6%（P＜0.01）（圖 1B）和 22.7%（P＜0.05）（圖1C）。模型組小鼠瘤組織中乳酸水平為（0.44±0.09）mmol·g-1蛋白，JS-K 0.75和1.50 mg·kg-1組乳酸水平分別下降38.7%（P＜0.01）和59.4%（P＜0.01）（圖1D）。5-FU組小鼠瘤組織中HK，PFK和PK活性分別下降46.9%（圖1A），34.1%（圖1B）和25.6%（圖1C），乳酸水平下降53.2%（圖1D）（P＜0.05，P＜0.01）。

Fig.1 Effect of JS-K on activities of hexokinase（HK）（A），phosphofructokinase（PFK）（B），pyruvate kinase（PK）（C）and level of lactic acid（LD）（D）in tumor tissue of H22 tumor-bearing mice by colorimetric method.See Tab.1 for the mouse treatment.±s，n=8.＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，compared with model group.

2.4 JS-K對H22荷瘤小鼠瘤組織SDH和ATPase活性及ATP水平的影響

模型組小鼠瘤組織中有氧氧化途徑的SDH和ATPase活性分別為（10.5±2.6）U·g-1蛋白和（0.70±0.10）mmolPi·g-1protein·h-1；與模型組比較，JS-K 1.50 mg·kg-1組SDH和ATPase活性分別下降 23.3%（P＜0.05）（圖 2A）和 21.7%（P＜0.01）（圖2B）。JS-K 1.50 mg·kg-1組ATP水平由模型組的（303±24）mmol·g-1蛋白下降16.6%（P＜0.01）（圖2C）。5-FU組SDH和ATPase活性分別下降26.0%（P＜0.05）（圖 2A）和 27.9%（P＜0.01）（圖2B），ATP水平下降14.9%（P＜0.01）（圖2C）。

2.5 JS-K對H22荷瘤小鼠瘤組織HlF-1 α和HKⅡ蛋白表達的影響

如圖3所示，與模型組比較，JS-K 1.50 mg·kg-1組小鼠瘤組織HIF-1α蛋白表達顯著降低（P＜0.01）；JS-K 0.75和1.50 mg·kg-1組HKⅡ蛋白表達均顯著降低（P＜0.05，P＜0.01）。

Fig.3 Effect of JS-K on expressions of hypoxia-inducible factor-1 alpha（HlF-1 α）and hexokinaseⅡ（HKⅡ）in tumor tissue of H22 tumor-bearing mice by Western blotting.See Tab.1 for the mouse treatment.B was the semiquantitative result of A.IA：integrated absorbance.±s，n=8.＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，compared with model group.

3 討論

本研究結果顯示，模型組小鼠平均瘤質量為（1.62±0.12）g，腫瘤生長良好，提示造模成功。5-FU是一種人工合成的抗代謝藥，對消化道腫瘤、肝癌和膀胱癌等均有一定的療效。本研究中，5-FU在20 mg·kg-1劑量下能顯著抑制荷瘤小鼠腫瘤生長，但使小鼠脾系數(shù)和胸腺系數(shù)顯著降低，提示其對免疫器官具有一定損傷作用。JS-K給藥組也可抑制腫瘤生長，在1.5 mg·kg-1劑量下抑瘤作用顯著，且對小鼠脾系數(shù)和胸腺系數(shù)均無顯著影響。提示JS-K在治療肝癌方面可能具有很好的應用前景。

細胞代謝需要ATP提供能量，主要通過糖酵解和氧化磷酸化途徑產生。糖酵解過程中，葡萄糖分解生成丙酮酸，在有氧條件下，丙酮酸被轉運至線粒體內進一步氧化分解生成乙酰輔酶A進入三羧酸循環(huán)，經氧化磷酸化完全分解生成H2O和CO2，并產生ATP；在缺氧條件下，丙酮酸被還原成乳酸。腫瘤細胞在能量代謝上與正常細胞不同，即使在有氧條件下仍然通過有氧糖酵解（Warburg效應）來獲取能量［6］。研究表明，由于腫瘤細胞快速增殖，內部遠離血管的腫瘤細胞常處于缺氧的微環(huán)境中，而糖酵解途徑可提高細胞對缺血缺氧的耐受性，提供能量以滿足其快速生長的需要［7-8］。HK是糖酵解途徑第一個酶，也是糖酵解的限速酶，分為Ⅰ～Ⅳ4種亞基，其中HKⅡ與惡性腫瘤的相關性最強［9］。腫瘤細胞在缺氧環(huán)境下可激活HIF-1α，通過上調葡萄糖轉運體1、HK和乳酸脫氫酶A等促進葡萄糖轉化成丙酮酸和乳酸；HIF-1α還能提高HKⅡ和3-磷酸肌醇依賴性蛋白激酶1的活性，并協(xié)同myc癌基因的突變，啟動腫瘤細胞進行有氧糖酵解［10］。本研究發(fā)現(xiàn)，NO供體JS-K可顯著降低糖酵解途徑中的HK，PFK和PK的活性，降低組織中乳酸水平，并顯著降低腫瘤組織中HIF-1α和HKⅡ蛋白表達，提示其抑制腫瘤生長作用可能與抑制糖酵解途徑有關。

腫瘤細胞的惡性增殖是一個能量消耗的過程，除有氧糖酵解途徑之外，線粒體氧化磷酸化途徑對細胞總ATP產生也有一定作用［11］。SDH是線粒體內膜的結合酶，可為真核細胞線粒體和多種原核細胞需氧和產能的呼吸鏈提供電子，為線粒體的一種標志酶。ATPase能催化ATP水解產生ADP和無機磷酸并釋放能量。本研究發(fā)現(xiàn)，JS-K在1.5 mg·kg-1劑量下，可顯著抑制有氧氧化途徑中SDH和ATPase的活性，降低組織中ATP水平。

綜上，NO供體JS-K具有顯著抑制H22荷瘤小鼠腫瘤生長的作用，可能主要通過“雙效”機制干擾腫瘤能量代謝而產生。一方面通過降低HIF-1α和HKⅡ蛋白表達，抑制有氧糖酵解途徑中關鍵酶HK，PFK和PK的活性，減弱腫瘤細胞糖酵解能力，降低組織中乳酸水平；另一方面通過抑制有氧氧化途徑中關鍵酶SDH和ATPase的活性，降低組織中ATP水平。

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2017-04-10 接受日期：2017-07-14）

（本文編輯：趙 楠）

Regulation of nitric oxide donor JS-K on tumor energy metabolism in H22 tumor-bearing mice

LIU Ling,HUANG Zi-le,SHEN Hui-na,WANG Jing,LIU Mu-chen,HUA Chang-lin
(Department of Pharmacy,Medical College,Henan University of Science and Technology,Luoyang 471003,China)

OBJECTlVETo investigate the regulation of{O2(2,4-dinitrophenyl)1-[(4-ethoxycarbonyl)piperazin-1-yl]diazen-1-ium-1,2-diolate}(JS-K),a nitric oxide donor,on tumor energy metabolism in H22 tumor-bearing mice.METHODSThe hepatoma animal model in BALB/c mice was established with H22 cell line.The inoculated mice were randomly divided into four groups.The JS-K group and model group

JS-K(0.75 and 1.50 mg?kg-1)and saline via tail the vein intravenously once every 3 d for 14 d,and 5 injections,respectively.The fluorouracil(5-FU)group received 5-FU 20 mg·kg-1by intraperitoneal injection once a day for 14 d.On the 15thday after the first administration,mice were sacrificed and the tumor,thymus and spleen were isolated and weighed immediately.The tumor growth inhibitory rate and organ index were calculated.The activities of hexokinase(HK),phosphofructokinase(PFK),pyruvate kinase(PK),succinate dehydrogenase(SDH),adenosinetriphosphatase(ATPase),and the levels of lactic acid(LD)and adenosine triphosphate(ATP)in tumor tissues were determined by colorimetric method.The expression of hypoxia-inducible factor 1 alpha(HIF-1α)and hexokinaseⅡ(HKⅡ)in the tumor tissue was analyzed by Western blotting.RESULTSCompared with model group,the tumor mass of JS-K 0.75 and 1.50 mg·kg-1groups was significantly reduced(P＜0.01),and the tumor growth inhibitory rate was 23.9%and 50.3%,respectively.There was no diffrence in thymic and splenic indexes between JS-K group and model group.The activity of HK,PFK,SDH,PK and ATPase of tumor tissue in model group was 22.6±3.7,14.4±2.6,(10.5±2.6)U·g-1protein,(12.9±3.2)kU·g-1protein and(0.70±0.10)mmolPi·g-1protein·h-1,respectively,which dropped by 42.0%,26.6%,22.7%,23.3%and 21.7%respectively(P＜0.01,P＜0.05)in JS-K 1.50 mg?kg-1group.Compared with the model group,the level of ATP of tumor tissue in JS-K 1.50 mg?kg-1groups dropped by 16.6%(P＜0.01)and the level of LD in JS-K 0.75 and 1.50 mg?kg-1groups dropped by 38.7%and 59.4%(P＜0.01),respectively.In addition,the expression of HIF-1α of tumor tissue in JS-K 1.50 mg?kg-1group was decreased(P＜0.01),and the expression of HKⅡ of tumor tissue in JS-K 0.75 and 1.50 mg?kg-1groups was decreased significantly(P＜0.05,P＜0.01).CONCLUSlONJS-K can inhibit the growth of tumor in H22 tumor-bearing mice and its mechanism may be related to regulating the tumor energy metabolism by inhibiting glycolysis and aerobic oxidation.

nitric oxide donor;diazeniumdiolate;tumor;energy metabolism

The project supported by Young Backbone Teachers Assistance Scheme of Henan Province Colleges and Universities(2016GGJS-065);Students Research Training Program of Henan University of Science and Technology(2016115);and National College Students′Innovation and Entrepreneurship Training Program(201610464064)

LIU Ling，E-mail：liuling921@126.com，Tel：（0379）64830345

R979.1

A

1000-3002-（2017）07-0730-06

DOl：10.3867/j.issn.1000-3002.2017.07.005

河南省高等學校青年骨干教師培養(yǎng)計劃項目（2016GGJS-065）；河南科技大學大學生科研訓練計劃項目（2016115）；國家級大學生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓練計劃項目（201610464064）

劉 玲，女，副教授，主要從事腫瘤藥理學研究。

劉 玲，E-mail：liuling921@126.com，Tel：（0379）64830345