依魯替尼長(zhǎng)期給藥對(duì)姥鮫烷誘導(dǎo)的系統(tǒng)性紅斑狼瘡模型小鼠的治療作用和副作用

陳海清，胡 勇，戚 勇，王久存（.上海潤(rùn)諾生物科技有限公司，上海 000；.復(fù)旦大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，上海 00438）

依魯替尼長(zhǎng)期給藥對(duì)姥鮫烷誘導(dǎo)的系統(tǒng)性紅斑狼瘡模型小鼠的治療作用和副作用

陳海清1，2，胡 勇1，戚 勇1，王久存2（1.上海潤(rùn)諾生物科技有限公司，上海 200120；2.復(fù)旦大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，上海 200438）

目的評(píng)估依魯替尼長(zhǎng)期給藥對(duì)姥鮫烷誘導(dǎo)的系統(tǒng)性紅斑狼瘡（SLE）模型小鼠的治療作用及副作用。方法6周齡雌性BALB/c小鼠ip給予姥鮫烷0.5 mL制備SLE小鼠模型。4周后，根據(jù)抗雙鏈DNA（DS-DNA）抗體滴度和體質(zhì)量均勻分為模型組、依魯替尼30 mg·kg-1治療組和潑尼松10 mg·kg-1治療組，每天ig給藥1次，連續(xù)28周。每4周測(cè)定1次體質(zhì)量，ELISA法測(cè)定血清中抗DS-DNA抗體、抗單鏈DNA（SS-DNA）抗體和抗組蛋白抗體水平，評(píng)估關(guān)節(jié)炎紅腫等癥狀的評(píng)分及發(fā)病率；生物化學(xué)法檢測(cè)血清肌酐、尿素氮和尿液尿蛋白水平評(píng)估腎功能。給藥28周后處死小鼠，ELISA檢測(cè)白細(xì)胞介素6（IL-6）、干擾素γ（IFN-γ）和腫瘤壞死因子α（TNF-α）水平；采集心、肝、脾、肺和腎，稱重并計(jì)算臟器系數(shù)；生物化學(xué)法檢測(cè)血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶和堿性磷酸酶活性評(píng)估肝功能；HE染色觀察后足和腎組織病理變化，并用免疫組化法檢測(cè)腎組織免疫復(fù)合物IgG沉積。結(jié)果與正常對(duì)照組比較，模型組抗DS-DNA，SS-DNA和組蛋白抗體及IL-6，IFN-γ和TNF-α水平均明顯升高（P＜0.01），血清肌酐、尿素氮和尿蛋白升高，關(guān)節(jié)炎癥狀嚴(yán)重（P＜0.01），后足組織炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)嚴(yán)重（P＜0.01），腎和脾顯著增大（P＜0.01）。與模型組相比，依魯替尼治療28周可減緩SLE模型小鼠體質(zhì)量下降，降低抗DS-DNA，SS-DNA和組蛋白抗體水平（P＜0.01），減輕小鼠關(guān)節(jié)紅腫等癥狀（P＜0.01），并降低關(guān)節(jié)炎發(fā)病率，降低血清細(xì)胞因子IL-6，IFN-γ和TNF-α水平（P＜0.01）；后足關(guān)節(jié)病理觀察顯示，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)、血管翳形成、軟骨破壞和骨吸收減輕（P＜0.01）；腎組織病理觀察顯示，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)和IgG免疫復(fù)合物沉積減少，血清肌酐、尿素氮和尿蛋白水平降低（P＜0.01），血清GPT和ALP活性亦降低（P＜0.01）。結(jié)論依魯替尼給藥28周對(duì)SLE模型小鼠有一定的治療作用，未見(jiàn)明顯副作用。

依魯替尼；系統(tǒng)性紅斑狼瘡；自身抗體；模型，動(dòng)物；關(guān)節(jié)炎；腎功能

系統(tǒng)性紅斑狼瘡（systemic lupus erythematosus，SLE）是一種典型的多器官自身免疫性疾病，臨床表現(xiàn)復(fù)雜多樣［1］。目前普遍認(rèn)為，SLE的病因主要與遺傳、外源病原侵染、環(huán)境、性激素異常和免疫功能缺陷等多種因素有關(guān)［2］。SLE患者體內(nèi)T和B淋巴細(xì)胞功能異?；罨墙閷?dǎo)SLE免疫調(diào)節(jié)紊亂的主要因素，其主要表現(xiàn)為T淋巴細(xì)胞功能異常，使B淋巴細(xì)胞高度活化，從而產(chǎn)生大量自身抗體，在體內(nèi)形成免疫復(fù)合物，激活補(bǔ)體且最終導(dǎo)致多臟器損傷［3］。

近幾年，以B淋巴細(xì)胞為靶標(biāo)治療SLE成為臨床藥物研究的新方向［4］。Bruton酪氨酸激酶（Bruton tyrosine kinase，BTK）是非受體蛋白酪氨酸激酶Tec家族成員之一，在B細(xì)胞受體（B-cell receptor，BCR）信號(hào)通路中發(fā)揮關(guān)鍵性作用。已有研究表明，抑制BTK信號(hào)通路對(duì)緩解以及治療實(shí)驗(yàn)性關(guān)節(jié)炎有效，提示BTK可能是治療自身免疫性疾病的一個(gè)理想靶點(diǎn)［5］，這也是目前許多制藥公司重視BTK新藥開發(fā)的主要原因。

依魯替尼（ibrutinib），分子式為C25H24N6O2，化學(xué)名為1-{（3R）-3-〔4-氨基-3-（4-苯氧基苯基）-1H-吡唑并［3，4-d］嘧啶-1-基〕-1-哌啶基}-2-丙烯-1-酮，由美國(guó)Pharmacyclics公司推出并持有合成專利［6］，是一種能夠口服的小分子BTK抑制劑，可與BTK活性位點(diǎn)上的半胱氨酸殘基（Cys-481）選擇性地共價(jià)結(jié)合，不可逆地抑制BTK活性，進(jìn)而抑制BCR信號(hào)通路的激活，表現(xiàn)出較好的選擇性［7］。臨床前研究表明，在服藥后4 h內(nèi)依魯替尼與BTK不可逆結(jié)合率高達(dá)95%以上，且該結(jié)合對(duì)周圍血細(xì)胞無(wú)顯著影響。依魯替尼能抑制B細(xì)胞淋巴瘤的生長(zhǎng)并誘導(dǎo)其凋亡，對(duì)包括BCR引發(fā)淋巴瘤的轉(zhuǎn)基因小鼠模型在內(nèi)的多種臨床前腫瘤模型、膠原誘導(dǎo)的小鼠關(guān)節(jié)炎模型及腎病紅斑狼瘡模型均表現(xiàn)出治療作用［8］。本研究觀察依魯替尼長(zhǎng)期給藥對(duì)SLE模型小鼠的治療作用，觀察其對(duì)自身抗體水平和關(guān)節(jié)炎癥反應(yīng)的影響及其副作用，為其臨床應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 藥物、試劑和主要儀器

依魯替尼，上海潤(rùn)諾生物科技有限公司，用1%甲基纖維素配制成3 g·L-1溶液；潑尼松，上海信誼藥廠有限公司，用1%甲基纖維素溶解并配制1 g·L-1溶液。姥鮫烷、甲基纖維素、小牛胸腺單鏈DNA（singlestrand DNA，SS-DNA）、雙鏈DNA（double-strand DNA，DS-DNA）、組蛋白、辣根過(guò)氧化物酶（HRP）標(biāo)記羊抗兔IgG抗體（二抗）和小牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）均購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；兔抗小鼠IgG抗體（一抗），英國(guó)Abcam公司；HRP標(biāo)記羊抗小鼠IgM和羊抗小鼠IgG抗體購(gòu)自美國(guó)SouthernBiotech公司；血清尿素氮、血清肌酐、尿蛋白、谷丙轉(zhuǎn)氨酶（glutamic-pyruvic transaminase，GPT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶〔glutamic-oxal（o）acetic transaminase，GOT〕和堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）檢測(cè)試劑盒均購(gòu)自南京建成生物工程研究所；白細(xì)胞介素6（interleukin-6，IL-6）檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó)eBioscience公司；干擾素γ（interferon-γ，IFN-γ）和腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó)R&D公司。多功能酶標(biāo)儀，美國(guó)Molecular Devices公司；顯微鏡，日本Olympus公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

BALB/c小鼠，16～20 g，6周齡，雌性［9］，由上海靈暢動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供〔動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（滬）2013-0018〕，飼養(yǎng)于上海潤(rùn)諾生物科技有限公司SPF級(jí)動(dòng)物房。實(shí)驗(yàn)中所有動(dòng)物操作經(jīng)上海潤(rùn)諾生物科技有限公司實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利與使用管理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.3 SLE小鼠模型的制備

38只雌性BALB/c小鼠，每只ip給予姥鮫烷0.5 mL制備SLE模型［10］。另外10只ip等體積生理鹽水作為正常對(duì)照組。4周后，小鼠眼眶采血，檢測(cè)血清中抗DS-DNA抗體（IgG）的水平。剔除抗體水平A450nm＜0.4的小鼠8只，根據(jù)體質(zhì)量和抗DS-DNA抗體滴度將剩余30只小鼠均勻分為3組，即模型組（1%甲基纖維素）、潑尼松10 mg·kg-1治療組（陽(yáng)性對(duì)照組）［11］和依魯替尼30 mg·kg-1治療組，每天ig 給藥1次，給藥體積10 mL·kg-1，連續(xù)給藥28周。

1.4 一般狀況觀察

實(shí)驗(yàn)期間觀察小鼠的飲食、飲水、日?；顒?dòng)、毛色、排便及排尿情況。注射姥鮫烷當(dāng)天為第0天，每4周測(cè)定體質(zhì)量。觀察關(guān)節(jié)炎癥狀，記錄關(guān)節(jié)炎發(fā)病評(píng)分及發(fā)病率［12］。關(guān)節(jié)炎評(píng)分參考文獻(xiàn)［13］。0分：無(wú)紅斑和紅腫；1分：近跗骨附近或踝關(guān)節(jié)或跖骨出現(xiàn)紅斑或輕度紅腫或有一個(gè)爪趾有紅斑和紅腫；2分：踝關(guān)節(jié)和跖骨輕微紅斑和腫脹，≥2個(gè)爪趾有紅腫和紅斑；3分：踝、腕關(guān)節(jié)和跖骨中度紅斑和腫脹；4分：踝、腕關(guān)節(jié)、跖骨和腳趾全部嚴(yán)重紅腫。

1.5 ELlSA檢測(cè)血清自身抗體和細(xì)胞因子水平

每4周眼眶采血，ELISA檢測(cè)血清中抗DS-DNA抗體（IgG）、SS-DNA抗體和組蛋白抗體（IgM）水平。末次給藥1 h后，二氧化碳安樂(lè)死處死小鼠，收集全血，以1000×g，4℃離心10 min取血清，-80℃儲(chǔ)存?zhèn)溆?。?xì)胞因子TNF-α，IL-6和IFN-γ測(cè)定根據(jù)試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行［14］。

ELISA檢測(cè)血清抗DS-DNA，SS-DNA和組蛋白抗體水平［15］。將DS-DNA，SS-DNA或組蛋白抗原100 μL（10 mg·L-1，PBS溶解）包被于96孔板，4℃孵育過(guò)夜。清除包被液，用清洗液（0.05%吐溫20）洗3次（每次300 μL）。每孔用300 μL封閉液（1%BSA，PBST）封閉，室溫孵育2 h。清除封閉液，用清洗液洗3次。用稀釋液（0.1%BSA，PBS）將待測(cè)血清稀釋100倍，每孔加入100 μL，用稀釋液做空白對(duì)照。室溫孵育2 h。清洗3～5次。加入100 μL HRP標(biāo)記的羊抗小鼠IgG或IgM抗體（1∶5000稀釋，用0.1%BSA稀釋），室溫孵育2 h。清洗5次。每孔加100 μL 1×四甲基聯(lián)苯胺溶液，室溫避光孵育15 min。每孔加50 μL終止液（硫酸0.5 mol·L-1），450 nm 波長(zhǎng)測(cè)定吸光度。

1.6 生物化學(xué)法檢測(cè)肝腎功能

給藥后每4周檢測(cè)血清肌酐（肌氨酸氧化酶法）和尿素氮（脲酶法）水平；按壓腹腔采集尿液，考馬斯亮藍(lán)法檢測(cè)尿蛋白水平［16］。處死小鼠后，賴氏法檢測(cè)血清GPT和GOT水平，微量酶標(biāo)法檢測(cè)ALP水平［17］。按照各試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。

1.7 HE染色法觀察腎組織和關(guān)節(jié)組織病理變化

處死小鼠后進(jìn)行肝、心、腎、脾和肺等器官稱重。臟器系數(shù)=臟器質(zhì)量（g）/體質(zhì)量（g）×100。腎和后足用10%中性甲醛固定（后足用10%甲酸脫鈣10 d），進(jìn)行組織脫水、包埋、切片和HE染色，封片，拍照。觀察腎組織損傷及炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)［18］。后足關(guān)節(jié)病理變化按照炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)、血管翳形成、軟骨損傷和骨再吸收4項(xiàng)病理變化程度進(jìn)行組織學(xué)觀察評(píng)分［19］，每項(xiàng)0～4分，總分16分。

1.8 免疫組化法檢測(cè)腎組織lgG沉積［20］

腎組織切片經(jīng)過(guò)二甲苯、100%乙醇和95%乙醇等處理后，用檸檬酸抗原修復(fù)液（pH 6.0，99℃，20 min）進(jìn)行抗原修復(fù)。1%過(guò)氧化氫處理內(nèi)源性過(guò)氧化物酶10 min，加兔抗小鼠IgG單克隆抗體4℃過(guò)夜。PBS清洗2次，每次3 min，羊血清封閉15 min。PBS清洗切片2次，每次3 min，加HRP標(biāo)記羊抗兔IgG抗體，室溫放置30 min。DBA試劑顯色，蘇木素復(fù)染，封片，拍照觀察。根據(jù)棕色面積和深度判斷免疫復(fù)合物IgG的沉積。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 依魯替尼長(zhǎng)期給藥對(duì)SLE模型小鼠體質(zhì)量的影響

實(shí)驗(yàn)期間，正常對(duì)照組小鼠生長(zhǎng)狀況良好，活動(dòng)敏捷，毛順色亮，體質(zhì)量穩(wěn)定增長(zhǎng)，各項(xiàng)生理指標(biāo)正常。姥鮫烷誘導(dǎo)的SLE模型小鼠出現(xiàn)足趾腫脹和四肢不靈活等典型的紅斑狼瘡關(guān)節(jié)炎癥狀。

圖1結(jié)果顯示，治療20周后，與正常對(duì)照組比較，模型組小鼠體質(zhì)量明顯下降（P＜0.01）。治療28周后，與模型組比較，依魯替尼和潑尼松組小鼠體質(zhì)量下降幅度減小，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

Fig.1 Effect of long-term treatment with ibrutinib on body mass of mice with systemic lupus erythematosus（SLE）induced by pristane.The SLE mouse model was induced by pristane（ip）.Four weeks later，model mice were ig given 1.0%methyl cellulose（vehicle）10 mL·kg-1，prednisone 10 mg·kg-1or ibrutinib 30 mg·kg-1，respectively，once daily for 28 weeks.±s，n=10.＊＊P＜0.01，compared with normal control group.

2.2 依魯替尼長(zhǎng)期給藥對(duì)SLE模型小鼠自身抗體水平的影響

圖2結(jié)果顯示，與正常對(duì)照組比較，隨著時(shí)間延長(zhǎng)，SLE模型組抗DS-DNA抗體（IgG）、抗SS-DNA抗體和抗組蛋白抗體（IgM）水平不斷增加（P＜0.01）。與模型組比較，依魯替尼能顯著降低SLE小鼠上述3種自身抗體的水平（P＜0.01），其變化趨勢(shì)與潑尼松組基本一致，提示依魯替尼可抑制SLE模型小鼠自身抗體的產(chǎn)生。

Fig.2 Effect of long-term treatment with ibrutinib on auto-antibody production of mice with SLE induced by pristane detected by ELlSA.See Fig.1 for the mouse treatment.A：anti-double-strand DNA（DS-DNA）antibody（IgG）；B：anti-single-strand DNA（SS-DNA）antibody（IgM）；C：anti-histone antibody（IgM）.±s，n=10.＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，compared with normal control group；##P＜0.01，compared with SLE model group.

2.3 依魯替尼長(zhǎng)期給藥對(duì)SLE模型小鼠關(guān)節(jié)炎癥的影響

圖3A結(jié)果顯示，與正常對(duì)照組比較，模型組小鼠在給藥8周后開始出現(xiàn)關(guān)節(jié)紅腫和行動(dòng)遲緩癥狀；16周時(shí)關(guān)節(jié)炎評(píng)分增高（P＜0.01）。與模型組比較，依魯替尼和潑尼松能顯著緩解小鼠的關(guān)節(jié)炎癥狀，關(guān)節(jié)紅腫緩解或消退，行動(dòng)較自由，關(guān)節(jié)炎評(píng)分維持在較低水平（P＜0.01）。實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，模型組小鼠關(guān)節(jié)炎發(fā)病數(shù)為10/10，依魯替尼組為6/10，潑尼松組為4/10（圖3B）。

后足關(guān)節(jié)HE染色結(jié)果（圖3C和3D）表明，與正常對(duì)照組比較，模型組小鼠關(guān)節(jié)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)嚴(yán)重，血管翳大量形成，軟骨組織病變和骨吸收均較嚴(yán)重（P＜0.01）。與模型組比較，依魯替尼和潑尼松均能顯著改善關(guān)節(jié)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)、血管翳形成、軟骨破壞和骨吸收（P＜0.01）。與潑尼松比較，依魯替尼作用較弱。

2.4 依魯替尼長(zhǎng)期給藥對(duì)SLE模型小鼠血清細(xì)胞因子水平的影響

表1結(jié)果顯示，依魯替尼治療28周時(shí)，與正常對(duì)照組比較，SLE模型組小鼠血清TNF-α，IL-6和IFN-γ水平顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，依魯替尼和潑尼松治療組TNF-α，IL-6和IFN-γ水平顯著下降（P＜0.01，P＜0.05）。

Tab.1 Effect of long-term treatment with ibrutinib on serum tumor necrosis factor- α（TNF- α），interleukin-6（lL-6） and interferon- γ（lFN- γ） levels of mice with SLE induced by pristane detected by ELlSA

2.5 依魯替尼長(zhǎng)期給藥對(duì)SLE模型小鼠腎功能和腎組織病理變化的影響

圖4A，B和C顯示，與正常對(duì)照組比較，SLE模型組小鼠血清肌酐、尿素氮和尿液尿蛋白水平持續(xù)增加（P＜0.01）。與模型組比較，依魯替尼和潑尼松組血清肌酐、尿素氮和尿液尿蛋白水平明顯降低（P＜0.01），兩組變化曲線基本一致。腎組織HE染色結(jié)果見(jiàn)圖4D，與正常對(duì)照組比較，模型組炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)嚴(yán)重。依魯替尼治療能有效改善炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。

Fig.3 Effect of long-term treatment with ibrutinib on hind foot joint inflammation of mice with SLE induced by pristane.See Fig.1 for the mouse treatment.A：arthritis score；B：number of mice with arthritis；C and D：joint tissue with HE staining.Hind foot histopathology score was evaluated by score system：inflammation，pannus，cartilage destruction and bone resorption［19］.Red arrow：inflammation；blue arrow：cartilage destruction；green arrow：bone resorption；black arrow：pannus.±s，n=10.＊＊P＜0.01，compared with normal control group；##P＜0.01，compared with SLE model group.

Fig.4 Effect of long-term treatment with ibrutinib on renal function of mice with SLE induced by pristane.See Fig.1 for the mouse treatment.A：serum creatinine；B：urine protein；C：serum urea nitrogen.±s，n=10.＊＊P＜0.01，compared with normal control group；#P＜0.05，##P＜0.01，compared with SLE model group.D：kidney tissue with HE staining.Red arrows show inflammation.

圖5結(jié)果顯示，SLE模型組腎組織免疫復(fù)合物沉積較正常對(duì)照組增多，而依魯替尼和潑尼松治療能顯著減少腎組織中免疫復(fù)合物IgG的沉積。

Fig.5 Effect of long-term treatment with ibrutinib on immune complex lgG in kidney tissue of mice with SLE induced by pristane detected by immunohistochemical staining.See Fig.1 for the mouse treatment.Red arrows show immune complex IgG.

2.6 依魯替尼長(zhǎng)期給藥對(duì)SLE模型小鼠臟器系數(shù)的影響

圖6結(jié)果顯示，治療28周后，與正常對(duì)照組比較，模型組脾、腎和肺系數(shù)增加（P＜0.01）。與模型組比較，依魯替尼和潑尼松使腎和脾系數(shù)下降（P＜0.01），心和肝系數(shù)無(wú)明顯差別。

Fig.6 Effect of long-term treatment with ibrutinib on organ coefficient of mice with SLE induced by pristane.See Fig.1 for the mouse treatment.Organ coefficient was detected at the end of 28-week treatment.Organ coefficient=organ mass（g）/body mass（g）×100.±s，n=10.＊＊P＜0.01，compared with normal control group；#P＜0.05，##P＜0.01，compared with SLE model group.

2.7 依魯替尼長(zhǎng)期給藥對(duì)SLE模型小鼠肝功能的影響

表2結(jié)果顯示，給藥28周后，與正常對(duì)照組比較，模型組血清GPT和ALP活性增加（P＜0.01）。與模型組比較，依魯替尼可降低GPT和ALP活性（P＜0.01，P＜0.05），對(duì)GOT活性無(wú)影響。

Tab.2 Effect of long-term treatment with ibrutinib on liver function of mice with SLE induced by pristane

3 討論

依魯替尼（PCI-32765）是BCR信號(hào)通路中研究BTK共價(jià)激酶抑制劑中最成功的一種，可與靶蛋白BTK活性位點(diǎn)半胱氨酸殘基（Cys-481）選擇性結(jié)合形成共價(jià)修飾，抑制BTK自我磷酸化激活，更重要的是，兩者的結(jié)合具有高效、高選擇性和不可逆的特點(diǎn)。研究報(bào)道，依魯替尼對(duì)BTK的半抑制濃度（IC50）為0.5 nmol·L-1，其抑制作用可持續(xù)＞24 h。此外，依魯替尼還可抑制基質(zhì)細(xì)胞衍生因子C-X-C基序趨化因子12（C-X-C motif chemokine 12，CXCL12），CXCL13和CCL19的應(yīng)答。但依魯替尼抑制BCR信號(hào)的同時(shí)存在破壞基質(zhì)細(xì)胞的可能性，長(zhǎng)期使用可能會(huì)干擾B細(xì)胞正常功能，導(dǎo)致低丙種球蛋白血癥及其他并發(fā)癥［21］。

文獻(xiàn)報(bào)道，依魯替尼給藥周期多在8～16周，給藥劑量范圍為3～30 mg·kg-1［22］。本研究給藥周期為28周，選擇劑量為30 mg·kg-1，通過(guò)對(duì)體質(zhì)量、自身抗體水平、關(guān)節(jié)炎及腎功能等每4周1次的動(dòng)態(tài)觀察，了解其長(zhǎng)期給藥對(duì)SLE模型小鼠的治療作用和副作用；通過(guò)動(dòng)態(tài)觀察SLE模型小鼠自身免疫抗體水平和腎功能變化，結(jié)合腎組織病理變化，了解自身免疫抗體水平和腎功能損傷是否存在相關(guān)性，探討依魯替尼保護(hù)SLE模型小鼠腎功能作用的可能機(jī)制［23］。

本研究結(jié)果表明，依魯替尼給藥28周能進(jìn)行性抑制姥鮫烷誘導(dǎo)的SLE模型小鼠自身抗體產(chǎn)生，減輕腎損傷；能緩解關(guān)節(jié)炎癥狀，降低關(guān)節(jié)炎的發(fā)病率；能顯著降低血清炎癥因子水平；提示可有效緩解SLE全身炎癥反應(yīng)。后足關(guān)節(jié)病理檢測(cè)提示，依魯替尼可通過(guò)抑制關(guān)節(jié)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)、降低血管翳形成、減少軟骨破壞和骨吸收對(duì)SLE關(guān)節(jié)炎起到治療作用。腎組織病理變化和免疫復(fù)合物IgG沉積分析結(jié)果表明，依魯替尼可通過(guò)緩解腎組織炎癥反應(yīng)，降低腎組織抗原抗體免疫復(fù)合物沉淀和積聚，從而保護(hù)腎小球及腎小管損傷，改善SLE小鼠腎功能。

本研究結(jié)果提示，依魯替尼對(duì)SLE模型小鼠有明顯的治療作用，且未見(jiàn)明顯的耐藥性和副作用。與潑尼松比較，雖然改善炎癥反應(yīng)的作用較弱，但對(duì)SLE模型小鼠體質(zhì)量和腎功能的保護(hù)、降低自身抗體水平等作用與潑尼松基本相近。

綜上所述，依魯替尼給藥28周對(duì)SLE模型小鼠有明顯的治療作用，無(wú)明顯副作用。依魯替尼長(zhǎng)期給藥的優(yōu)勢(shì)使其具有開發(fā)為SLE新型治療藥物的潛在價(jià)值。

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2017-02-03 接受日期：2017-07-10）

（本文編輯：齊春會(huì)）

Therapeutic action and side effects of long-term treatment with ibrutinib on systemic lupus erythematosus model mice induced by pristane

CHEN Hai-qing1,2,HU Yong1,QI Yong1,WANG Jiu-cun2
(1.Shanghai Bioduro Biotechnology Co.,Ltd.,Shanghai 200120,China;2.School of Life Sciences,Fudan University,Shanghai 200438,China)

OBJECTlVETo investigate the therapeutic effect and side effect of ibrutinib long-term treatment in systemic lupus erythematosus(SLE)model mice induced by pristane.METHODSFemale 6-week old BALB/c mice were ip given pristane 0.5 mL once for SLE induction.Four weeks later,the SLE model mice were divided into three groups based on the body mass and serum level of anti-doublestrand DNA(DS-DNA)antibody and treated with 1%methylcellulose(model control group,ig),ibrutinib(30 mg·kg-1,ig)or prednisone(10 mg·kg-1,ig),respectively,once daily for 28 weeks.Every 4 weeks,body mass of each mouse was measured.Autoantibodies against DS-DNA,single-strand DNA(SS-DAN),and histone were tested by ELISA.The incidence of lupus arthritis and clinical score of inflammation and edema were recorded and graded.Biochemical analysis of urea protein,serum urea nitrogen and creatinine was used to evaluate kidney function.Mice were euthanized post 28 weeks of dosing.Interleukin-6(IL-6),interferon-γ (IFN-γ)and tumor necrosis factor-α (TNF-α)were tested by ELISA.The heart,liver,spleen,lung,and kidney were collected and weighed for organ relative mass calculation.Biochemical analysis of serum glutamic-pyruvic transaminase(GPT),glutamic-oxal(o)acetic transaminase(GOT)and alkaline phosphatase(ALP)was used to evaluate liver function.Hind feet were collected for HE staining and pathological scoring to observe renal injury and inflammation.Immunohistochemical staining was used to study IgG immune complexes deposition in kidneys of lupus.RESULTSCompared with normal control group,autoantibodies(anti-DS-DNA,anti-SS-DNA and anti-histone antibodies),renal function indexes(serum creatinine,urea nitrogen and urine protein),and cytokines(IL-6,IFN-γ and TNF-α)levels in model group were significantly increased(P＜0.01).The model group mice had obvious clinical symptoms of arthritis(P＜0.01),serious inflammation cell invasion(P＜0.01),and the mass of kidneys and spleen increased significantly(P＜0.01).Compared with model group,after 28 weeks of treatment,ibrutinib decreased the level of anti-DS-DNA,anti-SS-DNA and anti-histone antibodies(P＜0.01),decreased the lupus arthritis score(P＜0.01)and the morbidity of arthritis,reduced the level of cytokines IL-6,IFN-γ and TNF-α (P＜0.01),reduced the level of serum creatinine,serum urea nitrogen and urine protein(P＜0.01),improved pathological symptoms of hind feet such as inflammation,cartilage destruction,bone resorption and pannus(P＜0.01),alleviated renal tissue inflammatory cell invasion and the immune-complex precipitation,and reduced the mass of organs(spleen and kidneys,P＜0.01)and the level of liver function(GPT and ALP,P＜0.01).CONCLUSlONLong-term treatment with ibrutinib has therapeutic effect on the model mice of SLE,and has no obvious side effect.

ibrutinib;systemic lupus erythematosus;autoantibody;model,animal;arthritis;kidney function

The project supported by National International Cooperation in Science and Technology Special Fund(2013DFA30870)

WANG Jiu-cun,E-mail:jcwang@fudan.edu.cn

R967

A

1000-3002-（2017）07-0722-08

DOl：10.3867/j.issn.1000-3002.2017.07.004

國(guó)家國(guó)際科技合作專項(xiàng)基金（2013DFA30870）

陳海清，碩士，主要從事炎癥及代謝藥理學(xué)研究。

王久存，E-mail：jcwang@fudan.edu.cn