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    豬組織中賽庚啶間接競爭ELISA檢測方法研究

    2017-12-07 07:30:00楊玉婷佟世生北京城市學(xué)院生物醫(yī)藥學(xué)部
    食品安全導(dǎo)刊 2017年34期
    關(guān)鍵詞:包被抑制率單抗

    □楊玉婷佟世生北京城市學(xué)院生物醫(yī)藥學(xué)部

    □秦譽(yù)北京維德維康生物技術(shù)有限公司

    豬組織中賽庚啶間接競爭ELISA檢測方法研究

    □楊玉婷佟世生北京城市學(xué)院生物醫(yī)藥學(xué)部

    □秦譽(yù)北京維德維康生物技術(shù)有限公司

    酶聯(lián)免疫分析方法(Enzyme-LinkedImmuno-SorbentAssay,ELISA)具有特異性高、靈敏度高和成本低等特點(diǎn),適用于現(xiàn)場監(jiān)控和大量樣本的快速篩選。本研究在前期制備的賽庚啶人工抗原和單克隆抗體基礎(chǔ)上,建立了對豬組織中賽庚啶殘留的間接競爭ELISA檢測方法,為后續(xù)檢測產(chǎn)品研發(fā)奠定了基礎(chǔ)。

    賽庚啶(Cyproheptadine,CLD)是一種具有抗膽堿能力和鎮(zhèn)靜作用,可用于治療各種過敏性疾病的抗組胺藥,也可用于改善患者食欲。近年來,人們發(fā)現(xiàn)在飼料產(chǎn)品中添加賽庚啶會增加動物食欲,可達(dá)到增加養(yǎng)殖動物體重的目的。但食用含賽庚啶殘留的動物源性產(chǎn)品會對人體造成不利影響,濃度高時(shí)可直接引發(fā)昏厥、呼吸急促、全身無力等中毒癥狀,嚴(yán)重者則直接導(dǎo)致死亡。

    農(nóng)業(yè)部1519號公告將賽庚啶列入《禁止在飼料和動物飲水中使用的物質(zhì)》,然而飼料安全預(yù)警監(jiān)測結(jié)果表明,國內(nèi)仍然有一些飼料產(chǎn)品中添加了此類藥物,同時(shí)也有在豬肉組織中檢出賽庚啶殘留的報(bào)道。因此,加強(qiáng)對賽庚啶殘留的檢測迫在眉睫。目前,已報(bào)道的檢測方法有液相色譜法、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法,而且多為動物尿液及飼料中賽庚啶殘留的檢測。因此,建立一種直接、方便、靈敏、高效、準(zhǔn)確的檢測方法十分必要。酶聯(lián)免疫分析方法具有特異性高、靈敏度高和成本低等特點(diǎn),適用于現(xiàn)場監(jiān)控和大量樣本的快速篩選。本研究在前期制備的賽庚啶人工抗原和單克隆抗體基礎(chǔ)上,建立了對豬組織中賽庚啶殘留的間接競爭ELISA檢測方法,為后續(xù)檢測產(chǎn)品研發(fā)奠定了基礎(chǔ)。

    材料與方法

    材料與試劑

    賽庚啶和可樂定標(biāo)準(zhǔn)品(98%中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所)、辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠IgG(美國Jackson)、四甲基聯(lián)苯胺(華美生物工程公司)、小牛血清(杭州四季青)、牛血清白蛋白(美國SIGMA)、賽庚啶完全抗原和單克隆抗體(北京維德維康生物技術(shù)有限公司研發(fā)中心制備保存);豬肉、豬肝等樣本(超市)。甲醇、二氯甲烷、碳酸鈉、氯化鈉、氫氧化鈉、碳酸氫鈉、無水乙醇、乙酸乙酯、乙腈、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀均為分析純級別(國藥集團(tuán))。

    儀器與設(shè)備

    MK-3酶聯(lián)免疫測定儀(Thermo);QL-901渦動儀(海門其林貝爾);TDL-40B離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠);酶標(biāo)板(廈門云鵬);氮吹儀(美國organomation);移液器(Thermo);精密電子天平(梅特勒-托利多)。

    方法

    1ELISA檢測條件的優(yōu)化

    1.1 最適包被濃度與最適單抗?jié)舛鹊膬?yōu)化

    將包被抗原以1:2000、1:10000、1:50000、1:250000稀釋包板,每個(gè)稀釋度包兩條作為平行。比較各組的最大吸光度和抑制率,確定最適包被濃度。

    單 抗 設(shè) 定 1:2000、1:10000、1:50000、1:250000共4組稀釋度。比較各組最大吸光度和抑制率,確定最適單抗稀釋倍數(shù)。

    1.2 包被液pH的優(yōu)化

    分別用3種不同pH值的包被液將賽庚啶包被原稀釋至最適工作濃度。比較各組最大吸光值、靈敏度點(diǎn)抑制、IC50值和曲線的線性,確定最適包被液pH。

    1.3 封閉液的優(yōu)化

    分別用4種不同配方的封閉液封閉,37℃溫育2h,其余變量相同。比較各組最大吸光值、靈敏度點(diǎn)抑制、IC50值和曲線的線性,確定最適封閉液配方。

    1.4 包被條件的優(yōu)化

    用包被液將賽庚啶抗原稀釋至最適工作濃度,每孔100μL,分成3組。第一組:37℃溫育2h;第二組:室溫放置2h;第三組:4℃過夜。比較各組最大吸光值、靈敏度點(diǎn)抑制、IC50值和曲線的線性,確定最適包被條件。

    1.5 樣品溶液與單抗溶液體積比例的優(yōu)化

    加入樣品溶液和單抗溶液比例分別 為:30μL:70μL、40μL:60μL、5 0 μ L:5 0 μ L 、 6 0 μ L:4 0 μ L 、70μL:30μL和80μL:20μL。比較最大吸光度和抑制率,確定最適樣品與單抗體積比例。

    1.6 試劑盒特異性的確定

    選擇對賽庚啶類似物可樂定(Apraclonidine)、 羅 米 非啶(Romifidine)、 替 扎 尼 定(Tizanidine)、賽拉嗪(Xylazine)、克倫特羅(Clenbuterol)、萊克多巴胺(Ractopamine)和沙丁胺醇(Salbutamol)進(jìn)行測定,得到各類似物在標(biāo)準(zhǔn)曲線各點(diǎn)的OD值,應(yīng)用RIDAWIN軟件分析,得出類似物的IC50,從而計(jì)算其交叉反應(yīng)率(CR):

    交叉反應(yīng)率(CR)=IC50(CLD)/IC50(類似物)×100%

    1.7 試劑盒精密度的測定

    用零標(biāo)準(zhǔn)的OD值來測定ELISA方法的可重復(fù)性,分別測定板內(nèi)差、批內(nèi)差和批間差。

    2樣本的添加回收試驗(yàn)

    樣本的前處理方法如下:

    豬肉:準(zhǔn)確稱取2±0.01g均質(zhì)后的新鮮組織樣品于50mL離心管中;加入1mL0.1M鹽酸,再加入1mL無水甲醇,室溫(25±2℃)下,充分渦動3min;4000r以上,離心10min;取100μL上清液于新的離心管中,再加入400μL0.02MPBS,渦動30s混勻,然后進(jìn)行檢測。

    豬肝:準(zhǔn)確稱取2±0.01g均質(zhì)后的新鮮組織樣品于50mL離心管中;加入0.5mL0.1M鹽酸,再加入0.5mL1MEDTA-2Na溶液,最后加入1mL無水甲醇,室溫(25±2℃)下,充分渦動3min;4000r以上,離心10min;取100μL上清液于新的離心管中,再加入 400μL0.02MPBS,渦動 30s混勻,然后進(jìn)行檢測。

    每個(gè)添加濃度做兩份樣品,每份樣品的提取液做兩個(gè)重復(fù)。各樣品經(jīng)上述方法處理后,用優(yōu)化的ELISA方法檢測,測定OD450值,用RIDAWIN軟件分析數(shù)據(jù),得出賽庚啶的含量,并根據(jù)下式計(jì)算添加回收率。

    添加回收率(%)=實(shí)測值(ng/mL)/添加值(ng/mL)×100%

    結(jié)果與分析

    ELISA檢測條件的優(yōu)化

    1最適包被濃度與最適單抗的優(yōu)化

    實(shí)驗(yàn)選擇最大吸光值在2.0左右,靈敏度抑制率在80%以下為合適的抗原抗體稀釋倍數(shù)。最適包被濃度與最適單抗的優(yōu)化結(jié)果見表1、表2,由表可知,隨著包被原濃度和抗體濃度的降低,最大吸光值也在降低,當(dāng)抗原做1:50000稀釋,抗體做1:10000稀釋時(shí),靈敏點(diǎn)抑制率為79.3%,最大吸光值和靈敏度抑制均符合要求,故確定其為最適稀釋度。

    2包被液的優(yōu)化

    結(jié)果見表3,由表3可知,比較3種緩沖液的最大吸光值、靈敏度點(diǎn)的抑制率、IC50及曲線線性,選擇0.05mol/L、pH=9.6的碳酸鹽緩沖液做為包被液。

    3封閉液的確定

    分析較幾種常用的封閉液,結(jié)果見表4。選擇最大吸光值較大,IC50較低,曲線線性大于99%,靈敏度點(diǎn)抑制在70%~80%之間的封閉液,最終選擇5%的脫脂奶粉做為封閉液。

    表1 不同濃度抗原抗體反應(yīng)最大吸光度

    表2 不同濃度抗原抗體反應(yīng)靈敏度點(diǎn)抑制率

    表3 包被液的確定試驗(yàn)

    表4 封閉液的確定試驗(yàn)

    表5 包被條件的確定試驗(yàn)

    4包被條件的優(yōu)化分析

    包被條件的優(yōu)化見表5,實(shí)驗(yàn)選擇最大吸光值較大,靈敏度抑制率為70%~80%,IC50在0.1ng/mL左 右,線性相關(guān)系數(shù)在99%以上的數(shù)據(jù),由表確定4℃反應(yīng)16h作為試劑盒的最佳包被條件。

    5樣品溶液與單抗溶液體積比例的確定

    結(jié)果見表6,樣品溶液與單抗溶液體積比為40:60時(shí),靈敏度抑制率在70%~80%之間,最大吸光度值在2.0左右,線性相關(guān)系數(shù)為99.45%,因此確定樣品溶液與單抗溶液體積比為40:60。

    6特異性的測定

    結(jié)果見表7,該單抗與賽庚啶、可樂定、羅米非啶、替扎尼定、賽拉嗪、克倫特羅、萊克多巴胺和沙丁胺醇的交叉反應(yīng)率分別為100.0%、0.1%、0.05%,其余均小于0.05%,表明對賽庚啶靈敏。

    7精密度的測定

    精密度通常用標(biāo)準(zhǔn)樣品的批內(nèi)和批間相對標(biāo)準(zhǔn)差(RSD)或者變異系數(shù)(CV)來進(jìn)行考察,一般要求CV應(yīng)小于10%。精密度的測定見表8,由表8可以看出3批酶標(biāo)板的板內(nèi)變異系數(shù)小于5%,板間變異系數(shù)小于10%,符合要求。

    表6 樣品溶液與單抗溶液體積比的確定試驗(yàn)

    表7 交叉反應(yīng)

    表8 變異系數(shù)

    表9 豬肉中賽庚啶的回收率

    表10 豬肝中賽庚啶的回收率

    樣本的添加回收率檢測

    取空白樣本各5份,根據(jù)檢測限要求對樣品進(jìn)行添加,每種樣本、每個(gè)濃度各做2個(gè)平行,按提取方法進(jìn)行提取稀釋,所得樣本溶液進(jìn)行ELISA檢測,計(jì)算添加回收率。表9、表10表明兩種組織的添加回收率均在70%~128%之間。

    結(jié)語

    本研究在已制備的賽庚啶抗原和單克隆抗體的基礎(chǔ)上,對抗原濃度、抗體濃度、包被液配方、封閉液配方、包被條件等進(jìn)行了摸索和優(yōu)化,研制了檢測豬肉組織中賽庚啶的ELISA方法,該方法IC50變動范圍在0.1~0.15ng/mL之間,豬組織中檢測限為0.5μg/kg,添加回收率70.0%~128.0%之間(添加濃度為0.5μg/kg和1.0μg/kg),樣本重復(fù)檢測的變異系數(shù)在2.6%~12.1%之間,具有良好的特異性、準(zhǔn)確性和重復(fù)性,表明本ELISA方法的穩(wěn)定性符合檢測要求,能夠滿足對豬組織賽庚啶檢測的需要。

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