試論用高效液相色譜（HPLC）檢測(cè)原料乳與乳制品中三聚氰胺的原理和方法

□ 崔立華 丹東市食品檢驗(yàn)檢測(cè)中心

試論用高效液相色譜（HPLC）檢測(cè)原料乳與乳制品中三聚氰胺的原理和方法

□ 崔立華 丹東市食品檢驗(yàn)檢測(cè)中心

針對(duì)高效液相色譜法檢測(cè)原料乳及乳制品中三聚氰胺的方法，國(guó)家發(fā)布了GB/T22388-2008和GB/T22400-2008兩個(gè)推薦性標(biāo)準(zhǔn)，此兩者均規(guī)定了指定色譜柱的使用。隨著國(guó)內(nèi)外色譜柱廠家生產(chǎn)的檢測(cè)三聚氰胺的色譜柱不斷增加，方法也應(yīng)隨之優(yōu)化，本文所使用的方法僅適用于TechMate色譜柱。

高效液相色法三聚氰胺

高效液相色譜法（HPLC）是20世紀(jì)60年代后期發(fā)展起來(lái)的一種分析方法，被廣泛應(yīng)用于保健食品功效成分、營(yíng)養(yǎng)強(qiáng)化劑、維生素類、蛋白質(zhì)的分離測(cè)定等方面。針對(duì)近年來(lái)一些不法商家在牛奶中添加三聚氰胺的案例，筆者所在單位加強(qiáng)了乳制品中三聚氰胺的檢驗(yàn)工作，在執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)GB/T22388和GB/T22400的基礎(chǔ)上，摸索出另一種使用HPLC檢測(cè)原料乳和乳制品中三聚氰胺的方法，通過(guò)一段時(shí)間的實(shí)驗(yàn)，效果顯著，現(xiàn)將該方法總結(jié)歸納如下，供業(yè)界參考。

1 基本原理

用50%甲醇和乙酸鉛溶液作為原料乳和乳制品的蛋白質(zhì)沉淀劑與三聚氰胺提取劑，強(qiáng)陽(yáng)離子交換色譜柱分離，高效液相色譜—紫外檢測(cè)皿/二極管陣列檢測(cè)皿檢測(cè)，外標(biāo)法定量。

2 試劑與材料

水：GB/T6682規(guī)定的一級(jí)水；乙腈（CH3CN）：色譜純；磷酸（H3PO4）；磷酸二氫鉀（KH2PO4）；三聚氰胺溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)：1.00mg/mL；乙酸鉛溶液：稱取22g乙酸鉛（準(zhǔn)確至0.01g），加水800mL完全溶解后，用水稀釋至1L，用濾膜過(guò)濾后備用；磷酸鹽緩沖液：0.05mol/L（稱取6.8g磷酸二氫鉀，加水800mL完全溶解后，用磷酸調(diào)節(jié)pH至3.0，用水稀釋至1L，用濾膜過(guò)濾后備用）；一次性注射皿：5mL；濾膜：水相，0.45μm；針式過(guò)濾皿：有機(jī)相，0.45μm；具塞刻度試管：50mL；移液槍：2～20μL、5～50μL、20～200μL、100～1000μL。

3 儀皿

高效液相色譜儀：配有紫外檢測(cè)皿/二極管陣列檢驗(yàn)皿；分析天平：感量0.0001g稱0.01g；pH試紙：pH0.5～5.0；溶劑過(guò)濾皿；離心機(jī)；渦旋混合皿；超聲波清洗皿。

4 測(cè)定步驟

4.1 試樣的制備

稱取混合均勻的15g乳制品樣品（準(zhǔn)確至0.01g），置于50mL具塞刻度試管中，加入5mL乙酸鉛溶液，在加入25mL甲醇/水（1:1），渦旋混勻，加水至50mL，渦旋振蕩6min，離心10min，轉(zhuǎn)速為3000r，靜置后用一次性注射皿吸取上清液，用針式過(guò)濾皿過(guò)濾，作為分析試樣。

4.2 高效液相色譜測(cè)定

4.2.1 色譜條件：

色譜性：TechMateCR（1:5）-ST5μm120?4.6×250mm；流動(dòng)相：磷酸鹽緩沖溶液—乙腈（70+30，體積比）；流速：1mL/min；柱溫：35℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：240nm；進(jìn)樣量：20μL。

4.2.2 液相色譜分析測(cè)定

4.2.2.1 儀皿的準(zhǔn)備

開(kāi)機(jī)，用流動(dòng)相平衡色譜柱，待基線穩(wěn)定后，進(jìn)樣檢測(cè)。

4.2.2.2 定性分析

依據(jù)保留時(shí)間一致性進(jìn)行定性識(shí)別，根據(jù)三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的保留時(shí)間，確定樣品中三聚氰胺的色譜峰。

4.2.2.3 定量分析：校準(zhǔn)方法為外標(biāo)法。

4.2.2.3.1標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

用甲醇/水（1:1）將三聚氰胺溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)逐級(jí)稀釋得1、2、5、10、20μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)工作液，濃度由低到高進(jìn)行檢測(cè)，以峰面積—濃度作圖，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程。

4.2.2.3.2試樣測(cè)定

按試樣分別進(jìn)樣，獲得目標(biāo)峰面積，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算被測(cè)試樣中三聚氰胺的含量（mg/kg）。

4.2.3 結(jié)果計(jì)算

4.2.3.1 計(jì)算公式

式中：X-乳制品三聚氰胺的含量（mg/mL）；

C-從標(biāo)準(zhǔn)曲線得到的三聚氰胺溶液的濃度（mg/L）；

V-試樣定容體積（mL）；

M-樣品稱量質(zhì)量（g）。

4.2.3.2 計(jì)算結(jié)果有效數(shù)字

保留3位有效數(shù)字。

4.3 方法檢測(cè)限

檢測(cè)限為2mg/kg。

圖A 三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖（10mg/L）

圖B 以峰面積—濃度作出的標(biāo)準(zhǔn)曲線