HPLC檢測血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑活性

李菲菲

（淄博市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院 腎內(nèi)科，山東 淄博 255026）

HPLC檢測血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑活性

李菲菲

（淄博市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院 腎內(nèi)科，山東 淄博 255026）

建立高效液相色譜法測定血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑活性的方法。方法：依血管緊張素轉(zhuǎn)化酶能夠催化馬尿酰-組氨酰-亮氨酸分解為馬尿酸和組氨酰-亮氨酸，通過測定馬尿酸的降解量，測定血管緊張素活化酶抑制劑活性。結(jié)果：Shim-pack VP-ODS C18色譜柱250mm×4.6mm，填料粒徑5μm，柱溫為30℃，流動(dòng)相：乙腈（0.1%冰乙酸，0.1%三乙胺）-雙蒸水（0.1%冰乙酸，0.1%三乙胺）（28∶72），流速為 0.8mL·min-1，檢測波長為228nm，在0.2～500μg·mL-1范圍內(nèi)馬尿酸濃度與其響應(yīng)值呈良好的線性關(guān)系（R=0.9999），檢測限為0.02μg·mL-1，馬尿酸的回收率為97.51%～101.08%，RSD值為0.20%～1.35%。結(jié)論：本方法能夠準(zhǔn)確、精密的測定血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑活性，為血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑的研發(fā)應(yīng)用提供準(zhǔn)確可靠的手段。

高效液相色譜；血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑；馬尿酸

血管緊張素是一種肽類物質(zhì)，具有極強(qiáng)的縮血管作用，參與血液和體液調(diào)節(jié)，主要受血管緊張素轉(zhuǎn)化酶的調(diào)節(jié)，血管緊張素轉(zhuǎn)化酶能夠?qū)⒒钚暂^弱的血管緊張素Ⅰ迅速轉(zhuǎn)化為升壓效果顯著的血管緊張素Ⅱ，從而使血壓上升。血管緊張素主要來源于腎素，而在正常情況下人體內(nèi)的腎素分泌很少，因此，血管緊張素對機(jī)體的血壓影響并不顯著，而只有在機(jī)體大量失血或腎臟出現(xiàn)問題、透析等情況下血管緊張素才會(huì)生成增多，從而促使血壓升高[1]。在該過程中血管緊張素轉(zhuǎn)化酶起到了關(guān)鍵的作用，因此，越來越多的醫(yī)藥工作者對血管緊張素轉(zhuǎn)化酶的抑制藥物進(jìn)行研究，以期能夠抑制血管緊張素轉(zhuǎn)化酶的活性，從而抑制血管緊張素轉(zhuǎn)化為活性更高的血管緊張素，而血管緊張素抑制劑的活性則是其重要的衡量標(biāo)準(zhǔn)，因此，必須建立快速、準(zhǔn)確的檢測血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑活性的方法[2]。

目前，測定血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑常用方法主要有：（1）紫外-可見分光光度法；（2）高效毛細(xì)管電泳法；（3）高效液相色譜法。紫外-可見分光光度法是將待測溶液于228nm下測定其吸光度，由于該方法無分離效果，測試結(jié)果多偏高；毛細(xì)管電泳法由于進(jìn)樣量小，因此，其靈敏度較低[3-5]；本文參考其他研究者檢測方法，并在其基礎(chǔ)上進(jìn)一步優(yōu)化，得出了一種利用高效液相色譜法準(zhǔn)確測定血管緊張素轉(zhuǎn)化酶活性的方法。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

島津LC-20AT高效液相色譜儀，配備SIL-20A自動(dòng)進(jìn)樣器、Labsolution色譜工作站、配備SPD-M20a檢測器；生化培養(yǎng)箱、取液器。

馬尿酸（批號：140738-200501中國食品藥品檢定研究院）；馬尿酰-組氨酸-亮氨酸（sigma公司）；血管緊張素轉(zhuǎn)化酶（Sigma公司）；貝那普利（Sigma公司）；乙腈（色譜級）；三乙胺、硼酸、硼砂、NaCl均為分析純。

1.2 色譜條件

Shim-pack VP-ODS C18色譜柱250mm×4.6mm，填料粒徑5μm，柱溫為30℃，流動(dòng)相：乙腈（0.1%冰乙酸，0.1%三乙胺）-雙蒸水（0.1%冰乙酸，0.1%三乙胺）（28：72），流速為 0.8mL·min-1，檢測波長為228nm，進(jìn)樣量 10μL。

1.3 測定原理

血管緊張素轉(zhuǎn)化酶能夠催化馬尿酰-組氨酸-亮氨酸分解為馬尿酸和組氨酸-亮氨酸組成的二肽。當(dāng)有血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑存在時(shí)，血管緊張素轉(zhuǎn)化酶的活性受到抑制，催化馬尿酰-組氨酸-亮氨酸分解為馬尿酸和組氨酸-亮氨酸二肽的能力下降，可以通過檢測馬尿酸的量來衡量血管緊張素轉(zhuǎn)化酶活性受抑制的程度?？梢酝ㄟ^下式計(jì)算血管緊張素轉(zhuǎn)化酶活性受抑制的程度[3]。

式中 f1：未加入血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑溶液中馬尿酸的響應(yīng)值；f2：為加入血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑溶液中馬尿酸的響應(yīng)值。

1.4 供試品制備

0.1 mol·L-1硼酸溶液 稱取硼酸適量，用pH值8.3的0.3mol·L-1NaCl溶液溶解并稀釋制成每1L含硼酸0.1mol的溶液。

貝那普利溶液 稱取適量的貝那普利用0.1mol·L-1硼酸溶液配制成一定濃度的溶液，再精密量取適量，用0.1mol·L-1硼酸溶液稀釋至所需濃度。

血管緊張素轉(zhuǎn)化酶 將2U的血管緊張素轉(zhuǎn)化酶溶于20ml 0.1mol·L-1硼酸溶液中，搖勻，即得。

馬尿酰-組氨酸-亮氨酸溶液 取馬尿酰-組氨酸-亮氨酸適量，用0.1mol·L-1硼酸溶液稀釋制成 0.5mmol·L-1的溶液。

馬尿酸對照溶液配制 取馬尿酸對照品適量，用 0.1mol·L-1硼酸溶液配制成 1mmol·L-1的馬尿酸對照品儲備溶液，再用0.1mol·L-1硼酸溶液稀釋成不同濃度的馬尿酸標(biāo)準(zhǔn)溶液。

反應(yīng)溶液 取適量的貝那普利溶液用0.1mol·L-1硼酸溶液稀釋成不同濃度，分別取20μL，加入10μL血管緊張素轉(zhuǎn)化酶溶液，于37℃下平衡5min，加入馬尿酰-組氨酸-亮氨酸溶液100μL，于37℃恒溫條件下反應(yīng)30min，用1.0mol·L-1的HCl 170μL終止反應(yīng)。同法制備用0.1mol·L-1H3BO3溶液代替貝那普利溶液的反應(yīng)液作為混合溶液。

空白溶液 取0.1mol·L-1硼酸溶液作為空白溶液。

2 結(jié)果與討論

2.1 檢測波長的選擇

取馬尿酸適量，用0.1mol·L-1H3BO3溶液溶解并稀釋成 10μg·mL-1的溶液，以 0.1mol·L-1H3BO3溶液作空白溶液。在200～400nm波長范圍內(nèi)進(jìn)行光譜掃描，結(jié)果見圖1。

圖1 馬尿酸紫外吸收掃描圖Fig.1 UV absorption spectra of hippuric acid

由圖1可見，馬尿酸在200nm與228nm處有最大吸收，由于200nm為末端吸收，檢測時(shí)干擾較大，因此選擇228nm作為檢測波長。

2.2 色譜分析

通過上述色譜條件采集的典型色譜圖（圖2）可知，馬尿酸與三肽能有效分離，且加入貝那普利的溶液比不加入貝那普利溶液馬尿酸的峰面積減小，說明該條件適合血管緊張素抑制沒測定。

圖2 血管緊張素活化酶抑制劑活性檢測典型色譜圖Fig.2 HPLC chromatogram of activity detection of angiotensin I-converting enzyme

2.3 線性關(guān)系和檢測線

馬尿酸對照溶液配制：取馬尿酸對照品適量，用0.1mol·L-1H3BO3溶液配制成 1mmol·L-1的馬尿酸對照品儲備溶液，再用0.1mol·L-1H3BO3溶液稀釋成不同濃度的馬尿酸標(biāo)準(zhǔn)溶液。以樣品濃度為橫坐標(biāo)，分面積為縱坐標(biāo)，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，所得線性回歸方程為A=31.89C-28.34，相關(guān)系數(shù)0.9999。結(jié)果表明，馬尿酸在0.2～500μg·mL-1的濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，因此在該濃度范圍內(nèi)，通過檢測馬尿酸的含量可以間接反映血管緊張素被抑制的程度。以S/N為3為檢測限濃度，測得檢測限的濃度為0.02μg·mL-1，該方法檢出能力能夠滿足樣品的分析。

2.4 精密度實(shí)驗(yàn)

取相同濃度（線性關(guān)系100%溶液）的供試品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，測得馬尿酸峰面積的RSD為0.046%，表明該儀器精密度良好。

2.5 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

配制6份相同濃度的供試品溶液，分別進(jìn)樣，計(jì)算6次檢測峰面積RSD值，6次測定結(jié)果峰面積RSD值為0.92%，說明該檢測方法重復(fù)性良好。

2.6 回收率實(shí)驗(yàn)

在已知濃度的樣品中加入不同量的馬尿酸，配制3個(gè)不同濃度，作為回收率供試品溶液，分別測定樣品溶液和混合液中馬尿酸的濃度，依據(jù)測定結(jié)果計(jì)算測得量與加入量的比值，計(jì)算回收率值，結(jié)果顯示，馬尿酸回收率為97.51%～101.08%，RSD值為0.20%～1.35%，說明該方法能夠準(zhǔn)確測定該物質(zhì)。

表1 馬尿酸回收率實(shí)驗(yàn)Tab.1 Recovery experiment of hippuric acid

3 結(jié)論

血管緊張素為人體內(nèi)重要的血管活性物質(zhì)，而血管緊張素活化酶是促使血管緊張素發(fā)揮作用必不可少的物質(zhì)，為控制血管緊張素帶給人體的不良反應(yīng)，血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑被不斷發(fā)明[6-8]。本研究為高效液相色譜法快速檢測血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑的方法，該方法具有準(zhǔn)確、精密的特點(diǎn)，能夠快速的測定血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑的活性，為血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑產(chǎn)品的開發(fā)應(yīng)用提供依據(jù)。

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Determination of angiotensin converting enzyme inhibitor activity by HPLC

LI Fei-fei
（ Urology Department，Zibo Traditional Chinese and Western Medicine Hospital，Zibo 255026，China）

objective A high performance liquid chromatographic method to determine angiotensin-converting enzyme inhibitor activity in vitro was established.Method N-hippuryl-his-leu can be devided into hippuric acid and His-Leu by Angiotensin Converting Enzyme，it can be used for determination of angiotensin inhibitor activity.Result hippuric acid was separated on an Shim-pack VP-ODS C18column （250mm×4.6mm,5μm）using a mobile phase consisting of acetonitrile and water（28∶72，V/V,containing 0.1 glacial acetic acid）at a flow rate of 0.8mL·min-1and detected at 228nm.A good linear relationship was observed for hippuric acid over the concentration range of 0.2 to 500 μg·mL-1with a correlation coefficient of 0.9999.The average spike recovery rates of hippuric acid were 97.51%～101.08%with a relative standard deviation （RSD）of 0.20%～1.35%.Conclusion The HPLC method was accurately and precisely,accurate and suitable for the analysis of ACE inhibitory activity,and provides an accurate and reliable means for the research and application of angiotensin converting enzyme inhibitors.

high performance liquid chromatography（HPLC）；angiotensin I-converting enzyme hippuric acid

R-331

A

10.16247/j.cnki.23-1171/tq.20171129

2017-07-21

李菲菲（1982-），女，主治醫(yī)師，主要研究方向：腎內(nèi)科血液凈化方向。