吡格列酮對糖尿病大鼠視網(wǎng)膜早期病變的影響及其機(jī)制研究

楊主敏，王 鮮，徐 濤，潘學(xué)良，陸德琴 （貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院：眼科，病理科，貴州 貴陽 550004）

吡格列酮對糖尿病大鼠視網(wǎng)膜早期病變的影響及其機(jī)制研究

楊主敏1，王 鮮1，徐 濤1，潘學(xué)良1，陸德琴2（貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院：1眼科，2病理科，貴州 貴陽 550004）

目的：探討吡格列酮對早期糖尿病大鼠視網(wǎng)膜絲氨酸／蘇氨酸激酶（Akt）的表達(dá)及微血管病變的影響．方法：雄性SD大鼠共58只，取18只作為非糖尿病模型組，其余采用鏈脲佐菌素（STZ）誘導(dǎo)大鼠糖尿病模型，去除未成模及死亡的大鼠4只，將糖尿病模型組大鼠隨機(jī)分為糖尿病組（n＝18）及治療組（n＝18）．治療組在建模后第3天開始給予吡格列酮灌胃（10 mg／kg，隔日一次），非糖尿病模型組和糖尿病模型組大鼠則在同時間給予等量的生理鹽水灌胃，所有大鼠每周監(jiān)測血糖及體質(zhì)量．給藥后4周、8周末進(jìn)行大鼠視網(wǎng)膜鋪片觀察、免疫組織化學(xué)法檢測 p-Akt（Ser473）、p-Akt（Thr308）及總Akt蛋白的陽性單位及分布．結(jié)果：免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示，相比非糖尿病組，糖尿病組視網(wǎng)膜中的Akt、p-Akt（Ser473）及p-Akt（Thr308）表達(dá)降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0．05）．治療組 Akt、p-Akt（Ser473）及 p-Akt（Thr308）陽性反應(yīng)表達(dá)較糖尿病組增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0．05）．ADP酶染色法顯示：4周時各組間視網(wǎng)膜血管無明顯變化，均未見明顯周邊部毛細(xì)血管扭結(jié)、迂曲或形成血管閉塞及血管袢現(xiàn)象；8周時，糖尿病組和治療組均可看見視網(wǎng)膜周邊部毛細(xì)血管有扭結(jié)、迂曲，但治療組該現(xiàn)象較對照組減輕．結(jié)論：吡格列酮能明顯激活實驗性糖尿病大鼠Akt蛋白及其磷酸化位點，從而緩解糖尿病大鼠的視網(wǎng)膜早期病變．

糖尿病視網(wǎng)膜病變；Akt；p-Akt；吡格列酮

0 引言

糖尿病視網(wǎng)膜病變（diabetic retinopathy，DR）作為糖尿病的眼部并發(fā)癥已嚴(yán)重影響人類的健康．研究［1-3］表明，糖尿病血管病變的主要原因是血管內(nèi)皮細(xì)胞功能異常．其中PI3K／AKt信號通路在糖尿病血管內(nèi)皮炎癥、凋亡、增殖的調(diào)控中起關(guān)鍵作用［4-6］．吡格列酮是噻唑烷二酮類抗糖尿病藥物，是過氧化物酶增殖物激活受體 γ（peroxisome proliforator-activated receptor γ， PPAR-γ）激動劑，增加依賴胰島素的葡萄糖的處理．但是否通過影響PI3K／AKt信號通路，從而能改善血管內(nèi)皮細(xì)胞功能卻少有報道．本研究旨在觀察吡格列酮對糖尿病大鼠視網(wǎng)膜Akt蛋白表達(dá)及其磷酸化的變化，以及能否緩解早期糖尿病視網(wǎng)膜微血管病變，探討其意義和可能的機(jī)制．

1 材料和方法

1．1 材料 選取同一批繁殖的雄性Sprague Dawley（SD）大鼠（重慶騰鑫實驗動物中心提供）共58只，體質(zhì)量（200±20）g．在貴州醫(yī)科大學(xué)病理生理教研室飼養(yǎng)區(qū)飼養(yǎng)，整個過程中以標(biāo)準(zhǔn)顆粒飼料喂養(yǎng)，不限食水．適應(yīng)性喂養(yǎng)一周后，隨機(jī)取18只作為非糖尿病大鼠模型，40只作為造模組．將鏈脲佐菌素（streptozotocin， STZ， Sigma 公司）以 0．1 mol／L，pH4．5 的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液配成1%溶液，按50 mg／kg體質(zhì)量一次性由鼠尾靜脈注射，建立糖尿病模型，非糖尿病模型作為空白對照，方法為將大鼠鼠尾靜脈則注射等量的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液．給藥72 h后，用羅氏血糖儀（美國堡靈曼公司）取鼠尾靜脈血檢測血糖，血糖值超過17．6 mmol／L即認(rèn)為成功建立糖尿病鼠模型，未成模及死亡大鼠4只．

1．2 方法 將糖尿病模型大鼠隨機(jī)分成為糖尿病組（n＝18，DM 組）和治療組（n＝18，PIO 組），PIO 組給予吡格列酮灌胃（10 mg／kg，隔日一次，連續(xù) 8周）．給藥后4周末及8周末，用腹腔注射水合氯醛麻醉后經(jīng)股動脈放血處死各組大鼠并取材．取出各組大鼠雙眼眼球，左眼用于免疫組織化學(xué)測定，右眼用于視網(wǎng)膜酶組織化學(xué)染色鋪片．

1．2．1 免疫組織化學(xué)染色 采用免疫組織化學(xué)（strept avidin-biotin complex，SABC）法，多克隆抗體（santa公司）．制備視網(wǎng)膜石蠟切片，切片厚度為5 μm．將組織在室溫中放置60 min后，經(jīng)二甲苯脫蠟和乙醇逐級水化后，再對組織抗原進(jìn)行高溫?zé)嵝迯?fù)；冷卻至常溫后，用自來水沖洗5 min，加3%過氧化氫恒溫箱孵育以阻斷內(nèi)源性過氧化物酶；磷酸鹽緩沖液（PBS）洗3次，各5 min；加非免疫性動物血清封閉液，20 min后甩去多余液體，滴加一抗4℃過夜；PBS洗5 min共3次，滴加生物素化二抗，室溫下30 min；PBS洗3次，各2 min，然后DAB顯色，自來水沖洗5 min，蘇木素復(fù)染，逐級脫水、透明、封片、鏡檢．有陽性表達(dá)的 Akt蛋白、Akt（Ser473）和 Akt（Thr308）的細(xì)胞質(zhì)均呈現(xiàn)棕黃色或黃褐色顆粒．

1．2．2 視網(wǎng)膜血管鋪片 大鼠眼球經(jīng)4%多聚甲醛固定24 h后取出，將眼球沿鋸齒緣剪開，除去角膜、晶狀體，再以視乳頭為中心，沿4個方向作放射狀切開，除去鞏膜、脈絡(luò)膜，在培養(yǎng)皿中放置一張浸濕濾紙，將視網(wǎng)膜平鋪于上面，用毛筆刷去玻璃體及后面的色素，直至半透明狀的視網(wǎng)膜．按照ADP酶染色法對視網(wǎng)膜進(jìn)行染色：①將視網(wǎng)膜鋪片用Tris-馬來酸緩沖液（0．05 M，pH 為 7．2）沖洗 15 min，共 5 次．②于 37℃反應(yīng)液（濃度為 0．2 M，pH 為 7．2的 Tris-馬來酸緩沖液中加入3 mol／L硝酸鉛、6 mol／L氯化鎂、1 mg／mL ADP）中反應(yīng) 15 min．③Tris-馬來酸緩沖液（0．05 M， pH 為 7．2）沖洗 15 min，共 5 次．④用 10%硫化銨顯色 5 min．⑤Tris-馬來酸緩沖液（0．05 M，pH為7．2）沖洗15 min，共 5次．⑥甘油明膠封片，顯微鏡下觀察．

1．3 圖像處理 大鼠視網(wǎng)膜切片經(jīng)過免疫組織化學(xué)染色，在光學(xué)顯微鏡下觀察，有陽性表達(dá)的Akt蛋白、Akt（Ser473）和 Akt（Thr308）的細(xì)胞質(zhì)均呈現(xiàn)棕黃色或黃褐色顆粒．將每組大鼠視網(wǎng)膜隨機(jī)取18張切片，每張切片在400×顯微鏡視野下隨機(jī)觀察5個視野，利用分析軟件（武漢千屏公司HMIAS-2000高清晰度彩色病理圖片報告分析系統(tǒng)）測定視野中陽性單位值．

1．4 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS18．0統(tǒng)計學(xué)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析．計量資料以±s表示，多組均數(shù)比較采用One-Way ANOVA分析，多個樣本均數(shù)間兩兩比較通過Student-Newman-Keuls分析；兩組均數(shù)比較采用兩獨立樣本t檢驗，P＜0．05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義．

2 結(jié)果

2．1 各組大鼠的血糖及體質(zhì)量變化 實驗期間（給藥后4周、8周），糖尿病組大鼠和治療組大鼠血糖顯著高于同時間點的非糖尿病組（P＜0．05，表 1），而體質(zhì)量明顯低于同時間點的非糖尿病組（P＜0．05，表 2）．

表 1 各組大鼠血糖檢測結(jié)果 （n＝9，mmol／L，±s）

表 1 各組大鼠血糖檢測結(jié)果 （n＝9，mmol／L，±s）

aP＜0．05 vs非糖尿病組．

分組 0周 4周 8周非糖尿病組 5．89±1．14 6．00±0．71 5．52±0．53糖尿病組 5．51±0．88 28．90±2．17a 25．51±3．60a治療組 5．51±0．55 26．97±3．19a 27．71±4．23a

表2 各組大鼠體質(zhì)量檢測結(jié)果 （n＝9，g，±s）

表2 各組大鼠體質(zhì)量檢測結(jié)果 （n＝9，g，±s）

aP＜0．05 vs非糖尿病組．

分組 0周 4周 8周非糖尿病組 195．58±20．48 297．87±14．09 402．73±27．07糖尿病組 201．78±24．86 126．50±18．11a 126．44±12．98a治療組 201．81±21．37 155．84±14．63a 148．97±19．12a

2．2 各組大鼠視網(wǎng)膜上 Akt蛋白、Akt（Ser473）及Akt（Thr308）蛋白的表達(dá) 光鏡觀察：在給藥后4周、8周兩個時間點，非糖尿病組大鼠視網(wǎng)膜可見大量的Akt及p-Akt表達(dá)，呈陽性棕黃色反應(yīng)，在內(nèi)核層和節(jié)細(xì)胞層表現(xiàn)最顯著．在糖尿病組大鼠視網(wǎng)膜中，4周時可見較弱的Akt及p-Akt表達(dá)，8周的陽性表達(dá)尤其微弱．治療組Akt及p-Akt的陽性反應(yīng)程度及范圍均較同期糖尿病組明顯增多（圖1）．

圖1 4周大鼠視網(wǎng)膜Akt的表達(dá)（DAB顯色，×400）

2．3 計算機(jī)圖像定量分析 同一時間點中，糖尿病組大鼠視網(wǎng)膜 Akt蛋白、Akt（Ser473）及 Akt（Thr308）的陽性單位較非糖尿病組明顯減少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0．05）．治療組大鼠視網(wǎng)膜 Akt蛋白、Akt（Ser473）及 Akt（Thr308）的陽性反應(yīng)面積較糖尿病組明顯增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0．05，表 3）．

2．4 ADP酶組織化學(xué)結(jié)果 ADP酶組織化學(xué)顯示：給藥4周時，非糖尿病組大鼠視網(wǎng)膜血管自視盤發(fā)出動靜脈向四周呈放射狀分布，周邊毛細(xì)血管分布均勻；糖尿病組和治療組大鼠視網(wǎng)膜與非糖尿病組比，其血管形狀、分布、走形等均無明顯變化．給藥在8周時，糖尿病組和治療組大鼠可見視網(wǎng)膜血管無灌注區(qū)及周邊部毛細(xì)血管迂曲、扭結(jié)及血管閉塞現(xiàn)象，并且糖尿病組該現(xiàn)象比治療組明顯（圖2）．

表3 免疫組化檢測各組大鼠視網(wǎng)膜Akt、Akt-Ser473及Akt-Thr308蛋白的表達(dá) （n＝9，±s）

表3 免疫組化檢測各組大鼠視網(wǎng)膜Akt、Akt-Ser473及Akt-Thr308蛋白的表達(dá) （n＝9，±s）

aP＜0．05 vs非糖尿病組；cP＜0．05 vs糖尿病組．

4周分組8周Akt Akt（Ser473） Akt（Thr308）Akt Akt（Ser473） Akt（Thr308）非糖尿病組 20．07±0．60 19．49±0．56 20．20±0．35 19．73±0．64 19．58±0．62 20．06±0．33糖尿病組 9．23±0．63a 9．72±0．70a 9．95±0．44a 7．37±0．39a 8．30±0．46a 7．65±0．40a治療組 14．36±0．53c 14．97±0．36c 14．84±0．45c 13．85±0．54c 14．82±0．33c 14．78±0．42c

圖2 8周各組ADP酶組織化學(xué)結(jié)果

3 討論

糖尿病視網(wǎng)膜病變是糖尿病的眼部并發(fā)癥，該病的發(fā)生率隨著糖尿病病程的延長而增高，并且是導(dǎo)致失明的重要原因之一．DR的發(fā)病機(jī)制尚不清楚，目前經(jīng)典理論認(rèn)為DR最基本的病理改變是微血管改變［7-9］，而內(nèi)皮細(xì)胞是微血管的一道屏障．研究表明高糖條件下產(chǎn)生的活性氧簇（reactive oxygen species，ROS）可使Akt去磷酸化，促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，PI3K／Akt的特異性抑制劑LY294002以劑量依賴性方式削弱內(nèi)皮細(xì)胞的生殖，而在高糖條件下轉(zhuǎn)染構(gòu)建性激活的Akt突變體能增加內(nèi)皮細(xì)胞的增生；高糖還能抑制PKB激活或加速PKB滅活，進(jìn)而抑制其下游eNOS的產(chǎn)生而加速內(nèi)皮細(xì)胞凋亡［10］．研究［11］表明，PI3K／Akt途徑參與抑制炎癥反應(yīng)，激活A(yù)kt可發(fā)揮部分抗炎作用，保護(hù)受損的內(nèi)皮細(xì)胞，Akt去活化誘導(dǎo)血管黏附分子-1（vascular adhesion molecule 1， VCAM-1）的表達(dá)，誘導(dǎo)炎癥效應(yīng)，促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞的損傷．

吡格列酮是噻唑烷二酮類抗糖尿病藥，已廣泛用于臨床．在體內(nèi)能通過激活PPARγ受體而發(fā)揮其生物學(xué)作用．PPARγ在多種組織均有低水平的表達(dá)，在血管平滑肌和內(nèi)皮細(xì)胞也有表達(dá)［12-13］．PPARγ的激活不僅能改善胰島素敏感性，降低血糖，還能通過增強(qiáng)eNOS-Serll79、1177的磷酸化及eNOS與熱休克蛋白90的相互作用而刺激NO的釋放，對血管內(nèi)皮產(chǎn)生保護(hù)作用［14-15］．然而，吡格列酮是否通過激活PI3K／Akt途徑，從而緩解糖尿病視網(wǎng)膜的微血管病變，目前尚未見報道．本研究發(fā)現(xiàn)，用STZ誘導(dǎo)的早期糖尿病大鼠視網(wǎng)膜中Akt蛋白、Akt（Ser473）及Akt（Thr308）表達(dá)均較非糖尿病組明顯降低，并在8周時可見視網(wǎng)膜周邊部毛細(xì)血管迂曲、扭結(jié)及血管閉塞現(xiàn)象．而用吡格列酮治療組，大鼠視網(wǎng)膜Akt蛋白和其磷酸化位點Ser473、Thr308表達(dá)均較糖尿病組升高，且8周時視網(wǎng)膜毛細(xì)血管迂曲、扭結(jié)及血管閉塞現(xiàn)象較糖尿病組程度輕．提示我們糖尿病視網(wǎng)膜血管的早期病變可能與抑制PI3K／Akt通路有關(guān)．

綜上所述，吡格列酮作為噻唑烷二酮類抗糖尿病藥物在控制血糖的同時也可通過激活PI3K／Akt通路保護(hù)視網(wǎng)膜微血管病變，這將有可能為糖尿病視網(wǎng)膜病變的發(fā)病機(jī)制及治療方法的選擇等提供一些新的思路．

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Effect of pioglitazone on early retinopathy of diabetic rats and its mechanism

YANG Zhu-Min1， WANG Xian1， XU Tao1， PAN Xue-Liang1， LU De-Qin21Department of Ophthalmology，2Department of Pathology， Affiliated Hospital of GuiZhou Medical University， Guiyang 550004，China

AIM： To investigate the effect of pioglitazone on the expression of serine／threonine kinase （Akt） and microvascular diseases in early diabetic rats．METHODS： A total of 58 male SD rats were selected as the objects of study．Eighteen rats were selected as normal control group．The diabetic rat models induced by streptozotocin （STZ） were randomly divided into diabetes group（9 rats×2） and pioglitazone treatment group（9 rats×2），and 4 unpaired model or death rats were removed．The rats in the treatment group were gavaged with pioglitazone （10 mg／kg， every other day） on the 3rd day after modeling．The normal control group and diabetic rats were treated with equal saline at the same time．The blood glcouse and body weight of all the rats were measured weekly．The retinas were spreaded and the expression of Akt， p-Akt（Ser473）， p-Akt（Thr308）in the retinas were detected by immunohistochemistry four weeks and eight weeks after treatment． RESULTS： Immunohistochemicalanalysisresults showed that the expression of Akt， p-Akt（Ser473） and p-Akt（Thr308） in the retinas of diabetes group were significantly lower than those of non-diabetic group，with statistically significant differences（P＜0．05）； the positive expression of Akt， p-Akt（Ser473） and p-Akt（Thr308） in pioglitazone treatment group were significantly increased than those of diabetes group，with statistically significant differences （P＜0．05）．ADP enzyme histochemical method displayed that there were no significant changes in retinal blood vessels between these two tested groups，there are no obvious tortuosity and kinking or vascular loops and vascular occlusion four weeks after treatment．However， the kinking and tortuosity of peripheral retinal capillary were visible both in diabetes and treatment group eight weeks after treatment，which were more obvious in treatment group than that in diabetes group．CONCLUSION：Pioglitazone can significantly active the Akt protein and its phosphorylation sites in experimental diabetic rats and relieve retinal diseases of diabetic rats at early stage．

diabetic retinopathy； Akt； p-Akt； pioglitazone

R587．2；R774．1

A

2095-6894（2017）11-48-04

2017-08-15；接受日期：2017-09-05

貴州省科學(xué)技術(shù)基金（黔科合J字［2010］2167號）

楊主敏．碩士生．研究方向：眼底疾?。?/p>

E-mail：549762141＠ qq．com

王 鮮．主任醫(yī)師．研究方向：眼底疾?。?/p>

E-mail：liangliang830＠ 126．com