陜西濃縮海紅果汁中高滲酵母的分離鑒定

王虎玄， 劉 婷， 馬 原， 藺澤雪， 劉 寧， 楊 輝

(陜西科技大學 食品與生物工程學院， 陜西 西安 710021)

陜西濃縮海紅果汁中高滲酵母的分離鑒定

王虎玄， 劉 婷， 馬 原， 藺澤雪， 劉 寧， 楊 輝*

(陜西科技大學 食品與生物工程學院， 陜西 西安 710021)

為研究引起海紅果濃縮汁污染腐敗的高滲酵母，采用YPD高糖培養(yǎng)基對陜西海紅果加工廠的海紅果濃縮汁中的高滲酵母進行分離純化，并從耐糖、耐酸及產(chǎn)氣性方面對分離菌株的污染能力進行了研究；對分離菌株菌落形態(tài)和細胞形態(tài)特征進行了描述，并以26S rDNA序列構建系統(tǒng)發(fā)育樹，確定了分離菌的遺傳學位置；進一步研究了分離株在海紅果濃縮汁中的生長情況.共獲得4株酵母菌，兩株為釀酒酵母 (Saccharomycescerevisiae)，兩株為魯氏接合酵母(Zygosaccharomycesrouxii)；魯氏接合酵母(Z.rouxii)的耐糖性、耐酸性及產(chǎn)氣性強于釀酒酵母(S.cerevisiae)，并且魯氏接合酵母能夠在海紅果濃縮汁中生長.結果表明: 魯氏接合酵母具有較強的潛在污染能力，會對海紅果濃縮汁質量造成威脅，需要加強控制.

濃縮海紅果汁； 高滲酵母； 污染能力； 分離鑒定； 魯氏接合酵母

0 引言

濃縮果汁由于具有高糖及高酸特性，因而表現(xiàn)出良好的微生物穩(wěn)定性，已成為水果加工的重要途徑.但一直以來有關高滲酵母污染濃縮果汁的事件時有發(fā)生，同時由于市售的果汁及飲料大多通過濃縮果汁稀釋調(diào)配而來，因此其也存在著被高滲酵母污染的風險[1-4].高滲酵母至少能夠在葡萄糖濃度為50%(w/v)環(huán)境下生長，污染果汁后可引起腐敗變質，降低產(chǎn)品的質量，包括營養(yǎng)成分的破壞，pH值、氣味的改變等，直接影響到產(chǎn)品的銷量[5,6].大多數(shù)酵母菌可代謝糖類物質產(chǎn)生CO2，導致包裝果汁脹包，甚至會引起爆炸，嚴重威脅消費者的身心健康，也給生產(chǎn)企業(yè)造成巨大的經(jīng)濟損失.近年來，海紅果作為西北地區(qū)一種稀有的極具地方特色的水果，其營養(yǎng)價值和加工價值正逐步被人們所認知和了解[7].濃縮海紅果汁因其高微生物穩(wěn)定性的特性已逐漸成為海紅果的主要加工途徑，但因高滲酵母的污染導致產(chǎn)品的銷售量下降.因此，對濃縮海紅果汁中高滲酵母污染的研究刻不容緩，但目前國內(nèi)外有關這方面的研究尚未見報道.

本文對來源于陜西省府谷縣聚金邦農(nóng)產(chǎn)品開發(fā)公司的濃縮海紅果汁中高滲酵母進行分離純化，對純化后菌株進行耐糖、耐酸及產(chǎn)氣性測定，進行菌落及細胞形態(tài)觀察，并基于26S rDNA測序進行菌種鑒定，最后研究分離株在濃縮海紅果汁中的生長情況，以證實分離株能夠污染濃縮汁，為濃縮海紅果汁加工中高滲酵母污染的控制提供技術支撐.

1 材料與方法

1.1 分離樣品與培養(yǎng)基試劑

1.1.1 分離樣品

海紅果濃縮清汁，pH值3.4±0.1，可溶性固形物含量為(68±1)°Bx，從陜西省府谷縣聚金邦農(nóng)產(chǎn)品開發(fā)公司收集.

1.1.2 培養(yǎng)基及主要試劑

YPD培養(yǎng)基：葡萄糖20 g，蛋白胨20 g，酵母浸粉10 g，蒸餾水1 000 mL.如需固體培養(yǎng)基，加入瓊脂粉20 g.

30%YPD培養(yǎng)基：葡萄糖300 g，蛋白胨20 g，酵母浸粉10 g，少量蒸餾水溶解后補加蒸餾水至1 000 mL.如需固體培養(yǎng)基，加入瓊脂粉20 g.

30%葡萄糖溶液：葡萄糖300 g，少量蒸餾水溶解后補加蒸餾水至1 000 mL.

酵母基因組提取試劑盒(北京天根)， 26S-D1/D2 rDNA擴增引物(北京華大)，PCR試劑(TaqDNA 聚合酶、dNTP、緩沖液、MgCl2)(大連Takara)，Marker(大連Takara)，瓊脂糖(美國Invitrogen).

1.2 主要儀器與設備

UV-2550 型紫外可見分光光度計,日本島津公司;HC-3018R型臺式冷凍離心機,安徽中科中佳科學儀器有限公司;CX31型顯微鏡,奧林巴斯公司;JA2003型電子天平,上海精密科學儀器有限公司;PTC-200型PCR儀,BIO-RAD公司;DY-A型電泳儀,上?？颠_儀器廠;Gel Doc XR型凝膠成像儀,BIO-RAD公司.

1.3 高滲酵母的分離純化

用移液槍吸取10 mL濃縮海紅果汁加入到含有90 mL無菌30% YPD 液體培養(yǎng)基的三角瓶后置于 28 ℃，120 r/min 搖床培養(yǎng) 48 h 進行菌體富集[1].然后采用無菌30%葡萄糖水對富集培養(yǎng)液進行連續(xù)梯度稀釋，選取合適梯度稀釋液后各取200μL于 30%YPD 固體培養(yǎng)基上進行涂布，28 ℃培養(yǎng)5～7 d.挑選具有典型酵母菌落特征的單菌落進一步反復劃線純化.純化后的菌落在光學顯微鏡下進行形態(tài)觀察和純度檢測，確認無雜菌后轉接到 YPD斜面培養(yǎng)基上，28 ℃培養(yǎng)3 d后置于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆?

1.4 耐糖性的測定

將20 mL無菌的葡萄糖濃度分別為500 g/L、550 g/L、600 g/L、650 g/L、700 g/L、750 g/L、800 g/L、850 g/L和900 g/L的YPD液體培養(yǎng)基置于三角瓶中，取處于對數(shù)生長期的酵母種子液200μL加入到上述培養(yǎng)液中，28 ℃，120 r/min 搖床培養(yǎng)48 h，取樣測定其在600 nm下的吸光度[8].每組樣品重復測定3次，使用SPASS軟件對數(shù)據(jù)方差分析處理.

1.5 耐酸性的測定

將20 mL無菌的pH分別為1.5、2、2.5、3、4、5和6的YPD液體培養(yǎng)基置于三角瓶中，取處于對數(shù)生長期的酵母種子液200μL加入到上述培養(yǎng)液中，28 ℃，120 r/min 搖床培養(yǎng)48 h，取樣測定其在600 nm下的吸光度.每組樣品重復測定3次，使用SPASS軟件對數(shù)據(jù)方差分析處理.

1.6 產(chǎn)氣性的測定

將10 mL無菌的葡萄糖濃度分別為500 g/L和800 g/L的YPD液體培養(yǎng)基置于試管中，取處于對數(shù)生長期的酵母種子液100μL加入到上述培養(yǎng)液中，用杜氏小管觀察代謝氣體的生成量，28 ℃靜置培養(yǎng)7天，每天觀察杜氏管中的氣體生成量.每組樣品重復測定3次.

1.7 菌落及細胞形態(tài)觀察

各分離株在YPD平板上涂布接種，28 ℃培養(yǎng)5 d后進行單菌落形態(tài)觀察，并拍照.取處于對數(shù)生長期的菌液，在光學顯微鏡下觀察菌株細胞形態(tài).

1.8 分子鑒定

1.8.1 菌體總DNA提取

將菌株在YPD培養(yǎng)液中活化培養(yǎng)后，收集菌體.按照酵母基因組DNA提取試劑盒的說明書進行菌體總DNA提取.

1.8.2 26S rDNA PCR擴增

采用通用引物NL-1∶5′-GCATATCAATAAG-CGGAGGAAAAG-3′及NL-4∶5′-GGTCCGTGTT-TCAAGACGG-3′ 進行PCR擴增，引物由北京六合華大基因有限公司合成[9].擴增體系：總體積50μL，包括10μL模板，1μL上游引物，1μL下游引物，0.2μLTaqDNA 聚合酶，1μL dNTP，1.8μL MgCl2，5μL 10 × PCR 緩沖液，2.5μL DMSO，27.5μL 滅菌蒸餾水[10].PCR 反應程序：94 ℃ / 3 min(預變性)；94 ℃ / 1 min變性，58 ℃ / 1 min 退火，72 ℃ / 2 min 延伸，36個循環(huán)；72 ℃ / 5 min 延伸.通過1.0% 瓊脂糖凝膠電泳確認擴增的DNA片段，并將PCR擴增產(chǎn)物寄送至北京六合華大基因有限公司進行測序[10].獲得的序列與GenBank數(shù)據(jù)庫中序列進行Blast(http:∥www.ncbi.nlm.nih.gov/)比對，用 CLUSTAL-X軟件進行序列比對，并用MEGA軟件進行系統(tǒng)發(fā)育樹構建[6].

1.9 分離菌株在濃縮海紅果汁中生長能力的測定

準備20支試管，每只試管中加入5 mL濃縮海紅果汁，100 ℃滅菌20 min.取處于對數(shù)生長期的酵母種子液200μL加入到無菌濃縮海紅果汁中，28 ℃靜置培養(yǎng).每隔48 h取1支試管，用30%葡萄糖液進行連續(xù)梯度稀釋，稀釋液在30%YPD固體平板上進行涂布，28 ℃培養(yǎng)5～7 d 后進行菌落計數(shù).每組樣品重復測定3次.

運用DMFit軟件中的Baranyi and Roberts 模型對菌落數(shù)(單位：lg CFU/mL)及培養(yǎng)時間(單位：d)進行擬合，根據(jù)擬合公式計算出各菌株生長曲線的潛在最大生長速率(μmax，lg CFU /(mL·d))及遲滯期(λ，d)[11].Baranyi and Roberts模型的簡化形式為：

N=N0exp(-λμmax)[-1+exp(λμmax)+

exp(μmaxt)]

(1)

式(1)中：t—任意時刻，d;N—t時刻的微生物數(shù)，CFU/mL;N0—初始時刻的微生物數(shù)，CFU/mL;μmax—潛在最大生長速率，lg CFU/(mL·d)；λ—遲滯期，d.

2 結果與討論

2.1 分離株耐糖性測定

從濃縮海紅果汁中分離高滲酵母，經(jīng)純化得到4株菌.菌株LT1和LT2具有相似的耐糖性，在葡萄糖濃度為500～650 g/L培養(yǎng)基中的生長速率隨著糖濃度的增加受到顯著抑制(plt;0.05).葡萄糖濃度進一步提高至700 g/L及以上時，生長被完全抑制(pgt;0.05).菌株LT3和LT4也表現(xiàn)出相似的耐糖性，在葡萄糖濃度為500～700 g/L培養(yǎng)基中的生長速率無顯著差異(pgt;0.05).隨著葡萄糖濃度的進一步提高(750～900 g/L)，由于高糖的脅迫作用，其生長速率逐漸減弱(plt;0.05)，表現(xiàn)出較強的耐糖性.由于LT1和LT2、LT3和LT4的耐糖性比較相似，圖1中只列出LT1和 LT3 的耐糖曲線.

2.2 分離菌耐酸性測定

由于LT1和LT2、LT3和LT4的耐酸性比較相似，圖2僅列出LT1和 LT3的耐酸曲線.可以看出，4株分離菌均可在pH為3～6的培養(yǎng)基中生長，且pH從6降到3對分離株的生長速率無顯著影響(pgt;0.05).進一步降低pH至2.5，酸脅迫作用才體現(xiàn)出來，4株分離菌的生長被逐漸抑制(plt;0.05).此時，LT3的生長速率顯著強于LT1，表現(xiàn)出較強的耐酸性(plt;0.05).進一步降低pH至2.0及以下，4株菌的生長均被完全抑制(pgt;0.05).

圖1 分離菌株在葡萄糖質量濃度為500～900 g/L YPD液體培養(yǎng)基中的生長狀況

圖2 分離菌株在pH為 1.5～6.0的 YPD 液體培養(yǎng)基中的生長狀況

2.3 分離菌產(chǎn)氣性測定

由表1可以看出，4株分離菌都能夠24 h內(nèi)在500 g/L葡萄糖環(huán)境中代謝產(chǎn)氣，表現(xiàn)出較快的糖代謝速率.菌株LT3和LT4 是分離菌株中產(chǎn)氣速度最快的酵母，24 h內(nèi)代謝生成超過杜氏管2/3總體積的氣體量.當葡萄糖濃度進一步提高至800 g/L時,菌株LT1和LT2的糖代謝被完全抑制，培養(yǎng)時間內(nèi)無氣體生成；菌株LT3和LT4的代謝由于受到高糖脅迫，產(chǎn)氣速率有所減緩，48 h 內(nèi)代謝生成超過杜氏管2/3總體積的氣體量,表現(xiàn)出較強的耐糖性(如表2所示).

可以看出，菌株LT3和LT4具有較強的耐糖、耐酸及產(chǎn)氣性，潛在污染能力較強，危害較大.這兩株菌后續(xù)經(jīng)分子鑒定為魯氏接合酵母(Zygosaccharomycesrouxii).前人研究結果表明：魯氏接合酵母是一種重要的腐敗酵母，具有耐酸、耐弱酸防腐劑、耐高濃度糖并能夠適應高濃度糖、代謝己糖生成 CO2的生理特性，是糖漿、蜂蜜及濃縮果汁等高糖食品及飲料的重要污染源[12,13].筆者也曾在濃縮蘋果汁(可溶性固形物含量70 ° Brix;pH 3.5)中分離出魯氏接合酵母，并證實其能夠在濃縮蘋果汁中生長[10].本文研究結果表明菌株LT3和LT4具有較強的耐糖、耐酸及產(chǎn)氣性，與前人研究結果一致.

表1 分離菌株在50%(w/v)葡萄糖中產(chǎn)氣結果

注： “+”表示產(chǎn)氣量不超過杜氏管總體積1/3；“++”表示產(chǎn)氣量介于杜氏管總體積1/3～2/3之間；“+++”表示產(chǎn)氣量超過杜氏管總體積2/3.

表2 分離菌株在80%(w/v)葡萄糖中產(chǎn)氣結果

注： “-”表示無氣體生成；“+”表示產(chǎn)氣量不超過杜氏管總體積1/3；“++”表示產(chǎn)氣量介于杜氏管總體積1/3～2/3之間；“+++”表示產(chǎn)氣量超過杜氏管總體積2/3.

2.4 菌落形態(tài)及細胞形態(tài)觀察

4株分離菌在YPD平板上培養(yǎng)5 d后其菌落形態(tài)均為白色或乳白色的圓形菌落.菌落表面光滑，濕潤，邊緣整齊，中心突起(如圖3所示).顯微鏡下觀察菌株細胞均為橢圓形，出芽生殖(如圖4所示).

(a)LT1 (b)LT2

(c)LT3 (d)LT4

(a)LT1 (b)LT2

(c)LT3 (d)LT4

2.5 分子鑒定及系統(tǒng)進化樹分析

采用BLAST工具對分離株與GenBank數(shù)據(jù)庫中菌株的26S rDNA序列進行比對，并通過NJ(Neighbour-joining)法構建系統(tǒng)進化樹，確定了分離菌株的系統(tǒng)發(fā)育地位.BLAST結果表明：菌株 LT1、LT2與釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)的親緣關系最近，同源率分別為99.56%和99.85%；菌株LT3、LT4與魯氏接合酵母(Z.rouxii)的親緣關系最近，同源率分別為99.48%和99.82%(如表3所示).系統(tǒng)發(fā)育樹結果表明：菌株LT1、LT2與釀酒酵母(S.cerevisiae)聚成一類，表現(xiàn)出相同的系統(tǒng)發(fā)育地位；菌株LT3、LT4與魯氏接合酵母(Z.rouxii)具有相同的系統(tǒng)發(fā)育地位(如圖5所示).結合序列比對和系統(tǒng)發(fā)育樹分析結果，確定菌株LT1和LT2是釀酒酵母(S.cerevisiae)，菌株LT3和LT4是魯氏接合酵母(Z.rouxii).

分離得到的2株釀酒酵母(S.cerevisiae)與其余2株魯氏接合酵母(Z.rouxii)相比不僅耐糖性較差，而且后續(xù)研究發(fā)現(xiàn)其無法在濃縮海紅果汁中生長.筆者也曾在濃縮蘋果汁中分離出熱帶假絲酵母(Candidatropicalis)并發(fā)現(xiàn)其無法在濃縮蘋果汁中生長[10].推測釀酒酵母(S.cerevisiae)并不是濃縮海紅果汁的固有污染微生物，而是一種偶然性污染微生物(分離操作環(huán)境中的酵母可能污染濃縮汁而被分離出來)，其不能耐受濃縮汁的高滲脅迫，因而不會引起濃縮汁腐敗變質.

表3 分離菌株與Genbank參考菌株的比對結果

圖5 分離菌株26S r DNA序列系統(tǒng)發(fā)育樹

2.6 分離株在濃縮海紅果汁中生長情況

在28 ℃條件下，菌株LT1和LT2不能在濃縮海紅果汁中生長，而菌株LT3和LT4能夠生長.應用DMfit軟件分別對菌株LT3和LT4在濃縮海紅果汁中的生長曲線進行擬合，得到的生長曲線如圖6所示.可以看出，擬合曲線基本反映了微生物生長趨勢，先是遲滯期，然后進入對數(shù)期(曲線斜率增大)，而后進入穩(wěn)定期(斜率平穩(wěn)).DMfit軟件同時計算出了菌株LT3和LT4生長模型的幾個參數(shù)：潛在最大生長速率(μm)、遲滯期(λ)、擬合曲線相關系數(shù)(R2)和標準誤(SE)，如表4所示.由表4可以看出，菌株LT3和LT4在濃縮海紅果汁中的生長情況比較相似，μm與λ值都比較接近.其擬合曲線的R2都在0.99以上，標準誤在0.14～0.16之間，說明兩株菌的實驗值與模型預測值擬合較好.

表4 28 ℃條件下分離菌株在濃縮海紅果汁中的生長動力學參數(shù)及統(tǒng)計分析

(a) LT3

(b) LT4

目前國內(nèi)外關于濃縮果汁中微生物污染的研究主要集中于嗜酸耐熱菌(脂環(huán)酸芽孢桿菌)，涉及高滲酵母的研究較少[14,15].一般來說，酵母對高溫比較敏感，傳統(tǒng)的巴氏殺菌技術很容易將其滅活，但濃縮果汁中高濃度糖類物質等成分能夠顯著增強酵母細胞的高溫耐受性，對滅菌溫度和時間提出較為苛刻的要求，考慮到濃縮汁工業(yè)化生產(chǎn)實際及殺菌成本經(jīng)濟性需要，生產(chǎn)企業(yè)很難滿足上述要求，因而濃縮汁生產(chǎn)中高滲酵母的污染控制可能并不徹底[5,16].同時，由于生產(chǎn)設備的某些死角滅菌不徹底，濃縮汁灌裝時與生產(chǎn)車間空氣接觸以及包裝材料的衛(wèi)生指標較差等因素也會導致高滲酵母污染濃縮汁.目前濃縮汁的終產(chǎn)品一般都采用無菌袋包裝，包裝袋內(nèi)存在一定濃度的氧氣，貯存和運輸溫度為常溫，而常溫及有氧條件都有利于高滲酵母的繁殖和生長，從而引起濃縮汁腐敗變質.

3 結論

對陜西府谷縣聚金邦農(nóng)產(chǎn)品開發(fā)公司生產(chǎn)的濃縮海紅果汁中高滲酵母進行了分離鑒定，得到4株高滲酵母，其中2株為釀酒酵母(S.cerevisiae)，2株為魯氏接合酵母(Z.rouxii).魯氏接合酵母具有較強耐糖、耐酸及產(chǎn)氣性，能夠對濃縮海紅果汁質量造成威脅，需加強控制.

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【責任編輯：蔣亞儒】

Characterizationofosmotolerantyeastinmalusmicromalusmakinojuiceconcentratefromshaanxiprovince

WANG Hu-xuan, LIU Ting, MA Yuan, LIN Ze-xue, LIU Ning, YANG Hui*

(School of Food and Biological Engineering, Shaanxi University of Science amp; Technology, Xi′an 710021, China)

In order to identify osmotolerant yeasts which are capable of causing spoilage for malus micromalus makino juice concentrate,the yeasts in malus micromalus makino juice concentrate collected from malus micromalus makino juice processing plants in Shaanxi province were isolated and purified by using YPD media containing high sugar content.The sugar-tolerance,acid-tolerance,and gas-production capability of each yeast isolate were assayed to evaluate the contamination potential.The colony and cell morphology were characterized and the phylogenetic tree based on 26S rDNA sequence analysis was constructed to determine the genetic location of isolates.A total of 4 yeast stains were isolated from concentrated juice,two of which were identified as strain ofSaccharomycescerevisiae,and all the other isolates belonged toZygosaccharomycesrouxii.All the isolated strains ofZ.rouxiidisplayed better sugar-tolerance,acid-tolerance,and gas-production capability than those isolates ofS.cerevisiae,and they were capable of growing in malus micromalus makino juice concentrate.The results suggested that strains ofZ.rouxiimight pose a threat to the quality of malus micromalus makino juice concentrate,and needed to be controlled in the production line.

malus micromalus makino juice concentrate; osmotolerant yeasts; contamination potential; isolation and identification;Zygosaccharomycesrouxii

2017-09-04

國家自然科學基金項目(31501443)； 陜西省大學生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓練計劃項目(1337)； 陜西科技大學博士科研啟動基金項目(2016BJ-39)

王虎玄(1986-)，男，陜西韓城人，講師，博士，研究方向：食品腐敗微生物檢測與控制

楊 輝(1960-)，男，陜西西安人，教授，博士生導師，研究方向：發(fā)酵工程和生物材料，yangh@sust.edu.cn

2096-398X(2017)06-00114-06

S182

A