嗜水氣單胞菌外膜蛋白原核表達及其免疫保護性研究

劉 望， 楊佳杰， 楊 靜， 薛 茜， 張 苗， 劉 歡

(陜西科技大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院， 陜西 西安 710021)

嗜水氣單胞菌外膜蛋白原核表達及其免疫保護性研究

劉 望， 楊佳杰， 楊 靜， 薛 茜， 張 苗， 劉 歡*

(陜西科技大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院， 陜西 西安 710021)

嗜水氣單胞菌是我國水產(chǎn)養(yǎng)殖魚類重要病原菌，抗生素防治易產(chǎn)生耐藥性等問題，亟需開發(fā)新型防治手段.外膜蛋白OmpA和OmpTS是嗜水氣單胞菌主要的免疫原蛋白，為了得到免疫效果更佳的亞單位疫苗，利用大腸桿菌將OmpA和OmpTS進行融合表達，并對表達產(chǎn)物進行純化，檢測其對斑馬魚的免疫保護效果.結(jié)果表明：成功擴增獲得大小分別為1 032 bp和1 068 bp的OmpA和OmpTS基因序列，隨后進行Overlap PCR，得到大小為2 100 bp的融合片段OmpA-OmpTS.成功構(gòu)建重組表達質(zhì)粒 pET28a-OmpA-OmpTS，將其轉(zhuǎn)入BL21 ( DE3)，重組蛋白的表達條件為：菌體培養(yǎng)2 h后添加IPTG 1 mM,16 ℃下培養(yǎng)16 h.經(jīng)純化后得到重組蛋白OmpA-OmpTS; 最后將OmpA-OmpTS蛋白與弗氏不完全佐劑(FIA) 混合免疫斑馬魚，免疫保護率可達82.1%,表明該融合蛋白可作為候選亞單位疫苗進行進一步的開發(fā).

嗜水氣單胞菌; 外膜蛋白; 原核表達; 免疫保護性

0 引言

嗜水氣單胞菌(Aeromonashydrophila)是一種條件致病菌，主要存在于海水、淡水、河流、湖泊等水環(huán)境以及污泥、土壤、人類糞便中，是我國水產(chǎn)養(yǎng)殖魚類爆發(fā)性傳染病的主要病原[1]，可以感染草魚、鯉魚、鯽魚以及羅非魚等多種水產(chǎn)養(yǎng)殖魚類，此外，嗜水氣單胞菌還可以感染人和動物等[2]，能引發(fā)人類的中耳炎、敗血癥及創(chuàng)傷面感染、腹膜炎以及急性腸胃炎等疾病[3，4].

近年來，世界各地均陸續(xù)報道從食品、醫(yī)療用品以及急性胃腸炎患者糞便中檢測出嗜水氣單胞菌[5,6]，在國外，嗜水氣單胞菌已經(jīng)被列入食品衛(wèi)生檢驗的對象和醫(yī)院腹痛腹瀉病原菌檢測的一項內(nèi)容.因此，嗜水氣單胞菌相關(guān)疾病的爆發(fā)不僅給水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)造成巨大損失，還直接對人類健康造成了威脅，受到水產(chǎn)、獸醫(yī)學(xué)界的重視[7].

目前，防治該病的主要方法仍是使用抗生素，但是隨著抗生素的反復(fù)使用，細菌產(chǎn)生耐藥性，抗菌治療的效果不明顯，導(dǎo)致患病魚的平均死亡率達40%～50%，給水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)造成了嚴重的經(jīng)濟損失.因此，尋找免疫保護性抗原是預(yù)防該病暴發(fā)的重要手段.

國內(nèi)外學(xué)者已對嗜水氣單胞菌進行了系統(tǒng)研究，發(fā)現(xiàn)嗜水氣單胞菌可產(chǎn)生多種毒力因子，得到認可的毒力因子包括外毒素、胞外蛋白酶、脂多糖、外膜蛋白等.外膜蛋白(Outer membrane proteins，Omps)是存在于細菌外膜中所有蛋白的總稱，在維持外膜結(jié)構(gòu)、保證物質(zhì)運輸?shù)确矫嬗兄匾饔肹8].同時，由于其位于細胞的最外面而在細菌適應(yīng)環(huán)境變化及致病性過程中亦扮演著重要角色.當(dāng)細菌進入一個新的環(huán)境時，其外膜蛋白的合成會跟著變化[9].有許多研究結(jié)果表明，細菌的主要外膜蛋白的免疫原性很強，是重要的保護性抗原，利用致病菌的 OMP 做免疫原還可使魚產(chǎn)生對不同血清型菌株感染的交叉保護力[10-12].

本研究選取嗜水氣單胞菌外膜蛋白ompA 基因和ompTS 基因在大腸桿菌中進行融合共表達，分離和純化，并與弗氏不完全佐劑(Freud′s incomplete adjuvant,FIA) 結(jié)合，考察其對斑馬魚的免疫保護效果，旨在為研制嗜水氣單胞菌基因工程奠定基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株與質(zhì)粒

大腸桿菌DH5α、BL21(DE3)、嗜水氣單胞菌LS01、表達質(zhì)粒pET28a均由本實驗時保存.pMD19T購自TaKaRa公司.

1.1.2 主要試劑和儀器

(1)主要試劑：LB培養(yǎng)基，購自上海生工生物工程有限公司；Taq DNA聚合酶、Pfu高保真聚合酶、蛋白質(zhì)分子標準量Marker、DNA分子標準量Marker、DNA回收試劑盒及質(zhì)粒抽提試劑盒，購自北京天根生化科技有限公司；T4DNA連接酶及限制性內(nèi)切酶，購自TaKaRa公司.

(2)主要儀器：恒溫培養(yǎng)箱，LRH-250,上海一恒科學(xué)儀器有限公司；搖床,THZ-C-1,太倉市儀器設(shè)備廠；PCR儀,MyCycler thermal cycler;核酸電泳儀,power PacTMHC,伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品有限公司；凝膠成像系統(tǒng),FR980,上海復(fù)日科技有限公司.

1.1.3 引物

表1為本研究中使用的引物，參照GenBank上公布的基因序列設(shè)計，由上海捷瑞生物工程有限公司合成.下劃線為限制性內(nèi)切酶識別位點.

表1 實驗中所使用的引物

1.2 方法

1.2.1 ompA和ompTS基因的克隆及ompA-ompTS融合基因的構(gòu)建

將-80 ℃保存的嗜水氣單胞菌接種于LB液體培養(yǎng)基，30 ℃ 恒溫培養(yǎng)24 h，取1 mL 培養(yǎng)菌液按照天根細菌DNA提取試劑盒提取基因組DNA,以其為模板，分別利用引物對AF/AR和TSF/TSR進行基因擴增，分別克隆獲得ompA和ompTS基因.PCR反應(yīng)體系為 50μL: 2×Taq Master Mix 25μL，DNA 模板 3μL，上下游引物各3μL，補加 dd H2O 至 50μL.反應(yīng)條件:94 ℃ 預(yù)變性4 min，94 ℃ 50 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，共30 個循環(huán)，最后 72 ℃延伸 7 min.反應(yīng)產(chǎn)物以1% 瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像系統(tǒng)檢測擴增結(jié)果.隨后以回收到的ompA和ompTS基因序列為模板，以引物對AF/TSR進行Overlap PCR，反應(yīng)條件除延伸時間增加至2 min 鐘外，其他條件同上.產(chǎn)物檢驗后割膠回收并用試劑盒純化，最后以物質(zhì)的量之比3∶1(插入片段/載體) 的比例克隆入pMD19-T 載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，在含氨芐青霉素( 100μg/mL) 的LB 平板上挑取含有重組質(zhì)粒pMD19T-ompA-ompTS的陽性克隆，利用T載體通用引物M13進行菌落 PCR鑒定后進行基因測序.

1.2.2 重組表達質(zhì)粒pET28a-ompA-ompTS的構(gòu)建

分別對重組質(zhì)粒pMD19T-ompA-ompTS和表達質(zhì)粒pET28a進行質(zhì)粒提取，并根據(jù)引物中設(shè)計的酶切位點，分別利用SalI和XhoI對所抽提的質(zhì)粒進行雙酶切消化，瓊脂糖凝膠電泳分析并將酶切后的融合基因ompA-ompTS與表達質(zhì)粒pET28a進行連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21( DE3)，在含卡那霉素( 100μg/mL) 的LB 平板上挑取含有重組質(zhì)粒pET28a-ompA-ompTS的陽性克隆，利用pET系列載體T7通用引物進行菌落 PCR鑒定后進行基因測序.

1.2.3 重組表達載體pET28a-ompA-ompTS在大腸桿菌中的表達和純化

將構(gòu)建好的含有重組表達質(zhì)粒pET28a-ompA-ompTS的大腸桿菌BL21置于添加卡那霉素的LB培養(yǎng)基中過夜活化培養(yǎng).次日按照體積比1∶100 加入到 1 mL同樣的培養(yǎng)液中，37 ℃振蕩培養(yǎng).當(dāng)菌種OD600達到0.6～0.8時，加入IPTG，不同溫度下進行誘導(dǎo)表達，隨后收集菌體進行SDS-PAGE分析.將誘導(dǎo)表達后以包涵體形式存在的融合蛋白進行超聲破碎，沉淀用含2 mol/L尿素的包涵體洗滌液洗滌，洗滌后離心倒去上清，重復(fù)3次；再用含6 mol/L鹽酸胍緩沖液溶解重組蛋白，將溶解后的溶液用0.45μm孔徑的濾膜過濾，過濾后的溶液經(jīng) Ni柱親和純化，純化的蛋白于4 ℃進行梯度尿素復(fù)性透析至PBS，復(fù)性產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE進行檢測.

1.2.4 重組融合蛋白與弗氏不完全佐劑混合乳化

將純化后的OmpA-OmpTS融合蛋白用PBS重懸，將其濃度調(diào)整至2 mg/mL，然后與弗氏不完全佐劑FIA按照1∶1的比例混合，在10 mL無菌注射器中進行乳化.乳化時先用移液器乳化5 min，然后用注射器反復(fù)推進，直至水相與油相完全融到一起，形成油包水的乳白色液滴.取一滴滴入水中，如果液滴不擴散則說明乳化完全，若擴散則需繼續(xù)乳化.將乳化好的樣品放4 ℃冰箱保存?zhèn)溆?

1.2.5 免疫

將健康斑馬魚隨機分成4 組，其中2個組為免疫組(OmpA-OmpTS+FIA、OmpA-OmpTS)，2個組為對照組 (FIA、PBS)，每組20條，平行設(shè)置3組.亞單位疫苗OmpA-OmpTS免疫劑量為 2μg/g 魚，與佐劑按照 1∶1 進行混合，每尾魚背部肌肉注射配比好的佐劑疫苗，對照組注射等量的FIA或PBS.2 周后免疫組用等量的亞單位疫苗加強免疫一次(不包含佐劑).

1.2.6 攻毒試驗

將嗜水氣單胞菌LS01菌株接種于新鮮培養(yǎng)基中，于30 ℃過夜培養(yǎng).以 7.5×107CFU/mL為攻毒濃度，每尾背部肌肉注射0.2 mL，攻毒后連續(xù)觀察7 d，記錄死亡情況.以相對保護率表示免疫效果: 相對保護率(RPS) = [1-( 免疫組死亡率/對照組死亡率)]×100% .

2 結(jié)果與討論

2.1 ompA和ompTS基因的克隆與鑒定

以嗜水氣單胞菌LS01基因組DNA為模板，用設(shè)計的引物對AF/AR和TSF/TSR分別進行PCR擴增，通過凝膠電泳分析發(fā)現(xiàn)，成功獲得大小分別為1 032 bp和1 068 bp的ompA和ompTS基因片段(如圖1所示).PCR產(chǎn)物純化后構(gòu)建T-A克隆進行測序，在 NCBI上進行序列比對分析，確定二者分別為嗜水氣單胞菌OmpA和OmpTS蛋白編碼基因的開放閱讀框編碼序列區(qū)，其編碼的蛋白質(zhì)分別包含345個和356個氨基酸殘基.

圖1 ompA和ompTS基因克隆PCR電泳圖

2.2 序列同源性分析

新鮮的黃牛肉呈棕色或暗紅，剖面有光澤，結(jié)締組織為白色，脂肪為黃色，肌肉間無脂肪雜質(zhì)；新鮮的綿羊肉，肉質(zhì)較堅實，顏色紅潤，纖維組織較細，略有些脂肪夾雜其間，膻味較重；新鮮的山羊肉，肉色比綿羊的肉質(zhì)厚、略白，皮下脂肪和肌肉間脂肪少，膻味較輕。

在對OmpA和OmpTS蛋白編碼基因進行測序后，將兩個基因編碼的氨基酸序列分別與NCBI數(shù)據(jù)庫中已登錄的嗜水氣單胞菌及其他氣單胞菌屬氨基酸序列進行比對分析:結(jié)果發(fā)現(xiàn)嗜水氣單胞菌LS01的OmpA基因和OmpTS基因編碼的蛋白與嗜水氣單胞菌ATCC7966外膜蛋白OmpA和OmpTS的同源性為99% ，表明嗜水氣單胞菌OmpA和OmpTS高度保守.同時，OmpTS與其他氣單胞菌屬(溫和氣單胞菌，豚鼠氣單胞菌)中的OmpTS亦具有較高的保守性，同源度均達到82%以上.而OmpA與其它氣單胞菌屬中的OmpTS氨基酸組成的同源性亦可達到65%以上(如圖2、圖3所示).可見，OmpA和OmpTS不止在嗜水氣單胞菌中具有較高的保守性，且在氣單胞菌屬中亦具有較高的保守性，因此，以這兩種蛋白構(gòu)建的亞單位疫苗可能對多種氣單胞菌屬的病原菌實現(xiàn)多效價的免疫保護作用.

圖2 OmpA氨基酸序列同源性比對分析

圖3 OmpTS氨基酸序列同源性比對分析

2.3 融合基因ompA-ompTS的克隆

在成功克隆得到了嗜水氣單胞菌LS01中外膜蛋白OmpA和OmpTS編碼基因后，進一步地，通過Overlap PCR將OmpA和OmpTS編碼基因進行融合連接.結(jié)果顯示，以O(shè)mpA和OmpTS編碼基因為模板，利用引物對AF/TSR成功擴增得到大小為2 100 bp的特異性DNA片段(如圖4所示)，對產(chǎn)物進行回收和測序后證實其為融合基因ompA-ompTS.

圖4 ompA-ompTS融合基因 Overlap PCR電泳圖

2.4 重組表達質(zhì)粒pET28a-OmpA-OmpTS的構(gòu)建及鑒定

克隆得到融合基因ompA-ompTS后，通過限制性內(nèi)切酶消化后與表達質(zhì)粒pET28a進行重組連接，并轉(zhuǎn)化至宿主大腸桿菌BL21(DE3)中，于含有卡那霉素的抗性平板上培養(yǎng)，挑選克隆子，并利用pET28a表達載體通用引物進行菌落PCR驗證，結(jié)果如圖5所示.可以看到，挑選的7個克隆中有6個擴增得到大小為2 300 bp左右(即融合片段與通用引物在表達載體自身克隆片段之和)的特異性片段，即為陽性克隆，對其進行保種并進行測序分析，測序結(jié)果顯示陽性克隆株中含有成功連接了融合片段ompA-ompT的重組表達質(zhì)粒.

2.5 OmpA-OmpTS融合蛋白誘導(dǎo)表達分析

將pET28a-OmpA-OmpTS質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21( DE3) 得到 BL21/pET28a-OmpA-OmpTS重組菌，隨后對其重組蛋白的表達條件進行了優(yōu)化.結(jié)果發(fā)現(xiàn)重組表達菌株在培養(yǎng)2 h后添加IPTG 1 mM,16 ℃下培養(yǎng)16 h經(jīng)誘導(dǎo)后，與未經(jīng)誘導(dǎo)重組菌全蛋白電泳條帶相比，在相對分子質(zhì)量約80 kDa 處有一條表達量較高的蛋白條帶，大小與OmpA-OmpTS融合蛋白相符，說明OmpA-OmpTS融合蛋白成功表達(如圖6所示).

MW：蛋白質(zhì)分子量標準；1：IPTG誘導(dǎo)后的pET28a/BL21；2：誘導(dǎo)16 h后的pET28a-ompA-ompTS/BL21；3：誘導(dǎo)前的 pET28a-ompA-ompTS/BL21 重組質(zhì)粒

為了進行后續(xù)的免疫保護效果的測定，首先需要對重組表達蛋白進行分離純化.將誘導(dǎo)表達后以包涵體形式存在的融合蛋白進行超聲破碎，沉淀經(jīng)洗滌后用鹽酸胍緩沖液溶解重組蛋白，經(jīng) Ni柱親和純化的蛋白進行梯度尿素復(fù)性，隨后SDS-PAGE 進行檢測.結(jié)果顯示，純化后可獲得大小約為80 kDa的目的蛋白(如圖7所示).

圖7 OmpA-OmpTS融合蛋白的純化

2.7 融合蛋白OmpA-OmpTS免疫保護性分析

圖8 嗜水氣單胞菌攻毒斑馬魚累計死亡率

在利用純化后的融合蛋白OmpA-OmpTS、混合FIA佐劑的融合蛋白以及對照分別對斑馬魚進行免疫后，用嗜水氣單胞菌LS01進行魚體攻毒實驗.試驗魚攻毒后第1天便出現(xiàn)死亡，第2天開始，F(xiàn)IA和PBS對照組出現(xiàn)大量死亡的情況，而免疫組OmpA-OmpTS及OmpA-OmpTS+FIA組斑馬魚的死亡情況則明顯減少(如圖8所示) .PBS、FIA、OmpA-OmpTS和OmpA-OmpTS+FIA組連續(xù)觀察7 d的累計死亡率分別為100%、93.33%、31.7%和16.7%.OmpA-OmpTS和OmpA-OmpTS+FIA組對于斑馬魚在抵抗嗜水氣單胞菌攻毒時的相對保護率分別為68.3%和82.1%.可見，經(jīng)融合蛋白OmpA-OmpTS免疫后的斑馬魚可以較好地抵制嗜水氣單胞菌的侵染，具有較好的免疫保護效果.

3 結(jié)論

嗜水氣單胞菌是水產(chǎn)養(yǎng)殖，尤其是淡水魚類一種重要的條件致病菌，每年因其感染所引起的病害給我國水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失.傳統(tǒng)的抗生素防治手段因易造成耐藥性和藥物殘留等問題已被國家禁止在水產(chǎn)養(yǎng)殖過程中使用. 疫苗由于具有較好的免疫活性和環(huán)境友好等優(yōu)點已成為目前病害防治領(lǐng)域研究的熱點.很多研究表明,外膜蛋白具有良好的免疫原性,是研制基因工程疫苗的良好材料[13-15].

本研究選取pET28a作為表達載體，將通過Overlap PCR進行融合的兩個外膜蛋白OmpA和OmpTS進行重組表達.成功獲得可高效表達融合蛋白的重組表達質(zhì)粒，通過對融合蛋白分離和純化后獲得融合蛋白OmpA-OmpTS，并對其進行斑馬魚免疫保護性實驗，結(jié)果發(fā)現(xiàn)該融合蛋白OmpA-OmpTS在不添加佐劑時對斑馬魚的免疫保護率達到68.3%，與FIA佐劑混合后免疫保護率可達82.1%，可較好地抵御嗜水氣單胞菌病害的發(fā)生.

本研究為嗜水氣單胞菌亞單位疫苗的設(shè)計與開發(fā)奠定了一定的理論基礎(chǔ).但鑒于嗜水氣單胞菌不同分離菌株間的毒力和致病性差異較大，該融合蛋白對斑馬魚的免疫保護效果只進行了針對LS01菌株攻毒的檢測，而對于其它嗜水氣單胞菌菌株的保護效果則需進一步的實驗分析.同時，本研究只進行了兩個外膜蛋白的融合表達，后續(xù)可進一步地篩選嗜水氣單胞菌其它具有較高免疫原性的蛋白進行亞單位疫苗的構(gòu)建，以期得到免疫效果更佳優(yōu)良的疫苗.

[1] Vivas J,Carracedo B,Riano J,et al.Behavior of allAeromonashydrophilaaroA live vaccine in water microcosms[J].Appl Environ Microbiol,2004,70：2 702-2 708.

[2] 李文艷.嗜水氣單胞菌相關(guān)毒力基因的研究進展[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué),2001,39(9)：5 060-5 064.

[3] 江金倫.一起由嗜水氣單胞菌引起腹瀉的調(diào)查[J].上海預(yù)防醫(yī)學(xué),2010,22(1)：31-32.

[4] 黃 艷,韋小瑜,吳成梅,等.一起嗜水氣單胞菌引起的食物中毒調(diào)查[J].中國食品衛(wèi)生雜志,2012,24(4)：391-393.

[5] 馬群飛,陳偉偉,楊毓環(huán).瓶裝天然礦泉水嗜水氣單胞菌污染情況調(diào)查[J].中國食品衛(wèi)生雜志,2002,14(1)：43-44.

[6] 崔樹玉,溫憲芹,趙克義,等.醫(yī)療用品中檢出致病性嗜水氣單胞菌的研究報告[J].中國衛(wèi)生檢驗雜志,2005,15(8)：923-924.

[7] Fang H M,Ge H,Sin Y M.Cloning characterization and expression ofAeromonashydrophilamajor adhesion[J].Fish Shellfish immun，2004,16：645-655.

[8] Liu J,Huang S X,Zhang Q J.Outer membrane proteins:key players for bacterial adaptation in host niches [J].Microb Infect,2002,4(3):325-331.

[9] Provenzano D,Lauriano C M,Klose K E.Characterization of the role of the ToxR-modulated outer membrane porins OmpU and OmpT in Vibrio cholerae virulence[J].J Bacteriol,2001,183(12):3 652-3 662.

[10] 周 宇,周秋白.嗜水氣單胞菌防控技術(shù)研究進展[J].生物災(zāi)害科學(xué),2012,35(2):126-133.

[11] 張 波,曾令兵,羅曉松,等.嗜水氣單胞菌 3 種疫苗免疫的青魚外周血免疫指標的變化[J].華中農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報,2012,31(1):100-105.

[12] Rahman M H,Kawai K.Outer membrane proteins ofAeromonashydrophilainduce protective immunity in goldfish [J].Fish Shellfish Immunol,2000,10(4):379-382.

[13] 鄭宗林,鄭曙明,Delbert M G,等.嗜水氣單胞菌外膜蛋白ompA 基因的原核表達及免疫保護性研究[J].淡水漁業(yè),2015,45(5):3-10,28.

[14] 趙金平,段麗華,郭松林.鰻鱺病原菌外膜蛋白三聯(lián)表達載體的構(gòu)建、表達與表達產(chǎn)物的純化[J].華中農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報,2015,34(3):104-110.

[15] 劉 瑋,倪 穗,邱軍強,等.嗜水氣單胞菌BYKAH2008AC株外膜蛋白和溶血素雙基因的融合表達及免疫原性分析[J].生物學(xué)雜志,2012,29(4):17-21.

【責(zé)任編輯：陳佳】

TheprokaryoticexpressionandimmunoprotectionanalysisofoutermembraneproteinsofAeromonashydrophila

LIU Wang, YANG Jia-jie, YANG Jing, XUE Qian, ZHANG Miao, LIU Huan*

(School of Food and Biological Engineering, Shaanxi University of Science amp; Technology, Xi′an 710021, China)

Aeromonashydrophilais one of the important fish pathogen in China,and antibiotics treatment for this disease can cause the drug-resistance. Therefore,it′s an urgent need for developing new prevention methods now.In order to obtain the subunit vaccine with better immunoprotective effect,the two outer membrane proteins,OmpA and OmpTS were fusion expressed inEscherchiacoliand the products were purified and its protective efficiency on the zebra fish againstAeromonashydrophilawere tested.The results showed that the ompA (1 032 bp) and ompTS (1 068 bp) genes were successfully cloned and the fusion fragment,OmpA-OmpTS (2 100 bp),was obtained by overlap PCR.Then the recombinant expression plasmid,pET28a-OmpA-OmpTS,was constructed and introduced into the host strain,escherichia coli BL21 (DE3).The conditions for fusion protein expression were that with the addition of 1 mM IPTG after 2 h of the strain growth at 16 ℃ for 16 h.The recombinant protein,OmpA-OmpTS was purified and mixed with the adjuvant (FIA) to be injected to the zebra fish to test its protection effect againstAeromonashydrophila.The immunoprotectivity reached 87.5%,indicating that this fusion protein can be a candidate vaccine for further development.

Aeromonashydrophila; outer membrane protein; prokaryotic expression; immunoprotection

2017-08-10

國家自然科學(xué)基金項目(31301059)； 陜西省科技廳自然科學(xué)基礎(chǔ)研究計劃面上項目(2017JM3010)； 陜西省科技廳自然科學(xué)基礎(chǔ)研究計劃青年項目(2013JQ3011)； 陜西省大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計劃項目(1326); 陜西科技大學(xué)博士科研啟動基金項目(BJ12-24)

劉 望(1991-)，男，陜西西安人，在讀碩士研究生，研究方向：食源性病原微生物

劉 歡(1983-)，女，陜西西安人，講師，博士，研究方向：食源性病原微生物，liuhuan@sust.edu.cn

2096-398X(2017)06-0125-06

S917.1

A