腎單位腎癆的臨床和分子遺傳學研究進展

周建華

·述評·

腎單位腎癆的臨床和分子遺傳學研究進展

周建華

腎單位腎癆(nephronophthisis，NPHP)是一種常染色體隱性遺傳的囊性腎臟病，1951年由Hildebrandt等[1]首次報道。該病主要在兒童期發(fā)病，臨床癥狀多無特異性，常常表現(xiàn)為多飲多尿、貧血、腎衰竭等，尿檢基本正?；蛘咻p微異常，多數(shù)發(fā)展到終末期腎??；超聲檢查可見腎臟皮髓質(zhì)交界區(qū)囊腫，腎臟正常大小或縮小，腎臟實質(zhì)回聲增強，皮髓質(zhì)分界不清。由于腎衰竭前往往無明顯臨床表現(xiàn)，早期難以及時確診，很多患者就診時就已有慢性腎衰竭了。NPHP其實并非特別罕見，國外研究資料表明，NPHP 約占兒童慢性腎衰竭的10%，是導致兒童期慢性腎衰竭最常見的遺傳性疾病[1-2]。

根據(jù)NPHP患者出現(xiàn)腎衰竭的年齡，NPHP可以分為嬰兒型NPHP(即在嬰幼兒時就發(fā)生腎衰竭)、少年型NPHP(在學齡期出現(xiàn)腎衰間竭)、青年型NPHP(在青春期及以后出現(xiàn)終末期腎病)，3者中以少年型NPHP最多見[1-3]。近年來國際上在NPHP的分子遺傳學研究上取得很多重要進展，已經(jīng)明確20多種導致NPHP的致病基因，并按照發(fā)現(xiàn)先后順序分別命名為NPHP1～NPHP20，為NPHP分子診斷提供了依據(jù)，使得早期診斷NPHP、特別是散發(fā)的NPHP患者成為可能，贏得早期干預的時機[1-2,4]。國內(nèi)目前對此病尚在逐步認識中，本文重點介紹近年來有關(guān)NPHP分子遺傳學和臨床診治方面的研究進展。

一、NPHP1與連接/黏著斑缺陷假說

1997年德國和法國的兩組科學家?guī)缀跬瑫r宣布發(fā)現(xiàn)少年型NPHP的第一個致病基因即NPHP1[1-4]。NPHP1基因的發(fā)現(xiàn)開啟了NPHP基因診斷新時代，揭開了NPHP神秘面紗的序幕。NPHP1基因位于2q12，編碼nephrocystin1蛋白，最初發(fā)現(xiàn)該蛋白位于腎小管上皮細胞之間和細胞與小管基底膜間的連接處，與同位該處的p130Cas、FAK2(focal adhesion kinase 2)、tensin 和filamin A、filamin B等相互作用。nephrocystin1蛋白有一個SH3結(jié)構(gòu)域，可以與細胞-細胞和細胞-基質(zhì)連接處含同樣結(jié)構(gòu)域的蛋白如p130Cas作用，故推測NPHP1基因突變破壞了腎小管上皮細胞間及細胞與基底膜間的連接，導致本病發(fā)生，此即所謂的“連接/黏著斑缺陷假說”(adherens junction/focal adehesion hypothesis)[1-2,5]。

通過酵母人工染色體重疊區(qū)中克隆該區(qū)，弄清楚了該區(qū)域的基因組結(jié)構(gòu)。有了顯示低拷貝重復序列的存在，并且觀察到大多數(shù)患者NPHP1基因的突變多為一大片段的缺失，缺失片段約250 kb。因此，采用橫跨NPHP1基因缺失區(qū)和非缺失區(qū)的STS標記，可以檢測出基因缺失從而診斷該病。我們也曾經(jīng)通過采用PCR擴增NPHP1基因區(qū)位的6個STS標記(9657T、wi18516、146C2S、804/6、del2、del16)，發(fā)現(xiàn)NPHP1基因缺失的患兒。此外，我們還發(fā)現(xiàn)NPHP1復合雜合點突變，且NPHP1基因點突變可以與其他遺傳腎臟病基因突變共存，或可起改變臨床表現(xiàn)型的作用[6]。雖然NPHP1基因突變是導致NPHP最多見的，但也僅占20%。

二、NPHP2與纖毛/中心體學說

在發(fā)現(xiàn)NPHP1后不久，Otto等[7]于2003年通過位點克隆和候選基因策略，克隆了第2個導致NPHP的基因，命名為NPHP2。NPHP2基因定位于染色體9q22，編碼蛋白為Inversin，其突變導致嬰兒型NPHP發(fā)生。與青少年型NPHP不同的是，嬰兒型NPHP患兒腎衰竭出現(xiàn)早，一般發(fā)生在4歲前，而且大部分患兒同時合并有全內(nèi)臟轉(zhuǎn)位。NPHP2的發(fā)現(xiàn)以及隨后對Inversin的一系列研究成果改寫了對囊性腎臟疾病成囊機制的認識[1-2,8-10]。

研究發(fā)現(xiàn)NPHP2基因表達產(chǎn)物Inversin定位在腎小管上皮細胞原纖毛上。在上皮細胞間期和有絲分裂不同時期，Inversin在細胞內(nèi)有不同定位，分別位于原纖毛的軸絲、轉(zhuǎn)換區(qū)和細胞的基體、中心體、紡錘體。這些亞細胞結(jié)構(gòu)都與細胞分裂和細胞的平面細胞極性調(diào)節(jié)有關(guān)。平面細胞極性指細胞與相鄰細胞的方向，是維持組織正常結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)。Inversin是Wnt介導的經(jīng)典和非經(jīng)典通路的交叉點。Inversin突變導致它的功能喪失引起非經(jīng)典Wnt信號增強，使平面細胞極性消失，上皮細胞分化的方向出現(xiàn)異常導致小管橫向擴張，形成囊腫。

進一步研究發(fā)現(xiàn)，原來認為是定位于腎小管上皮細胞之間和細胞與小管基底膜間的連接處nephrocystin1，在原纖毛上也有表達，nephrocystin1結(jié)構(gòu)中酸性氨基酸簇中3個關(guān)鍵的絲氨酸被細胞質(zhì)中酪蛋白激酶2磷酸化后，暴露PACS-1(phosphofurin acidic cluster sorting protein 1)的結(jié)合位點，一起共定位于原纖毛的基底部。隨后發(fā)現(xiàn)常染色體顯性多囊腎基因pkd1、pkd2編碼的蛋白polycystin 1、polycystin 2和常染色體隱性多囊腎基因編碼的蛋白PKHD1均定位于原纖毛上，這些蛋白在進化上保守，在斑馬魚和小鼠中也定位于原纖毛，正是由于位于腎小管上皮細胞腔面的原纖毛蛋白突變導致這些遺傳性囊性腎臟疾病的發(fā)生，此即“纖毛/中心體”學說，將這些囊性腎臟病都統(tǒng)一為“纖毛病”[7-11]。

三、原纖毛結(jié)構(gòu)、功能和NPHP相關(guān)纖毛病

纖毛是一種進化上保守的重要的細胞器，在發(fā)育時間和空間上有相對獨立性，人體發(fā)育和很多基本生命活動如聽、看、嗅、呼吸、排泌、生殖等都有賴于正常纖毛功能。纖毛長度因細胞類型或生物個體不同而不同，但直徑相似。按照纖毛功能分為原纖毛和動纖毛，動纖毛則為“9+2”，多出兩個中央微管，原纖毛軸絲中微管結(jié)構(gòu)為“9+0”，其不具有和運動相關(guān)的蛋白結(jié)構(gòu)，缺少中心微管和動力臂與輻條結(jié)構(gòu)[8-10]。

纖毛可以分為三個部分：纖毛膜、軸絲和纖毛基質(zhì)。纖毛膜是細胞膜的延伸，由細胞膜組成，包繞軸絲。纖毛基質(zhì)填充在軸絲和纖維膜之間。軸絲由9排環(huán)形的雙聯(lián)體微管和其附屬的蛋白構(gòu)成，在中心有一對中心微管，軸絲發(fā)自基體，基體是纖毛的基底部，為活動的中心粒， 由9個0.4 μm長的圓筒二聯(lián)體微管構(gòu)成，相鄰的微管由連接絲相連，每個雙連體微管由A和B微管組成，沿著A微管有序排列著外動力臂、內(nèi)動力臂和輻條結(jié)構(gòu)，其參與纖毛的運動。B微管則成“C”型結(jié)構(gòu)，由下而上每隔24 nm A小管向相鄰的B小管伸出1條外動力臂和1條內(nèi)動力臂。2個中心微管間每隔96 nm以連接絲相連，每個中心微管每隔16 nm有2個突起形成中央鞘。二聯(lián)微管和中心微管間由A小管伸向中心微管的輪輻連接,該結(jié)構(gòu)每隔96 nm重復出現(xiàn)。每個完整的A小管和中心微管由13根原纖絲組成，而不完整的B小管則由10～11根原纖絲組成。原纖絲則由α和β微管蛋白盤旋組成每隔8 nm重復的二聚體[1-2,8-10]。

“9+0”結(jié)構(gòu)的原纖毛主要分布在腎小管上皮細胞、膽管上皮細胞、胰管上皮纖毛、骨細胞和軟骨細胞、腦內(nèi)神經(jīng)元細胞以及視網(wǎng)膜感受器細胞表面，感知周圍環(huán)境中的信號變化并協(xié)助信號轉(zhuǎn)導至細胞內(nèi)部從而引起細胞應答。纖毛的感知功能在人體許多組織和器官生理功能的發(fā)揮中扮演著重要角色，與視覺、聽覺、味覺、嗅覺等功能密切相關(guān)。分布于腎小管、胰管、膽管等上皮細胞表面的原纖毛，主要功能是感受管腔中物理和化學刺激，將信號轉(zhuǎn)導至細胞內(nèi)部調(diào)節(jié)細胞功能，并參與細胞周期的調(diào)控。

纖毛的產(chǎn)生是細胞極化的結(jié)果，在細胞分裂間期，中心體的中心?？赊D(zhuǎn)化為基體，在基體的基礎(chǔ)上組裝形成纖毛。IFT蛋白在纖毛形成中起關(guān)鍵作用，20多種IFT蛋白形成IFT-A和IFT-B兩種復合體，IFT復合體沿軸絲微管進行雙向物質(zhì)運輸，包括基底到纖毛頂端的正向運輸和頂端到基底的逆向運輸。在基底部，纖毛蛋白在IFT-B復合體的協(xié)助下，和細胞驅(qū)動蛋白2一起把纖毛蛋白轉(zhuǎn)移到纖毛頂，而IFT-A復合體和細胞質(zhì)的動力蛋白相互結(jié)合進行逆行運輸，進行蛋白回收利用。纖毛的長度可能受感知系統(tǒng)的調(diào)控， 纖毛的感知系統(tǒng)感知纖毛長度信號，轉(zhuǎn)化為蛋白質(zhì)翻譯后磷酸化，纖毛的組裝和解聚是通過磷酸化信號來調(diào)節(jié)的，從而起到調(diào)控其長度的目的。纖毛的組裝、維持和分解的調(diào)控，影響其結(jié)構(gòu)和長度，并對其功能的實現(xiàn)起到不可忽視的重要作用[11-14]。

隨著對纖毛的研究深入，現(xiàn)在發(fā)現(xiàn)有1 000多種蛋白與纖毛有關(guān)，至少90多種基因突變可以導致纖毛病。除上述囊性腎臟病外，很多原來認識不清的遺傳疾病都發(fā)現(xiàn)與纖毛有關(guān)，包括Senior-Loken綜合征、Joubert綜合征、Bardet-Biedl綜合征、Meckel-Gruber綜合征、Jeune綜合征等，這些腦、眼、骨骼、肝臟等腎臟外臟器也可以在一部分的NPHP患兒中出現(xiàn)受累，這些被統(tǒng)稱為NPHP相關(guān)纖毛病[1-2,11-17]。(表1)

表1 NPHP相關(guān)纖毛病的腎外表現(xiàn)

四、近年發(fā)現(xiàn)的其他致病基因

在NPHP2發(fā)現(xiàn)后，近年來又陸續(xù)發(fā)現(xiàn)了一系列導致NPHP發(fā)生的基因，它們幾乎都是編碼纖毛/中心體蛋白，按照發(fā)現(xiàn)時間順序命名為NPHP3～NPHP20，兩個例外的是NPHP1L和NPHP2L[1-2,16-21]。其中NPHP1L基因編碼XPNPEP3蛋白，并不是在纖毛/中心粒，而是表達于線粒體的氨基肽酶，影響纖毛功能，其突變也可引起NPHP樣的臨床表現(xiàn)，因此稱其為NPHPL1；而NPHP2L編碼的是鎂離子通道，突變也可導致類似NPHP表現(xiàn)。

NPHP3基因定位于3q22.1，其突變既可以引起嬰兒型NPHP，還可以引起少年型NPHP，在嬰兒型NPHP中，合并出現(xiàn)肝臟纖維化較多，部分患兒還出現(xiàn)色素性視網(wǎng)膜炎、內(nèi)臟轉(zhuǎn)位和先天性心臟病等表現(xiàn)。這些基因的染色體定位、編碼蛋白名稱、臨床表型和腎外表現(xiàn)見表2，不一一枚舉。構(gòu)成原纖毛轉(zhuǎn)換區(qū)屏障的蛋白缺陷導致孤立或者合并眼部異常的NPHP較多，而基體/中心粒的蛋白缺陷導致NPHP合并腦部異常多見，原纖毛的軸絲內(nèi)轉(zhuǎn)運蛋白則合并骨骼畸形比較多見。

表2 各種不同NPHP基因、基因產(chǎn)物、染色體定位，臨床表型和腎外表現(xiàn)

注：RP, 色素性視網(wǎng)膜炎；OMA，眼球運動失用癥；JBTS，Joubert綜合征；MKS，Meckel-Gruber綜合征；JATD，Jeune 綜合征；BBS，Bardet-Biedl 綜合征；SBS，Sensenbrenner綜合征；CED，顱骨外層發(fā)育不良；MZSDS，Mainer-saldino綜合征

[1] Hildebrandt F, Benzing T, Katsanis N. Ciliopathies[J]. N Engl J Med, 2011, 364(16): 1533-1543.

[2] Srivastava S, Sayer JA. Nephronophthisis[J]. J Pediatr Genet, 2014, 3(2): 103-114.

[3] 王韻琴, 周建華, 劉銅林, 等. 兒童家族性少年性腎單位癆-髓質(zhì)囊腫病20例臨床分析[J]. 中國實用兒科雜志, 2001, 16(4): 230-231.

[4] Macia MS, Halbritter J, Delous M, et al. Mutations in MAPKBP1 Cause Juvenile or Late-Onset Cilia-Independent Nephronophthisis[J]. Am J Hum Genet, 2017, 100(2): 323-333.

[5] Soliman NA, Hildebrandt F, Otto EA, et al. Clinical characterization and NPHP1 mutations in nephronophthisis and associated ciliopathies: a single center experience[J]. Saudi J Kidney Dis Transpl, 2012, 23(5): 1090-1098.

[6] Qiu L, Zhou J. Simultaneous mutations of LAMB2 and NPHP1 genes in a Chinese girl with isolated congenital nephrotic syndrome: a case report[J]. BMC Pediatr, 2016,16(1): 44.

[7] Otto EA, Schermer B, Obara T, et al. Mutations in INVS encoding inversin cause nephronophthisis type 2, linking renal cystic disease to the function of primary cilia and left-right axis determination[J]. Nat Genet, 2003, 34(4): 413-420.

[8] Ishikawa H, Marshall WF. Ciliogenesis: Building the cell's antenna[J]. Nat Rev Mol Cell Biol, 2011, 12(4): 222-234.

[9] Nguyen PA, Liou W, Hall DH, et al. Ciliopathy proteins establish a bipartite signaling compartment in a C. elegans thermosensory neuron[J]. J Cell Sci, 2014, 127(Pt 24): 5317-5330.

[10] Shiba D, Yokoyama T. The ciliary transitional zone and nephrocystins[J]. Differentiation, 2012, 83(2): S91-96.

[11] Shi X, Garcia G 3rd, Van De Weghe JC, et al. Super-resolution microscopy reveals that disruption of ciliary transition-zone architecture causes Joubert syndrome[J]. Nat Cell Biol, 2017, 19(10): 1178-1188.

[12] Schueler M, Halbritter J, Phelps IG, et al. Large-scale targeted sequencing comparison highlights extreme genetic heterogeneity in nephronophthisis-related ciliopathies[J]. J Med Genet, 2016, 53(3): 208-214.

[13] Yamamura T, Morisada N, Nozu K, et al. Rare renal ciliopathies in non-consanguineous families that were identified by targeted resequencing[J]. Clin Exp Nephrol, 2017, 21(1): 136-142.

[14] Braun DA, Schueler M, Halbritter J, et al. Whole exome sequencing identifies causative mutations in the majority of consanguineous or familial cases with childhood-onset increased renal echogenicity[J]. Kidney Int, 2016, 89(2): 468-475.

[15] Gee HY, Otto EA, Hurd TW, et al. Whole-exome resequencing distinguishes cystic kidney diseases from phenocopies in renal ciliopathies[J]. Kidney Int, 2014, 85(4): 880-887.

[16] Halbritter J, Porath JD, Diaz KA, et al. GPN Study Group. Identification of 99 novel mutations in a worldwide cohort of 1,056 patients with a nephronophthisis-related ciliopathy[J]. Hum Genet, 2013, 132(8): 865-884.

[17] Schueler M, Halbritter J, Phelps IG, et al. Large-scale targeted sequencing comparison highlights extreme genetic heterogeneity in nephronophthisis-related ciliopathies[J]. J Med Genet, 2016, 53(3): 208-214.

[18] Otto EA, Hurd TW, Airik R, et al. Candidate exome capture identifies mutation of SDCCAG8 as the cause of a retinal-renal ciliopathy[J]. Nat Genet, 2010, 42(10): 840-850.

[19] Chaki M, Airik R, Ghosh AK, et al. Exome capture reveals ZNF423 and CEP164 mutations, linking renal ciliopathies to DNA damage response signaling[J]. Cell, 2012, 150(3): 533-548.

[20] Bullich G, Vargas I, Trujillano D, et al. Contribution of the TTC21B gene to glomerular and cystic kidney diseases[J]. Nephrol Dial Transplant, 2017, 32(1): 151-156.

[21] Failler M, Gee HY, Krug P, et al. Mutations of CEP83 cause infantile nephronophthisis and intellectual disability[J]. Am J Hum Genet, 2014, 94(6): 905-914.

10.3969/j.issn.1671-2390.2017.11.001

430030 武漢，華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬同濟醫(yī)院兒科

2017-10-25)