蛇床子素對大鼠腎臟缺血-再灌注損傷的保護作用

張炯 王佳 陳麗朱 王芳 李貴森

·實驗研究·

蛇床子素對大鼠腎臟缺血-再灌注損傷的保護作用

張炯 王佳 陳麗朱 王芳 李貴森

目的建立大鼠腎臟缺血-再灌注損傷(ischemia reperfusion injury, IRI)模型，研究蛇床子素防治大鼠腎臟IRI的療效及機制。方法將50只SD大鼠按體質量隨機分為假手術組、模型組、蛇床子素(低，中，高)劑量組，每組10只。蛇床子素低、中、高劑量組術前45 min分別給予蛇床子素5、10、20 mg/kg腹腔注射，假手術組和模型組術前45 min給予等體積生理鹽水腹腔注射。模型組和蛇床子素(低，中，高)劑量組制備大鼠腎臟IRI模型，假手術組不夾閉左側腎蒂。用酶聯(lián)免疫吸附試驗檢測血肌酐、尿素氮、單核細胞趨化蛋白-1、腫瘤壞死因子α和白細胞介素6；蘇木素伊紅染色檢測腎組織病理形態(tài)；逆轉錄-聚合酶鏈反應檢測mRNA水平；硫代巴比妥酸比色法檢測氧化應激指標。結果與假手術組相比，模型組腎臟病理改變以及血肌酐、尿素氮、單核細胞趨化蛋白-1、腫瘤壞死因子α、白細胞介素6和丙二醛表達水平明顯增加，而超氧化物歧化酶、過氧化氫酶和谷胱甘肽過氧化物酶活性明顯降低。與模型組相比，蛇床子素低、中、高劑量組腎臟病理改變以及血肌酐、尿素氮、單核細胞趨化蛋白-1、腫瘤壞死因子α、白細胞介素6和丙二醛表達水平呈濃度依賴性明顯降低，而超氧化物歧化酶、過氧化氫酶和谷胱甘肽過氧化物酶活性呈劑量依賴性明顯增高。結論蛇床子素對大鼠腎臟IRI有保護作用，其作用機制與抑制炎癥和氧化應激相關。

蛇床子素；腎臟缺血-再灌注損傷；氧化應激；炎癥

腎臟缺血-再灌注損傷(ischemia reperfusion injury, IRI)是指高灌注器官腎臟血供中斷，重新恢復腎臟血流灌注導致腎臟損傷反而加重的臨床危像，好發(fā)于冠脈支架植入術后、腎移植、溶栓等臨床危重癥[1-2]。其發(fā)病機制復雜，研究顯示炎癥和氧化應激是導致腎臟IRI的重要致病機制，因此抑制炎癥和氧化應激是減輕腎臟IRI的重要途徑[3]。蛇床子素是具有多重生物學活性且無明顯毒副作用的香豆素類物質，廣泛存在于歐前胡、蛇床等植物，具有抗炎、抗感染、抗腫瘤、抗氧化、清除氧自由基和抗病毒等活性[4-6]。腎臟IRI是由炎癥和氧化應激參與調控的復雜病理過程[3]。因此本研究擬通過建立大鼠腎臟IRI模型，研究蛇床子素對腎臟IRI的保護作用及相關機制。

材料與方法

一、材料

1.實驗試劑 蛇床子素(Sigma公司,美國)，單核細胞趨化蛋白-1(monocyte chemotactic protein-1,MCP-1)、腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factors α,TNF-α)和白細胞介素6(interleukin-6，IL-6)，酶聯(lián)免疫吸附分析試劑盒均購于武漢博士得；TNF-α、IL-6和MCP-1引物擎科生物，丙二醛(malonaldehyde, MDA)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、過氧化氫酶(catalase,CAT)和谷胱甘肽過氧化酶(glutathione peroxidase,GPx)均購自于南京建成生物。

2.實驗動物 健康雄性SD大鼠50只，體質量220～250 g(北京華?？倒咎峁?。動物飼養(yǎng)于四川省人民醫(yī)院實驗動物中心SPF級動物房, 溫度為20～25 ℃, 濕度為40%～70%, 光照明暗各12 h, 換氣次數(shù)為10～20次/h。飼料為SPF級鼠滅菌飼料, 購自四川省醫(yī)學實驗動物中心, 符合GB-15921.2-2014 標準。飲水為經121 ℃ (1.0 kg·cm-2)、30 min 滅菌自來水, 由動物經飲水瓶自由攝取。

二、分組及模型構建

將50只SD大鼠按體質量隨機分為假手術組、模型組和蛇床子素低、中、高劑量組,每組10只。蛇床子素低、中、高劑量組術前45 min分別給予蛇床子素5、10、20 mg/kg腹腔注射，假手術組和模型組術前45 min給予等量的生理鹽水腹腔注射。模型組和蛇床子素低、中、高劑量組制備大鼠腎臟IRI模型，假手術組操作同上，但不夾閉左側腎蒂。具體腎臟IRI模型制備方法參考文獻[7]：大鼠采用1%戊巴比妥鈉(60 mg/kg)腹腔注射麻醉，仰位固定，用無創(chuàng)血管夾夾閉大鼠左側腎蒂,夾閉45 min后松開無創(chuàng)血管夾恢復灌注，腎臟由暗紅色恢復紅潤表明再灌注成功，同時去除右腎，然后逐層縫合切口。

三、方法

1.標本收集和檢測 恢復大鼠腎臟血液再灌注24 h后, 給予腹腔注射麻醉藥品，然后行腹主動脈穿刺取全血以及收取腎臟組織。全血在室溫下以3 000 r/min速度離心10 min，取上清液，用酶聯(lián)合疫吸附試驗檢測血肌酐(SCr)、尿素氮(BUN)、MCP-1、TNF-α和 IL-6的表達水平。將收集的腎臟組織標本三分之一置于多聚甲醛做石蠟切片,其余腎組織凍于-80 ℃冰箱。

2.腎臟病理檢查 將多聚甲醛中固定的腎臟標本經脫水、透明、浸蠟、包埋處理、冷卻后制成厚度為4 μm的石蠟組織切片，烘干后進行常規(guī)蘇木素伊紅染色(HE)染色。在光學顯微鏡下觀察腎臟組織病理形態(tài)學改變，并進行Paller氏評分：每個視野下隨機選擇10個腎小管計分，腎管明顯擴張記1分，細胞扁平或腫脹記2分，刷狀緣損傷記1分，脫落記2分，管形記2分，腎小管管腔內有脫落，壞死(未形成管形或細胞碎屑記1分，腎小管正常記0分，量化腎組織損害程度。

3.檢測mRNA表達 稱取適量腎臟組織，于液氮中研磨成粉末狀提取總RNA，反轉錄為cDNA,以cDNA為模板，進行QPCR為反應，擴增靶基因和內參，目的基因為TNF-α、MCP-1和IL- 6，β-actin為內參，進行逆轉錄-聚合酶鏈反應檢測。具體擴增條件95 ℃預變性30 s；95 ℃變性5 s，60 ℃退火延伸1 min。共40個循環(huán)，得到每個樣本的CT(threshold cycle)值法，用得到的各樣本的CT值按公式2-ΔΔCT計算相對表達量，每組重復3次。(表1)

表1 本實驗所用基因的引物序列

4.氧化應激指標測定 利用硫代巴比妥酸比色法檢測腎組織MDA的含量，黃嘌呤氧化酶法檢測SOD、CAT和GPx的活性，具體步驟參見相關說明書。

四、統(tǒng)計學處理

應用SPSS 12.0軟件進行統(tǒng)計分析，實驗結果采用均數(shù)±標準差表示，資料采用單因素方差分析，多個樣本之間的兩兩比較采用T檢驗，Plt;0.05表示差異有統(tǒng)計學意義

結 果

一、蛇床子素對SCr和BUN的影響

與假手術組相比，模型組SCr和BUN均明顯增加，差異具有統(tǒng)計學意義(Plt;0.05)。與模型組比較，蛇床子素低、中、高劑量組SCr和BUN均呈濃度依賴性降低，差異具有統(tǒng)計學意義(Plt;0.05)。結果提示蛇床子素可呈濃度依賴性減輕腎臟IRI。(表2)

表2 蛇床子素對SCr和BUN的影響

注：與假手術組比較，aPlt;0.01；與模型組比較，bPlt;0.05

二、蛇床子素可明顯減輕腎臟病理改變

假手術組未見明顯的腎臟病理形態(tài)學改變，模型組腎小管明顯擴張，可見細胞核碎裂、壞死、脫落、腎小管明顯管腔阻塞、有大量蛋白管型、腎間質有大量炎性細胞浸潤。與模型組相比，蛇床子素低、中、高劑量組腎小管擴張，異常形態(tài)細胞、細胞壞死、腎間質炎性細胞浸潤均呈濃度依賴性明顯減少。結果提示蛇床子素可呈濃度依賴性減少腎臟病理形態(tài)改

變。(圖1)

三、蛇床子素對TNF-α、MCP-1和IL-6 mRNA表達影響

與假手術組比較，模型組腎臟TNF-α、MCP-1和 IL-6的mRNA表達水平明顯增加，差異有統(tǒng)計學差異(Plt;0.05)；與模型組相比，蛇床子素低、中、高劑量組腎臟TNF-α、MCP-1和 IL-6 mRNA表達水平呈濃度依賴性明顯減少，差異有統(tǒng)計學差異(Plt;0.05)。結果提示蛇床子素可減輕腎臟促炎癥細胞因子TNF-α、MCP-1和IL- 6的mRNA表達水平。(表3)

四、蛇床子素對TNF-α、MCP-1和IL- 6分泌影響

與假手術組比較，模型組血清中TNF-α、MCP-1和 IL-6表達水平明顯增加，差異有統(tǒng)計學差異(Plt;0.05)；與模型組相比，蛇床子素低、中、高劑量組血清中TNF-α、MCP-1和 IL-6表達水平呈濃度依賴性明顯減少，差異有統(tǒng)計學差異(Plt;0.05)。結果提示蛇床子素可減少促炎癥細胞因子TNF-α、MCP-1和IL-6的分泌。(表4)

五、蛇床子素對腎臟促氧化應激酶的影響

假手術組MDA含量為(3.05±0.25) nmol/mg, 模型組MDA含量為(13.18±3.92) nmol/mg, 較假手術組明顯增高，差異具有統(tǒng)計學差異(Plt;0.05)。蛇床子素低、中、高劑量組MDA含量分別為(9.02±2.18)nmol/mg、(6.78±1.74)nmol/mg、(4.12±1.02)nmol/mg,與模型組相比，腎組織MDA的含量呈濃度依賴性明顯降低，差異具有統(tǒng)計學差異(Plt;0.05)。這提示蛇床子素可呈濃度依賴性減少MDA的表達。

六、蛇床子素對腎臟抗氧化應激酶活性的影響

黃嘌呤氧化酶法檢測結果顯示：模型組與假手術組相比，CAT、GPx和SOD活性明顯降低，差異具有統(tǒng)計學差異(Plt;0.05)。蛇床子素低、中、高劑量組與模型組相比，CAT、GPx和SOD的活性呈濃度依賴性明顯增加，差異具有統(tǒng)計學差異(Plt;0.05)。這提示蛇床子素可增加腎臟抗氧化應激酶CAT、GPx和SOD活性。(表5)

注：與假手術組比較，aPlt;0．01；與模型組比較，bPlt;0．05圖1 蛇床子素對腎臟病理形態(tài)的影響

表3 蛇床子素對腎臟促炎癥細胞因子mRNA表達水平的影響

注：與假手術組比較，aPlt;0.01；與模型組比較，bPlt;0.05

表4 蛇床子素對血清中促炎癥細胞因子

注：與假手術組比較，aPlt;0.01；與模型組比較，bPlt;0.05

討 論

IRI是一個復雜的病理生理過程，自60年代心臟IRI提出以來，在臨床相繼發(fā)現(xiàn)在器官移植、心肺復蘇和休克治療等均可發(fā)生IRI[8-9]。作為血流高灌注器官之一的腎臟，腎臟IRI容易引發(fā)腎臟葉間動脈受損，導致腎臟微血管損傷，引發(fā)腎小管代謝紊亂乃至壞死，進而影響腎臟血流，引起腎臟細胞凋亡、壞死、乃至腎功衰竭，是目前引起急性腎衰最常見的原因之一。但目前治療措施有限，因此尋找新的干預治療措施減輕腎臟IRI具有重要的臨床現(xiàn)實意義[10-11]。目前在大鼠誘導腎臟IRI模型常規(guī)有兩種方式，一種是夾閉大鼠雙側腎蒂，另外一種是夾閉大鼠單側腎蒂。因夾閉大鼠單側腎蒂更能模擬臨床，因此本實驗通過夾閉大鼠左側腎蒂，并去除右腎的方法誘導腎臟IRI[8-10]。在本研究中，腎臟IRI可導致腎小管明顯擴張，細胞核碎裂、壞死、脫落、腎小管明顯管腔阻塞、大量蛋白管型、腎間質大量炎性細胞浸潤以及SCr和BUN明顯升高，提示腎臟IRI可導致腎臟病理結構改變和腎功受損，這與既往研究相一致。而蛇床子預處理可呈濃度依賴性減少腎臟病理結構的改變和血清SCr和BUN的下降，提示蛇床子素對腎臟IRI具有保護作用，而且在5～20 mg/kg范圍內，呈濃度依賴性。但具體機制不明。

既往研究顯示腎臟IRI的發(fā)病機制涉及炎癥反應、氧化應激、中性粒細胞聚集、鈣超載、凋亡等[12-13]。氧化應激與腎臟IRI密切相關，腎缺血可使氧自由基生成增多，并可通過膜脂質過氧化加劇腎臟損傷。MDA 是氧自由基引發(fā)的脂質過氧化反應的終末產物，具有很強的細胞毒作用，MDA的表達水平可反映機體受自由基損傷程度[14]。CAT、GPx和SOD是體內活性較強的氧自由基清除酶類，其表達量的高低可間接反映機體受氧自由基損傷程度[15]。研究結果顯示，腎臟IRI可增加MDA的表達量，減少CAT、GPx和SOD的活性，而蛇床子素可呈濃度依賴性減少MDA的含量，提高CAT、GPx和SOD活性，提示蛇床子素可通過提高機體的抗氧化應激能力而減輕對腎臟IRI，這可能與蛇床子素具有抗氧化應激能力相關。有研究提示，炎癥可加劇腎臟IRI的進程并影響腎功的恢復及預后[3]。腎臟IRI可導致促炎炎癥細胞因子生成增加，從而進一步加重腎臟損傷。TNF-α、MCP-1和IL- 6是熟知的致炎細胞因子，可加劇炎癥反應、促進腎小管上皮細胞的凋亡、壞死以及腎功的受損[2-3]。本研究結果顯示，蛇床子素可呈濃度依賴性減少TNF-α、MCP-1和IL- 6的表達，表明蛇床子素對腎臟IRI的保護作用可能與其抗炎作用相關。

表5 蛇床子素對腎臟氧化應激酶活性的影響

注：與假手術組比較，aPlt;0.01；與模型組比較，bPlt;0.05

綜上所述，蛇床子素對腎臟IRI具有保護作用，該作用機制可能與蛇床子素具有抑制炎癥和提高機體抗氧化應激能力相關。

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ProtectiveeffectsofOstholeonrenalischemiareperfusioninjury

ZHANGJiong,WANGJia,CHENLi-zhu,WANGFang,LIGui-sen.

DepartmentofNephrology,SichuanProvincialPeople'sHospital,Chengdu610072,China

LIGui-sen,E-mail:guisenli@163.com

ObjectiveTo establish a model of renal ischemia-reperfusion injury (IRI) in rats and study the effect and mechanism of osthole on renal IRI in rats.MethodsA rat model of renal IRI was constructed by clamping the left renal pedicle of the rats for 45 min, removing the right kidney, and restoring the renal blood flow for 24 h. Fifty SD rats were randomly divided into sham operated group, renal IRI group, and osthole (low, middle, high) dose groups. 45 min before operation, osthole (5, 10, and 20 mg/kg) was given by intraperitoneal injection in osthole groups. In the sham operated group and renal IRI group, the same volume of normal saline was intraperitoneally injected 45 min before operation. RT-PCR was used to detect the mRNA expression levels of monocyte chemoattractant protein-1 (MCP-1), tumor necrosis factor alpha (TNF-α) and interleukin-6 (IL-6). ELISA was used to detect serum creatinine (SCr), blood urea nitrogen (BUN), MCP-1, TNF-α and IL-6. Hematoxylin eosin staining (HE) was used to examine the pathological morphology of renal tissues. The thiobarbituric acid colorimetric method was used to measure malondialdehyde (MDA) content in renal tissues. The xanthine oxidase method was used to determine the activity of superoxide dismutase (SOD), catalase (CAT) and glutathione peroxidase (GPx).ResultsAs compared with sham operated group, renal pathological changes were aggravated, SCr, BUN, MCP-1, TNF-α, IL-6 and MDA levels were significantly increased, and SOD, CAT and GPx activity decreased significantly in IRI group. As compared with IRI group, the pathological changes of renal tissues were significantly alleviated, SCr, BUN, MCP-1, TNF-α, IL-6 and MDA were significantly decreased in a concentration-dependent manner, and SOD, CAT and GPx activity increased in a dose-dependent manner in osthole-treated groups.ConclusionsOsthole has protective effects on renal IRI in rats, which may be related to the inhibition of inflammation and oxidative stress.

Osthole; Ischemia-reperfusion injury; Inflammtion; Oxidative stress

10.3969/j.issn.1671-2390.2017.11.011

國家自然科學基金(No.81401362, 81100575)；四川省科技支撐計劃(No.2015SZ0245)；四川省青年科技創(chuàng)新研究團隊發(fā)展項目(No.2015TD0013)

610072 成都，四川省人民醫(yī)院腎內科(張炯，王芳，李貴森)，全科(王佳，陳麗朱)

李貴森，E-mail:guisenli@163.com

2016-07-23

2017-08-15)