心痛方對急性心肌梗死大鼠MMP-9 mRNA及TIMP-1 mRNA表達(dá)的影響*

謝榮苑 范金茹 周斐然 陳 彤 王建湘 歐陽過 廖建萍 劉志云

（1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南 長沙 410208；2.湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，湖南 長沙410007）

心痛方對急性心肌梗死大鼠MMP-9 mRNA及TIMP-1 mRNA表達(dá)的影響*

謝榮苑1范金茹2△周斐然2陳 彤2王建湘2歐陽過1廖建萍2劉志云1

（1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南 長沙 410208；2.湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，湖南 長沙410007）

目的通過觀察心痛方對大鼠急性心肌梗死（AMI）后基質(zhì)金屬蛋白酶-9（MMP-9）mRNA和金屬蛋白酶組織抑制物-1（TIMP-1）mRNA表達(dá)及對心肌形態(tài)學(xué)的影響，探討心痛方治療AMI的療效機(jī)制。方法80只SD大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、心痛方組、雙抗組（阿司匹林+氯吡格雷），冠脈結(jié)扎法制備AMI模型，灌胃給藥7 d后處死大鼠，運(yùn)用RT-PCR法測定心肌組織MMP-9 mRNA、TIMP-1 mRNA表達(dá)，心肌細(xì)胞HE染色觀察形態(tài)學(xué)改變。結(jié)果心痛方能使AMI大鼠心肌內(nèi)MMP-9 mRNA表達(dá)減少 （P＜0.01）；TIMP-1 mRNA表達(dá)升高（P＜0.01）；MMP-9 mRNA/TIMP-1 mRNA比值降低（P＜0.01）；心肌損傷程度及心梗面積與MMP-9 mRNA/TIMP-1 mRNA比值呈正直線相關(guān)。結(jié)論心痛方對AMI缺血心肌具有保護(hù)作用，其作用機(jī)制可能與增加TIMP-1 mRNA表達(dá)，降低MMP-9 mRNA表達(dá)，從而調(diào)節(jié)MMP-9 mRNA/TIMP-1 mRNA的平衡有關(guān)。

急性心肌梗死 心痛方 MMP-9 mRNA TIMP-1 mRNA

細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）是心臟和心血管壁的主要成分，基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）和金屬蛋白酶抑制劑（TIMPs）與多種心血管疾病的發(fā)生與發(fā)展過程相關(guān)，在動脈粥樣硬化性心血管疾?。–VD）的發(fā)病機(jī)制中起重要作用［1］。MMPs是炎癥活動的產(chǎn)物，炎性細(xì)胞因子可激活巨噬細(xì)胞使MMPs產(chǎn)生增多，同時某些細(xì)胞因子下調(diào)TIMPs的產(chǎn)生，使 MMPs/TIMPs的比例失衡［2］。 本研究通過觀察心痛方對急性心肌梗死（AMI）大鼠心肌組織MMP-9 mRNA、TIMP-1 mRNA的表達(dá)以及對心肌組織結(jié)構(gòu)改變的影響來探討心痛方的療效機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗動物

SPF級SD雄性大鼠80只，體質(zhì)量200～250 g，鼠齡8～10周，購自長沙市天勤生物技術(shù)有限公司，許可證號：SCXK（湘）2014-0011。

1.2 試藥與儀器

心痛方（組方：柴胡 10 g，瓜蔞 10 g，川芎 10 g，桃仁 10 g，蒲黃 10 g，白芥子 10 g，郁金 10 g，九香蟲 5 g，甘草5 g），購于湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院中藥房，由湖南中醫(yī)藥大學(xué)心血管實(shí)驗室統(tǒng)一煎制成濃縮湯劑（含生藥0.652 g/mL）。阿司匹林（拜耳醫(yī)藥保健有限公司生產(chǎn)，批號：BJ33812）；氯吡格雷（深圳信立泰藥業(yè)股份有限公司生產(chǎn)，批號：FF17090）；RNA提取試劑Trizol Reagent（由Invitrogen Life Technologies公司提供，批號：15596-026）；熒光定量PCR儀（上海宏石醫(yī)療科技有限公司）；PCR試劑盒、PCR引物 （武漢谷歌生物試劑有限公司提供）。

1.3 分組及造模

按體質(zhì)量分層，再按隨機(jī)表隨機(jī)分組，分為假手術(shù)組、模型組、心痛方組、雙抗組（阿司匹林+氯吡格雷），各20只。根據(jù)改進(jìn)的大鼠AMI模型制備法［3］對模型組、心痛方組及雙抗組大鼠進(jìn)行造模。以左心室前壁顏色變白和運(yùn)動減弱且心電圖顯示Ⅱ?qū)?lián)ST段弓背向上抬高≥0.1 mV或出現(xiàn)病理性Q波為結(jié)扎成功的標(biāo)志（S-T段無改變者淘汰）。假手術(shù)組僅開胸，不結(jié)扎。術(shù)后7 d假手術(shù)組存活17只，模型組存活13只，心痛方組存活15只，雙抗組存活14只。

1.4 給藥方法

造模（或假手術(shù)）后2 h開始給藥，以60 kg人臨床用藥量為標(biāo)準(zhǔn)，參照劑量-體表面積換算方法計算大鼠給藥量，藥物濃度按1 mL/100 g體質(zhì)量配制。心痛方組予心痛方 6.52 g/kg，雙抗組予阿司匹林 13.05 mg/kg、氯吡格雷26.10 mg/kg，模型組和假手術(shù)組分別予等量生理鹽水灌胃。每日1次，連續(xù)7 d。

1.5 標(biāo)本采集與檢測

1.5.1 心肌病理組織學(xué)檢測并心肌損傷程度評分及心梗面積測定 灌胃給藥7 d后處死大鼠，取各組大鼠心肌梗死區(qū)組織，將組織浸沒于4%多聚甲醛中24 h固定，取出固定材料常規(guī)脫水、透明、浸蠟包埋、切片，進(jìn)行蘇木素-伊紅（HE）染色。觀察心肌病理學(xué)變化，并于光鏡下根據(jù)心肌形態(tài)學(xué)改變進(jìn)行心肌損傷程度評分［4］：心肌纖維排列整齊、無炎癥細(xì)胞浸潤、無壞死記0分；心肌纖維凝固性壞死并出現(xiàn)輕度炎癥細(xì)胞浸潤記1分；大量心肌纖維出現(xiàn)凝固性壞死并重度炎癥細(xì)胞浸潤記2分。用計算機(jī)圖像分析系統(tǒng)測定每張HE染色切片上的梗死區(qū)面積，計算心梗部分占心肌橫斷面面積的百分比。

1.5.2 逆轉(zhuǎn)錄 PCR（RT-PCR）檢測心肌 MMP-9mRNA、TIMP-1 mRNA表達(dá)水平 取100 mg心肌組織加入Trizol試劑1 mL，按產(chǎn)品說明步驟提取心肌總RNA。引物序列如下。 MMP-9（283 bp）：上游 5′-GCAAACCCTGCGTATTTCCATT-3′； 下游 5′-GCGATAACCATCCGAGCGAC-3′。TIMP-1（326bp）：上游 5′-TAAAGCCTGTAGCTGTGCCC-3′； 下游 5′-CATAACGCTGGTA TAAGGTGGTC-3′。 GAPDH（482 bp）：上游 5′-TTCCTACCCCCAATGTATCCG-3′， 下游 5′-CATGAGGTCCACCACCCTGTT-3′。 RT-PCR 反 應(yīng) 體 系 ：10×PCR Buffer 2.5 μL，25 mol/L MgCl21.5 μL，10 mmol/L dNTP 1 μL，Taq 酶 0.2 U，cDNA 2 μL，引物量 10 pmol。 總體系25 μL。反應(yīng)條件：94℃ 5 min，然后進(jìn)入PCR循環(huán)，94℃預(yù)變性30 s，分別于60℃和58℃退火30 s，72℃延伸45 s，循環(huán)33次后再延伸5 min。取PCR產(chǎn)物5 μL于1.5%瓊脂糖凝膠電泳，然后在凝膠成像系統(tǒng)上掃描，測定各目的基因和GAPDH擴(kuò)增產(chǎn)物的吸光度值，分別計算其比值。

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠心肌組織MMP-9 mRNA、TIMP-1 mRNA檢測結(jié)果 見表1。結(jié)果示，假手術(shù)組MMP-9 mRNA表達(dá)最少（P＜0.01）。模型組MMP-9 mRNA表達(dá)較假手術(shù)組明顯升高（P＜0.01）。與模型組比較，心痛方組、雙抗組MMP-9 mRNA表達(dá)顯著降低（P＜0.01）。與假手術(shù)組相比，心痛方組、雙抗組MMP-9 mRNA表達(dá)升高（P＜0.01）。心痛方組、雙抗組比較，雙抗組MMP-9 mRNA表達(dá)升高（P＜0.01）。與模型組比較，心痛方組、雙抗組TIMP-1 mRNA 表達(dá)顯著增高（P＜0.01），且心痛方組更有優(yōu)勢（P＜0.01）。與假手術(shù)組相比，模型組MMP-9 mRNA/TIMP-1 mRNA 的比值明顯增高（P ＜ 0.01），TIMP-1 mRNA 的比值明顯降低（P＜0.01）。與假手術(shù)組相比，心痛方組、雙抗組MMP-9 mRNA/TIMP-1 mRNA的比值升高（P＜0.01）。心痛方組、雙抗組比較，雙抗組MMP-9 mRNA/TIMP-1 mRNA 的比值升高（P＜0.01）。

表1 各組大鼠心肌組織MMP-9 mRNA、TIMP-1 mRNA表達(dá)比較（±s）

表1 各組大鼠心肌組織MMP-9 mRNA、TIMP-1 mRNA表達(dá)比較（±s）

與假手術(shù)組比較，△P＜0.01；與模型組比較，*P＜0.01；與心痛方組比較，#P＜0.01。 下同。

組別 n MMP-9 mRNA/TIMP-1 mRNA MMP-9 mRNA TIMP-1 mRNA假手術(shù)組 17 0.36±0.02模型組 13 0.93±0.01△心痛方組 15 0.45±0.01△*0.47±0.04 1.30±0.07 1.23±0.05△ 1.32±0.05 0.71±0.04△* 1.58±0.05△*雙抗組 14 0.57±0.01△*#0.84±0.03△*# 1.47±0.05△*#

2.2 各組大鼠心肌組織病理形態(tài)學(xué)改變、心肌損傷程度評分及心梗面積測定 見圖1，表2。如圖1示，假手術(shù)組心肌纖維著色均勻，排列整齊、規(guī)則，胞界清楚，間質(zhì)未見異常；模型組大鼠心肌纖維出現(xiàn)大量凝固性壞死并伴有重度嗜中性粒細(xì)胞點(diǎn)狀浸潤，心肌纖維水腫，肌漿疏松、淡染；心痛方組、雙抗組心肌纖維壞死程度及嗜中性粒細(xì)胞點(diǎn)狀浸潤較模型組明顯減輕，只有部分心肌纖維水腫。如表2示，與假手術(shù)組比較，模型組、雙抗組心肌形態(tài)學(xué)評分增高（P＜0.01），心痛方組差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；與模型組比較，心痛方組、雙抗組評分明顯降低（P＜0.01）；與心痛方組比較，雙抗組差異無統(tǒng)計意義（P＞0.05）。各給藥組心梗面積與模型組相比均縮?。≒＜0.01），心痛方組在縮小心梗面積上較雙抗組更有優(yōu)勢（P＜0.05）。

圖1 各組大鼠心肌組織病理形態(tài)學(xué)改變（HE染色，400倍）

表2 各組大鼠心肌細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變評分及心梗面積比較（±s）

表2 各組大鼠心肌細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變評分及心梗面積比較（±s）

組 別 n 心肌形態(tài)學(xué)評分（分） 心梗面積（%）假手術(shù)組 17 0.18±0.39模型組 13 1.69±0.48△ 35.43±1.44心痛方組 15 0.60±0.63# 22.12±0.96*雙抗組 14 0.93±0.73△ 23.19±0.89#*

2.3 各組大鼠心肌MMP-9 mRNA/TIMP-1 mRNA比值與心肌細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變相關(guān)性分析 見表3。大鼠MMP-9 mRNA/TIMP-1 mRNA比值與各組大鼠對應(yīng)心肌形態(tài)學(xué)評分呈正直線相關(guān)（r=0.684，P=0.00）。

表3 大鼠MMP-9 mRNA/TIMP-1 mRNA比值與心肌細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變相關(guān)性分析

2.4 大鼠心肌MMP-9 mRNA/TIMP-1 mRNA比值與心梗面積相關(guān)性分析 見表4。大鼠MMP-9 mRNA/TIMP-1 mRNA比值與模型組、心痛方組、雙抗組對應(yīng)心梗面積呈正直線相關(guān)（r=0.975，P=0.00）。

表4 大鼠MMP-9 mRNA/TIMP-1 mRNA比值與心梗面積相關(guān)性分析

3 討 論

研究發(fā)現(xiàn)，MMPs和TIMPs共同參與了許多心血管疾病的發(fā)生發(fā)展過程，合理調(diào)控MMPs的活性與表達(dá)有利于心血管疾病的治療。而動脈粥樣硬化是公認(rèn)的在幾個不同疾病階段發(fā)生的炎癥反應(yīng)過程，其中有許多是與MMPs的活性改變有關(guān)。正常生理情況下，MMPs/TIMPs保持動態(tài)平衡狀態(tài)。血管細(xì)胞外基質(zhì)成分如膠原蛋白、彈性蛋白能夠被這些激活的MMPs降解，從而導(dǎo)致血管的老化以及動脈粥樣硬化的形成［5］。MMP-9是基質(zhì)金屬蛋白酶家族的主要成員，也是冠心病的一個重要炎癥因子，可以促進(jìn)炎癥細(xì)胞的滲出，并與ACS的發(fā)生發(fā)展有重要關(guān)系［6］。研究表明，ACS早期炎癥活動較顯著，AMI患者M(jìn)MP-9水平明顯升高［7］。在AMI發(fā)生后，MMP-9的活性增加，從而促進(jìn)膠原蛋白的降解［8-9］。且 MMP-9 的表達(dá)與心肌受損程度相關(guān)［10］，其對AMI患者的不良預(yù)后有一定的預(yù)測價值［11-12］。而TIMP-1是MMP-9的特異性抑制物，通過與MMP-9特異性結(jié)合，能夠抑制MMP-9的活性，減少M(fèi)MP-9對細(xì)胞外基質(zhì)的降解［13］，從而維持ECM的動態(tài)平衡。本研究發(fā)現(xiàn)，造模后實(shí)驗組MMP-9 mRNA表達(dá)較假手術(shù)組明顯升高（P＜0.01）；與模型組比較，心痛方組及雙抗組MMP-9 mRNA表達(dá)減少（P＜0.01），TIMP-1 mRNA表達(dá)增加（P＜0.01），提示大鼠心肌梗死后發(fā)生了MMP-9 mRNA、TIMP-1 mRNA活性變化，心痛方組及雙抗組可降低MMP-9 mRNA表達(dá)，增加TIMP-1 mRNA活性，從而調(diào)節(jié)MMP-9 mRNA/TIMP-1 mRNA的平衡。

心肌梗死屬中醫(yī)學(xué)“胸痹心痛”“真心痛”等范疇，其可由寒邪內(nèi)侵、飲食不節(jié)、情緒失調(diào)、勞逸失節(jié)、年邁體虛等相互作用所致，病機(jī)總概括為“不榮而痛”與“不通而痛”共存，其中心絡(luò)不暢或不通為其病機(jī)之基礎(chǔ)，氣血不榮為疼痛之理。其發(fā)病與痰瘀密切相關(guān)，痰瘀互結(jié)證為其常見證候，也是急性心肌梗死發(fā)病的重要病理因素。心痛方根據(jù)疏肝化瘀豁痰法立方，由柴胡、瓜蔞、川芎、桃仁、蒲黃、白芥子、郁金、九香蟲、甘草組成，主治痰瘀互結(jié)氣郁證胸痹心痛，化痰與祛瘀并舉，冀脈絡(luò)通暢，氣血安和，心痛之疾可瘥，因而臨床療效確切?，F(xiàn)代藥理研究亦表明，心痛方中多味中藥對于冠心病均有良好療效，如柴胡具有抗氧化、抗血小板凝集等諸多作用［14］；川芎中酚酸類化合物具有抑制血小板聚集、抗動脈粥樣硬化、清除自由基等藥理活性［15］；桃仁石油醚提取物可能對心肌缺血損傷有改善作用，并對急性心肌梗死有較好的防治作用［16］；九香蟲具有明顯的抗凝血作用，其蟲體水煎液體外可抑制家兔血小板聚集［17］。通過本研究發(fā)現(xiàn)，心痛方能使AMI大鼠心肌組織MMP-9 mRNA表達(dá)減少，增加TIMP-1 mRNA的表達(dá)，有效減少AMI大鼠心梗面積，使心肌損傷程度降低，提示心痛方對急性缺血缺氧后心肌具有明顯保護(hù)作用。心痛方治療AMI的作用機(jī)制之一可能是對MMP-9 mRNA及TIMP-1 mRNA活性表達(dá)的有效調(diào)控，通過調(diào)節(jié)MMP-9 mRNA/TIMP-1 mRNA的平衡來實(shí)現(xiàn)，但具體機(jī)制尚未明確，尚需進(jìn)一步研究。

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Effect of Xintong Decoction on the Expression of MMP-9 mRNA and TIMP-1mRNA in Acute Myocar-dial Infarction Rats

XIE Rongyuan，F(xiàn)AN Jinru，ZHOU Feiran，et al. Hunan University of Chinese Medicine，Hunan，Changsha 410208，China.

Objective：To investigate the effect of Xintong Decoction on the expression of matrix metalloproteinase-9 （MMP-9） mRNA，tissue inhibitor of metalloproteinase-1 （TIMP-1） mRNA and effects on myocardial morphology in acute myocardial infarction （AMI） rats，and to explore the therapeutic mechanism of Xintong Decoction on AMI.Methods：80 SD rats were randomly divided into sham operation group （A group），the model group（group B），Xintong Decoction group（group C），and Dual anti-platelet group （aspirin+clopidogrel，group D）.AMI model was established by coronary artery ligation method.Rats were killed 7 days after intragastric administration.Expression of MMP-9 mRNA and TIMP-1 mRNA in myocardium were observed by RT-PCR，and morphological changes were observed by HE staining.Results：Xintong Decoction could reduce the expression of MMP-9 mRNA（P ＜ 0.01），increase the expression of TIMP-1 mRNA（P＜0.01），and decrease the ratio of MMP-9 mRNA/TIMP-1 mRNA in AMI rats（P ＜ 0.01）.The degree of myocardial injury and the area of myocardial infarction were positively correlated with MMP-9 mRNA/TIMP-1 mRNA ratio.Conclusion：Xintong Decoction has protective effects on AMI ischemic myocardium，and its mechanism may be related to increasing the expression of TIMP-1 mRNA，reducing the expression of MMP-9 mRNA and thus regulating the balance of MMP-9 mRNA/TIMP-1 mRNA.

Acute myocardial infarction；Xintong Decoction；MMP-9 mRNA；TIMP-1 mRNA

R285.5

A

1004-745X（2017）11-1922-04

10.3969/j.issn.1004-745X.2017.11.012

湖南省教育廳科學(xué)研究項目（16A159）

△通信作者（電子郵箱：fanjr218@sina.com）

2017-08-10）