斑馬魚(yú)腫瘤異種移植模型在抗癌藥敏感性評(píng)價(jià)中的應(yīng)用

勞喬聰，徐懿喬，金凡茂，陳嘉晟，湯敏佳，徐 雷，朱曉宇，鄭高利，宣堯仙，李春?jiǎn)?

(1.杭州環(huán)特生物科技股份有限公司，杭州 310012； 2.浙江省人用物品安全性評(píng)價(jià)技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室早期評(píng)價(jià)基地，杭州 310012； 3.浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院安全性評(píng)價(jià)研究中心，杭州 310013)

斑馬魚(yú)腫瘤異種移植模型在抗癌藥敏感性評(píng)價(jià)中的應(yīng)用

勞喬聰1,2，徐懿喬1，金凡茂1，陳嘉晟1，湯敏佳1，徐 雷1，朱曉宇1,2，鄭高利3，宣堯仙3，李春?jiǎn)?,2*

(1.杭州環(huán)特生物科技股份有限公司，杭州 310012； 2.浙江省人用物品安全性評(píng)價(jià)技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室早期評(píng)價(jià)基地，杭州 310012； 3.浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院安全性評(píng)價(jià)研究中心，杭州 310013)

目的應(yīng)用人類肺癌、胃癌和肝癌細(xì)胞斑馬魚(yú)異種移植模型，分別評(píng)價(jià)5種臨床常用抗癌藥的體內(nèi)敏感性。方法分別建立斑馬魚(yú)肺癌A549、胃癌SGC-7901和肝癌HepG2異種移植模型，順鉑、紫杉醇、長(zhǎng)春瑞濱、恩度和貝伐單抗設(shè)計(jì)3個(gè)劑量分別處理斑馬魚(yú)肺癌A549移植模型，紫杉醇、伊立替康、羥基脲、順鉑和5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil，5-FU)設(shè)計(jì)3個(gè)濃度或劑量分別處理斑馬魚(yú)胃癌SGC-7901移植模型，阿霉素、吉西他濱、羥基脲、順鉑和5-氟尿嘧啶設(shè)計(jì)3個(gè)濃度或劑量分別處理斑馬魚(yú)肝癌HepG2移植模型。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，使用熒光顯微鏡進(jìn)行體內(nèi)腫瘤定量圖像分析，計(jì)算藥物對(duì)斑馬魚(yú)體內(nèi)腫瘤生長(zhǎng)抑制率，通過(guò)與模型對(duì)照組相比，分析是否具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果受試的抗腫瘤藥物在斑馬魚(yú)腫瘤異種移植模型中均有效，并且基本都呈劑量依賴性。在抗肺癌A549藥敏試驗(yàn)中，藥效從高到低分別為貝伐單抗(65%)>順鉑(55%)>長(zhǎng)春瑞濱(40%)>恩度(39%)>紫杉醇(27%)；在抗胃癌SGC-7901藥敏試驗(yàn)中，藥效從高到底分別為羥基脲(46%)>5-FU(31%)=伊立替康(31%)>紫杉醇(26%)>順鉑(24%)；在抗肝癌HepG2藥敏試驗(yàn)中，藥效從高到底分別為順鉑(64%)>羥基脲(56%)>吉西他濱(46%)>阿霉素(45%)>5-FU(38%)。結(jié)論斑馬魚(yú)腫瘤異種移植模型適合用于抗癌藥體內(nèi)藥敏試驗(yàn)。

斑馬魚(yú)；腫瘤移植；抗癌藥；體內(nèi)藥敏試驗(yàn)；藥效比較

世界上每年都會(huì)出現(xiàn)大量新的抗腫瘤候選物，大量的人力物力不斷地投入到抗腫瘤藥物的開(kāi)發(fā)中，然而，每年都有大量的抗腫瘤藥物在前期的開(kāi)發(fā)中給科學(xué)家?guī)?lái)希望，但在后期的臨床研究中被證明是無(wú)效的，由此造成的時(shí)間、金錢(qián)、精力成本巨大[1]。因此，尋找一種在藥物開(kāi)發(fā)早期便能夠迅速、準(zhǔn)確、高效評(píng)價(jià)抗腫瘤候選物藥效的方法非常必要。

斑馬魚(yú)作為一種重要的模式生物，早期主要應(yīng)用于發(fā)育遺傳學(xué)研究[2-4]和有毒物質(zhì)的檢測(cè)[5-11]。近些年來(lái)，斑馬魚(yú)在各類藥物的藥效評(píng)價(jià)方面也起到了越來(lái)越重要的作用[12-19]。斑馬魚(yú)作為一種整體的活體動(dòng)物模型，在藥物評(píng)價(jià)方面，具備藥物在體內(nèi)吸收、分布、代謝、排泄的完整過(guò)程，并且由于其本身的物理特性，斑馬魚(yú)又具有類似體外細(xì)胞、分子生物學(xué)手段快速、高效、經(jīng)濟(jì)的優(yōu)勢(shì)，是細(xì)胞等體外試驗(yàn)?zāi)Ｐ瓦^(guò)渡到鼠科等哺乳動(dòng)物模型中的一個(gè)優(yōu)勢(shì)動(dòng)物模型，在藥物的臨床前研究階段有較高應(yīng)用價(jià)值。

斑馬魚(yú)腫瘤異種移植模型是抗腫瘤藥物研發(fā)中一種新興的實(shí)驗(yàn)技術(shù)[20]，廣泛應(yīng)用于抗腫瘤藥物的早期篩選實(shí)驗(yàn)[21, 22]，但并未見(jiàn)關(guān)于使用該模型專門(mén)評(píng)價(jià)已上市藥物藥敏性的報(bào)道。因此，本研究以斑馬魚(yú)腫瘤移植為動(dòng)物模型，驗(yàn)證臨床常用的抗腫瘤藥物在該模型上的藥敏性，旨在探索斑馬魚(yú)腫瘤異種移植模型是否能夠準(zhǔn)確評(píng)價(jià)抗腫瘤藥物的效果，為該模型應(yīng)用于抗癌藥物的研發(fā)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

野生型AB品系斑馬魚(yú)，源于自然成對(duì)交配繁殖，由杭州環(huán)特生物科技股份有限公司養(yǎng)魚(yú)中心[SYXK(浙)2012-0171]繁殖提供。年齡為受精后2 d(2 dpf)，每實(shí)驗(yàn)組為30尾。實(shí)驗(yàn)用斑馬魚(yú)飼養(yǎng)于28℃水溫的專門(mén)水族箱，飼養(yǎng)用水的水質(zhì)為：每1 L反滲透水中加入200 mg速溶海鹽，電導(dǎo)率為480～510 μS/cm，pH為6.9～7.2，硬度為53.7～71.6 mg/L CaCO3。飼養(yǎng)管理符合國(guó)際AAALAC認(rèn)證的要求。

1.2主要試劑與儀器

解剖顯微鏡(SMZ645，Nikon公司)；6孔板(Nest Biotech)；精密電子天平(CP214，奧豪斯)；顯微注射儀(IM-300，Narishige，Japan)；拉針儀(PC-10，Narishige)；電動(dòng)聚焦連續(xù)變倍熒光顯微鏡(AZ100，Nikon公司)；恩度由山東先聲麥得津生物制藥有限公司生產(chǎn)，批號(hào)為201505012；紫杉醇由阿拉丁試劑(上海)有限公司生產(chǎn)，批號(hào)為45076；阿霉素由阿拉丁試劑(上海)有限公司生產(chǎn)，批號(hào)為25316-40-9；貝伐單抗由羅氏公司公司生產(chǎn)，批號(hào)為H0126805；順鉑由阿拉丁試劑(上海)有限公司生產(chǎn)，批號(hào)為k1520124。

1.3實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng)及標(biāo)記

人肺癌A549細(xì)胞株、胃癌SGC-7901細(xì)胞株和肝癌HepG2細(xì)胞株均從美國(guó)ATCC購(gòu)買(mǎi)，均使用含10%胎牛血清的DMEM完全培養(yǎng)基，在37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，CO2濃度為5%。腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，用胰酶消化收集細(xì)胞，使用CM-Dil進(jìn)行標(biāo)記。

1.3.2 斑馬魚(yú)腫瘤異種移植模型的建立

將標(biāo)記好的細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，調(diào)整濃度為3 × 107個(gè)細(xì)胞/mL，使用顯微注射儀將細(xì)胞注射至2 dpf斑馬魚(yú)卵黃囊內(nèi)，注射體積10 nL，每尾斑馬魚(yú)約注射300個(gè)細(xì)胞。注射細(xì)胞后的斑馬魚(yú)放置35℃恒溫生化培養(yǎng)箱培養(yǎng)，24 h后在熒光顯微鏡下篩選熒光量一致的斑馬魚(yú)，按實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)進(jìn)行分組，每組30尾斑馬魚(yú)。

1.3.3 藥物處理

根據(jù)臨床用藥相對(duì)應(yīng)的方式，臨床口服藥物對(duì)應(yīng)斑馬魚(yú)水溶給藥，臨床靜脈注射藥物對(duì)應(yīng)斑馬魚(yú)靜脈注射給藥。通過(guò)濃度摸索實(shí)驗(yàn)，得到各抗癌藥物在斑馬魚(yú)上的最大耐受劑量(maximum tolerated dose，MTD)或濃度(maximum tolerated concentration，MTC)。在體內(nèi)藥敏試驗(yàn)中，各藥物均選擇3個(gè)劑量或濃度進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，分別為MTD/4、MTD/2和MTD，MTC/4、MTC/2和MTC。

抗非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞藥敏試驗(yàn)組別和劑量設(shè)置見(jiàn)表1?？刮赴㏒GC-7901細(xì)胞藥敏試驗(yàn)組別和劑量設(shè)置見(jiàn)表2?？垢伟〩epG2細(xì)胞藥敏試驗(yàn)組別和劑量設(shè)置見(jiàn)表3。

移植腫瘤的斑馬魚(yú)，不加任何藥物處理的為模型對(duì)照組。

1.3.4 熒光拍照及數(shù)據(jù)采集

抗癌藥物處理至5 dpf時(shí)，每個(gè)實(shí)驗(yàn)組隨機(jī)選擇10尾斑馬魚(yú)在熒光顯微鏡下進(jìn)行觀察、拍照并保存圖片。利用尼康NIS-Elements D 3.10高級(jí)圖像處理軟件進(jìn)行圖像分析，計(jì)算癌細(xì)胞相對(duì)熒光強(qiáng)度總和(S)，定量評(píng)價(jià)各抗癌藥物對(duì)斑馬魚(yú)體內(nèi)腫瘤生長(zhǎng)的抑制作用。腫瘤抑制作用計(jì)算公式如下：

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用方差分析和Dunnett’st檢驗(yàn)，與模型對(duì)照組相比較P< 0.05為差異有顯著性。

表1 抗非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞藥敏試驗(yàn)組別和劑量(ng每尾斑馬魚(yú))

表2 抗胃癌SGC-7901細(xì)胞藥敏試驗(yàn)組別和劑量

表3 抗肝癌HepG2細(xì)胞藥敏試驗(yàn)組別和劑量

2 結(jié)果

2.1抗非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞的藥敏

抗非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞藥敏試驗(yàn)結(jié)果如表4和圖1所示。其中，抗肺癌A549細(xì)胞藥敏試驗(yàn)中，貝伐單抗在劑量為每尾斑馬魚(yú)100、200和400 ng時(shí)，腫瘤生長(zhǎng)抑制率分別為4%、57%和65%，與模型對(duì)照組比較分別為P> 0.5，P< 0.001和P< 0.001，當(dāng)貝伐單抗在劑量為每尾斑馬魚(yú)200和400 ng時(shí)對(duì)肺癌A549細(xì)胞有顯著的抑制作用。順鉑在劑量為每尾斑馬魚(yú)0.5、1和2 ng時(shí)，腫瘤生長(zhǎng)抑制率分別為34%、35%和55%，與模型對(duì)照組比較，均對(duì)肺癌A549細(xì)胞有顯著的抑制作用。恩度在劑量為每尾斑馬魚(yú)20、40和80 ng時(shí)，腫瘤生長(zhǎng)抑制率分別為11%、12%和39%，與模型對(duì)照組比較，當(dāng)在劑量為每尾斑馬魚(yú)80 ng時(shí)對(duì)肺癌A549細(xì)胞有顯著的抑制作用。紫杉醇在劑量為每尾斑馬魚(yú)0.86、1.71和2.56 ng時(shí)，腫瘤生長(zhǎng)抑制率分別為24%、25%和27%，與模型對(duì)照組比較，均對(duì)肺癌A549細(xì)胞有顯著的抑制作用。長(zhǎng)春瑞濱在劑量為每尾斑馬魚(yú)0.125、0.25和0.5 ng時(shí)，腫瘤生長(zhǎng)抑制率分別為28%、40%和40%，與模型對(duì)照組比較，均對(duì)肺癌A549細(xì)胞有顯著的抑制作用?？梢?jiàn)，抗肺癌A549藥效從高到低的藥物分別為貝伐單抗(65%)>順鉑(55%)>長(zhǎng)春瑞濱(40%)>恩度(39%)>紫杉醇(27%)。

2.2抗胃癌SGC-7901細(xì)胞的藥敏

抗胃癌SGC-7901細(xì)胞藥敏試驗(yàn)結(jié)果如表5和圖2所示。其中，抗胃癌SGC-7901細(xì)胞藥敏試驗(yàn)中，5-FU在濃度為65、130和260 μg/mL時(shí)，腫瘤生長(zhǎng)抑制率分別為31%、29%和29%，與模型對(duì)照組比較，均對(duì)胃癌SGC-7901細(xì)胞有顯著的抑制作用。羥基脲在濃度為250、500和1000 μg/mL時(shí)，腫瘤生長(zhǎng)抑制率分別為29%、31%和46%，與模型對(duì)照組比較，均對(duì)胃癌SGC-7901細(xì)胞有顯著的抑制作用。順鉑在劑量為每尾斑馬魚(yú)0.5、1和2 ng時(shí)，腫瘤生長(zhǎng)抑制率分別為5%、5%和24%，與模型對(duì)照組比較，當(dāng)順鉑在劑量為每尾斑馬魚(yú)2 ng時(shí)對(duì)胃癌SGC-7901細(xì)胞有顯著的抑制作用。伊立替康在劑量為每尾斑馬魚(yú)0.5、1和2 ng時(shí)，腫瘤生長(zhǎng)抑制率分別為4%、31%和30%，與模型對(duì)照組比較分別為P> 0.5，P< 0.001和P< 0.001，當(dāng)伊立替康在劑量為每尾斑馬魚(yú)1和2 ng時(shí)對(duì)胃癌SGC-7901細(xì)胞有顯著的抑制作用。紫杉醇在劑量為每尾斑馬魚(yú)0.86、1.71和2.56 ng時(shí)，腫瘤生長(zhǎng)抑制率分別為3%、25%和26%，與模型對(duì)照組比較分別為P> 0.5，P< 0.05和P< 0.05，當(dāng)紫杉醇在劑量為每尾斑馬魚(yú)1.71和2.56 ng時(shí)對(duì)胃癌SGC-7901細(xì)胞有顯著的抑制作用。

表4 藥物對(duì)斑馬魚(yú)非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞移植模型的腫瘤生長(zhǎng)抑制率(n=10)Tab.4 Tumor growth inhibition rates of tested drugs in the zebrafish xenotransplantation model of A549 non-small-cell lung cancer cells

注：與模型對(duì)照組相比，*P< 0.05，**P< 0.01，***P< 0.001。

Note. Compared with the model control group,*P< 0.05,**P< 0.01,***P< 0.001.

可見(jiàn)，抗胃癌SGC-7901藥效從高到低的藥物分別為羥基脲(46%)>5-FU(31%)=伊立替康(31%)>紫杉醇(26%)>順鉑(24%)。

2.3抗肝癌HepG2細(xì)胞的藥敏

抗肝癌HepG2細(xì)胞藥敏試驗(yàn)結(jié)果如表6和圖3所示。其中，抗肝癌HepG2細(xì)胞藥敏試驗(yàn)中，阿霉素在劑量為每尾斑馬魚(yú)0.5、1和2 ng時(shí)，腫瘤生長(zhǎng)抑制率分別為17%、42%和45%，與模型對(duì)照組比較分別為P> 0.5，P< 0.001和P< 0.001，當(dāng)阿霉素在劑量為每尾斑馬魚(yú)1和2 ng時(shí)對(duì)肝癌HepG2細(xì)胞有顯著的抑制作用。吉西他濱在劑量為每尾斑馬魚(yú)5、10和20 ng時(shí)，腫瘤生長(zhǎng)抑制率分別為46%、45%和46%，與模型對(duì)照組比較，均對(duì)肝癌HepG2細(xì)胞有顯著的抑制作用。羥基脲在濃度為125、250和500 μg/mL時(shí)，腫瘤生長(zhǎng)抑制率分別為33%、56%和40%，與模型對(duì)照組比較，均對(duì)肝癌HepG2細(xì)胞有顯著的抑制作用。順鉑在劑量為每尾斑馬魚(yú)0.5、1和2 ng時(shí)，腫瘤生長(zhǎng)抑制率分別為45%、50%和64%，與模型對(duì)照組比較，均對(duì)肝癌HepG2細(xì)胞有顯著的抑制作用。5-FU在濃度為65、130和260 μg/mL時(shí)，腫瘤生長(zhǎng)抑制率分別為15%、33%和38%，與模型對(duì)照組比較分別為P> 0.5，P< 0.01和P< 0.01，當(dāng)5-FU在濃度為130和260 μg/mL時(shí)對(duì)肝癌HepG2細(xì)胞有顯著的抑制作用?？梢?jiàn)，抗肝癌HepG2藥效從高到低的藥物分別為順鉑(64%)>羥基脲(56%)>吉西他濱(46%)>阿霉素(45%)> 5-FU(38%)。

注：圖中紅色為CM-Dil標(biāo)記的腫瘤細(xì)胞，紅色熒光越多，表示腫瘤細(xì)胞數(shù)量越多。A：貝伐單抗，從左到右分別為模型對(duì)照組，每尾斑馬魚(yú)100、200、400 ng劑量組；B：順鉑，從左到右分別為模型對(duì)照組，每尾斑馬魚(yú)0.5、1、2 ng劑量組；C：恩度，從左到右分別為模型對(duì)照組，每尾斑馬魚(yú)20、40、80 ng劑量組；D：紫杉醇，從左到右分別為模型對(duì)照組，每尾斑馬魚(yú)0.86、1.71、2.56 ng劑量組；E：長(zhǎng)春瑞濱，從左到右分別為模型對(duì)照組，每尾斑馬魚(yú)0.125、0.25、0.5 ng劑量組。圖1 藥物對(duì)斑馬魚(yú)非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞移植模型腫瘤生長(zhǎng)抑制現(xiàn)象的顯微熒光圖像Note. Red fluorescence indicates the CM-Dil labeled tumor cells. The more red fluorescence, the more tumor cells. A: Bevacizumab, from left to right: model control group, 100, 200 and 400 ng per fish; B: cis-Platinum, from left to right: model control, 0.5, 1 and 2 ng per fish; C: Endostar, from left to right: model control, 20, 40 and 80 ng per fish; D: Paclitaxel, from left to right: model control, 0.86, 1.71 and 2.56 ng per fish; E: Vinorelbine, from left to right: model control, 0.125, 0.25 and 0.5 ng per fish.Fig.1 Fluorescence microscopic images showing the inhibition of tumor growth induced by different drugs in zebrafish xenotransplantation models of A549 non-small-cell lung cancer cells

注：圖中紅色為CM-Dil標(biāo)記的腫瘤細(xì)胞，紅色熒光越多，表示腫瘤細(xì)胞數(shù)量越多。A：5-FU，從左到右分別為模型對(duì)照組，65、130、260 μg/mL濃度組(每尾斑馬魚(yú)10 nL)；B：羥基脲，從左到右分別為模型對(duì)照組，250、500、1000 μg/mL濃度組(每尾斑馬魚(yú)10 nL)；C：順鉑，從左到右分別為模型對(duì)照組，每尾斑馬魚(yú)0.5、1、2 ng劑量組；D：伊立替康，從左到右分別為模型對(duì)照組，每尾斑馬魚(yú)0.5、1、2 ng劑量組；E：紫杉醇，從左到右分別為模型對(duì)照組，每尾斑馬魚(yú)0.86、1.71、2.56 ng劑量組。圖2 藥物對(duì)斑馬魚(yú)胃癌SGC-7901細(xì)胞移植模型腫瘤生長(zhǎng)抑制現(xiàn)象的顯微熒光圖像Note. Red fluorescence indicates the CM-Dil labeled tumor cells. The more red fluorescence, the more tumor cells. A: 5-FU, from left to right: model control group, 65, 130 and 260 μg/mL (10 nL per fish); B: Hydroxyurea, from left to right: model control, 250, 500 and 1000 μg/mL (10 nL per fish); C: cis-Platinum, from left to right: model control, 0.5, 1 and 2 ng per fish; D: Irinotecan, from left to right: model control, 0.5, 1 and 2 ng per fish; E: Paclitaxel, from left to right: model control, 0.86, 1.71 and 2.56 ng per fish.Fig.2 Fluorescence microscopic image showing the inhibitory effect of drugs on tumor growth in the zebrafish xenotransplantation model of SGC-7901 stomach cancer cells

藥物Drugs劑量或濃度Doseorconcentration腫瘤生長(zhǎng)抑制率(%)Tumorgrowthinhibitionrates模型對(duì)照Modelcontrol—05-氟尿嘧啶5-FU65μg/mL31***130μg/mL29***260μg/mL29***羥基脲Hydroxyurea250μg/mL29**500μg/mL31**1000μg/mL46***順鉑cis-Platinum0.5ngperfish51ngperfish52ngperfish24*伊立替康Irinotecan0.5ngperfish41ngperfish31***2ngperfish30***紫杉醇Paclitaxel0.86ngperfish31.71ngperfish25*2.56ngperfish26*

注：與模型對(duì)照組相比，*P< 0.05，**P< 0.01，***P< 0.001。

Note. Compared with the model control group,*P< 0.05,**P< 0.01,***P< 0.001.

表6 藥物對(duì)斑馬魚(yú)肝癌HepG2細(xì)胞移植模型的腫瘤生長(zhǎng)抑制率(n=10)Tab.6 Tumor growth inhibition rates of different drugs in the zebrafish xenotransplantation model of HepG2 liver cancer cells

注：與模型對(duì)照組相比，**P< 0.01，***P< 0.001。

Note. Compared with the model control group,**P< 0.01,***P< 0.001.

注：圖中紅色為CM-Dil標(biāo)記的腫瘤細(xì)胞，紅色熒光越多，表示腫瘤細(xì)胞數(shù)量越多。A：阿霉素，從左到右分別為模型對(duì)照組，每尾斑馬魚(yú)0.5、1、2.5 ng劑量組；B：吉西他濱，從左到右分別為模型對(duì)照組，每尾斑馬魚(yú)5、10、20 ng劑量組；C：羥基脲，從左到右分別為模型對(duì)照組，125、250、500 μg/mL濃度組(每尾斑馬魚(yú)10 nL)；D：順鉑，從左到右分別為模型對(duì)照組，每尾斑馬魚(yú)0.5、1、2 ng劑量組；E：5-FU，從左到右分別為模型對(duì)照組，65、130、260 μg/mL濃度組(每尾斑馬魚(yú)10 nL)。圖3 藥物對(duì)斑馬魚(yú)肝癌HepG2細(xì)胞移植模型腫瘤生長(zhǎng)抑制現(xiàn)象的顯微熒光圖像Note. Red fluorescence indicates the CM-Dil labeled tumor cells. The more red fluorescence, the more tumor cells. A: Adriamycin, from left to right: model control group, 0.5, 1 and 2.5 ng per fish; B: Gemcitabine, from left to right: model control, 5, 10 and 20 ng per fish; C: Hydroxyurea, from left to right: model control, 125, 250 and 500 μg/mL (10 nL per fish); D: cis-Platinum, from left to right: model control, 0.5, 1 and 2 ng per fish; E: 5-FU, from left to right: model control, 65, 130 and 260 μg/mL (10 nL per fish).Fig.3 Fluorescence microscopic images showing the inhibition of tumor growth induced by different drugs in the zebrafish xenotransplantation model of the HepG2 liver cancer cells

3 討論

抗癌藥敏感性評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)包括體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和動(dòng)物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)。體外抗癌實(shí)驗(yàn)缺乏體內(nèi)吸收、分布、代謝、排泄等過(guò)程，易產(chǎn)生假陽(yáng)性結(jié)果。體內(nèi)主要以小鼠為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，評(píng)價(jià)藥物的體內(nèi)抗癌活性[23, 24]，然而小鼠作為腫瘤移植的載體，也有其固有的缺陷，如需要免疫抑制品系的特殊小鼠、所需移植的腫瘤細(xì)胞數(shù)量要求多、實(shí)驗(yàn)造模周期長(zhǎng)、需要不斷的傳代以滿足實(shí)驗(yàn)樣本數(shù)量的需求、無(wú)法對(duì)腫瘤進(jìn)展情況進(jìn)行成像顯示等[25]。斑馬魚(yú)腫瘤異種移植模型本身具有極大的優(yōu)勢(shì)且克服了小鼠的許多不足之處[26, 27]：斑馬魚(yú)與人類基因的同源性高達(dá)85%，且許多有關(guān)腫瘤的信號(hào)通路都與人類相似，并且與人類一樣，其自身也能夠自發(fā)得癌[28]；斑馬魚(yú)幼魚(yú)階段適應(yīng)性免疫功能不全，易于腫瘤異種移植[29]；斑馬魚(yú)幼魚(yú)個(gè)體小，通體透明，能夠方便地對(duì)體內(nèi)腫瘤細(xì)胞進(jìn)行顯微鏡觀察和拍照等。

本研究選取三類人群中常見(jiàn)的腫瘤類型作為測(cè)試疾病對(duì)象，以臨床上每類腫瘤對(duì)應(yīng)的常規(guī)化療藥物作為測(cè)試的藥物對(duì)象，以斑馬魚(yú)腫瘤異種移植模型作為檢測(cè)的生物模型，目的在于評(píng)價(jià)斑馬魚(yú)腫瘤異種移植模型是否能夠準(zhǔn)確評(píng)價(jià)抗癌藥物的藥敏性。本研究結(jié)果證實(shí)，在臨床上效果顯著的抗非小細(xì)胞肺癌藥物、抗胃癌藥物、抗肝癌藥物，在斑馬魚(yú)腫瘤異種模型上同樣能體現(xiàn)出其抑制癌細(xì)胞生長(zhǎng)的效果，且明顯具有劑量依賴效應(yīng)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果也表明，在斑馬魚(yú)腫瘤異種移植模型中，就抗腫瘤藥物對(duì)特定腫瘤的治療效果來(lái)看，各類抗腫瘤藥物的抗腫瘤效果是有優(yōu)劣之分的。比如，在本實(shí)驗(yàn)研究中發(fā)現(xiàn)，順鉑的抗小細(xì)胞肺癌和肝癌效果優(yōu)于其他大多數(shù)抗癌藥的；而順鉑的抗抗胃癌效果相對(duì)于其他抗癌藥是比較弱的；又如5-FU在抗胃癌方面是優(yōu)于其他多數(shù)抗癌藥的，而在抗肝癌的方面的療效是弱于其他抗癌藥的。

對(duì)于理化性質(zhì)和作用機(jī)制各異的抗癌藥物，本實(shí)驗(yàn)根據(jù)臨床上的服用方式，相應(yīng)地給予斑馬魚(yú)口服(水溶)給藥或者靜脈注射給藥。結(jié)果證實(shí)，這些藥物在斑馬魚(yú)體內(nèi)不僅都體現(xiàn)出了良好的抗腫瘤效果，而且結(jié)果與臨床用藥基本一致。這提示我們，斑馬魚(yú)腫瘤異種移植模型是一類可靠的、靈敏的、能夠在體內(nèi)測(cè)定藥物抗癌效用的動(dòng)物模型。基于斑馬魚(yú)自身的物理特性優(yōu)勢(shì)及對(duì)抗腫瘤藥物的藥敏性，斑馬魚(yú)腫瘤異種移植模型是一類非常有應(yīng)用前景的抗腫瘤動(dòng)物模型，我們預(yù)測(cè)未來(lái)該模型將會(huì)在抗腫瘤藥物的新藥研發(fā)、老藥再評(píng)價(jià)、藥物聯(lián)用組方篩選、耐藥測(cè)試乃至人源的腫瘤移植-精準(zhǔn)醫(yī)療中獲得更加廣泛的應(yīng)用。

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Applicationsofzebrafishxenotransplantationmodelsforinvivoevaluationofanticancerdrugsensitivitytest

LAO Qiao-cong1,2， XU Yi-qiao1， JIN Fan-mao1， CHEN Jia-sheng1， TANG Min-jia1， XU Lei1， ZHU Xiao-yu1,2， Zheng Gao-li3， Xuan Yao-xian3， LI Chun-qi1,2 *

(1.Hangzhou Hunter Biotechnology, Inc, Hangzhou 310012, China； 2.Early Evaluation Base of Zhejiang Key Laboratory of Safety Evaluation Technology for Human-Used Items, Hangzhou 310012； 3.Center of Safety Evaluation, Zhejiang Academy of Medical Sciences, Hangzhou 310013)

ObjectiveTo evaluate the sensitivity to 5 clinically commonly used anticancer drugsinvivousing the zebrafish xenotransplantation models of human lung cancer, stomach cancer, and liver cancer cells, respectively.MethodsZebrafish xenotransplantation models of A549 lung cancer cells, SGC-7901 stomach cancer cells and HepG2 liver cancer cells were established. The xenograft models of A549 cells were treated with three different doses ofcis-platinum, paclitaxel, vinorelbine, endostar and bevacizumab, respectively. The SGC-7901 model was treated with three concentrations or doses of paclitaxel, irinotecan, hydroxyurea,cis-platinum and 5-fluorouracil, respectively. And the HepG2 model was treated with three concentrations or doses of adriamycin, gemcitabine, hydroxyurea,cis-platinum and 5-fluorouracil. The tumors were analyzed and quantifiedinvivoby fluorescence microscopy, and the inhibition rates of tumor growth with each drug were calculated and compared with the model control group for statistical significance.ResultsAll of the tested anticancer drugs showed inhibitory effect on tumor cells in the zebrafish xenograft models with statistical significance in a dose-dependent manner. During the drug sensitivity test, the inhibition rate of bevacizumab on A549 lung cancer cells decreased in the order (65%) >cis-platinum (55%) > vinorelbine (40%) > endostar (39%) > paclitaxel (27%). As for the SGC-7901 stomach cancer cells, the tumor growth inhibition rate decreased in the order hydroxyurea (46%) > 5-FU (31%)=irinotecan (31%) > paclitaxel (26%) >cis-platinum (24%). And the therapeutic effect ofcis-platinum on the HepG2 liver cancer cells decreased in the order (64%) > hydroxyurea (56%) > gemcitabine (46%) > adriamycin (45%) > 5-FU (38%).ConclusionsZebrafish xenotransplantation models of cancer cells are suitable forinvivosensitivity test of anticancer drugs.

Zebrafish; Tumor xenotransplantation; Anticancer drugs;invivodrug sensitivity test; Pharmacodynamics

浙江省科技重大專項(xiàng)(編號(hào)：2014C03009)。

勞喬聰(1983 -)，男，碩士，研究方向：藥理毒理學(xué)研究。E-mail: lqc@zhunter.com

李春?jiǎn)?1963 -)，男，博士，教授，研究方向：藥理毒理學(xué)研究。E-mail: jackli@zhunter.com

R-33

A

1671-7856(2017) 11-0024-08

10.3969.j.issn.1671-7856. 2017.11.006

2017-03-27